雙功能適配體檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能夠同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法。這種雙功能適配體檢測(cè)方法，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時(shí)存在的情況下，會(huì)由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端的胸腺嘧啶的錯(cuò)配和胞嘧啶的錯(cuò)配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴(kuò)增，被第一DNA切割酶的切割形成的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導(dǎo)致第一探針序列和第二探針序列分別被第二DNA切割酶和第三DNA切割酶切割，最終第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)被暴露出來，通過熒光檢測(cè)同時(shí)對(duì)在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進(jìn)行檢測(cè)。
【專利說明】雙功能適配體檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境分析和食品安全領(lǐng)域，特別是涉及一種能夠同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]汞和銀是兩種很常見的重金屬，被廣泛應(yīng)用于制藥，電池和攝影工業(yè)等領(lǐng)域。但當(dāng)這些產(chǎn)品的副產(chǎn)物或在使用廢棄后，部分重金屬最終將以離子形式進(jìn)入環(huán)境，對(duì)水體和土壤造成了嚴(yán)重的污染。汞離子對(duì)動(dòng)植物和人體健康都有很大的影響，長期暴露在含汞離子的環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及其它器官的永久性的傷害。銀離子的直接毒性相對(duì)較小，但它能夠在水生生物中產(chǎn)生很強(qiáng)的富集作用，從而通過食物鏈的方式進(jìn)入人體內(nèi)，使之成為具有高危害的重金屬元素之一。
[0003]現(xiàn)有的Hg2+和Ag+檢測(cè)技術(shù)包括原子吸收光譜，ICP-MS，有機(jī)熒光分子和適配體法等。其中，原子吸收光譜法是傳統(tǒng)的分析方法，測(cè)試時(shí)將樣品通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ芙?，使所含的汞全部轉(zhuǎn)化為Hg2+，然后用還原劑將Hg2+還原成汞蒸氣，導(dǎo)入測(cè)汞儀中進(jìn)行測(cè)定；ICP-MS法的樣品前處理過程與原子吸收光譜類似，首先需要將樣品中的汞溶解以轉(zhuǎn)化成離子狀態(tài)，經(jīng)過消解作用后，將樣品注入進(jìn)質(zhì)譜儀中進(jìn)行測(cè)定；有機(jī)熒光分子法是通過化學(xué)合成的方法產(chǎn)生一種特殊基團(tuán)，此基團(tuán)能夠特異性地與重金屬離子發(fā)生反應(yīng)，從而造成結(jié)構(gòu)上的改變而增強(qiáng)或淬滅熒光，最后利用熒光強(qiáng)度的變化達(dá)到檢測(cè)的目的。適配體法是近年發(fā)展了一種新方法，具有高靈敏度和特異性，其主要是利用胸腺嘧啶(T)與胞嘧啶(C)分別與Hg2+和Ag+形成兩種特殊的配對(duì)結(jié)構(gòu)，即T-Hg2+-T與C-Ag+-C,從而設(shè)計(jì)出相應(yīng)的生物傳感器來進(jìn)行分析重金屬離子。
[0004]適配體法以其靈敏度和特異性受到很多關(guān)注，通過復(fù)合結(jié)構(gòu)發(fā)展了多種金屬離子的分析方法，如熒光，電化學(xué)，比色和拉曼法等。但這些方法只能局限于檢測(cè)一種金屬離子(Hg2+或Ag+)，不能同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子的檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于此，有必要提供一種能夠同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法。
[0006]一種雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，用于同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)，包括: [0007]第一模版DNA和第二模版DNA，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補(bǔ)配對(duì)的15個(gè)堿基，并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個(gè)堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配，所述胸腺嘧啶的錯(cuò)配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的所述第一模版DNA的3’末端能夠以所述第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增，所述胞嘧啶的錯(cuò)配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的所述第二模版DNA的3’末端能夠以所述第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增；
[0008]DNA聚合酶和第一 DNA切割酶，所述第一 DNA切割酶可以對(duì)擴(kuò)增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還可以對(duì)擴(kuò)增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第二寡核苷酸；
[0009]第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針，所述第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第一探針序列和結(jié)合在所述第一探針序列上的第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第二探針序列和結(jié)合在所述第二探針序列上的第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第一熒光團(tuán)和所述第二熒光團(tuán)不同；
[0010]第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶和dNTPs，所述第二 DNA切割酶可以對(duì)雜交后的所述第一探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)分離，所述第三DNA切割酶可以對(duì)雜交后的所述第二探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)分離。
[0011 ] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
[0012]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
[0013]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一熒光團(tuán)為羧基熒光素，所述第二熒光團(tuán)為四甲基羅丹明。
[0014]在一個(gè)實(shí)施例中，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI，所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
[0015]一種雙功能適配體檢測(cè)方法，用于同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)，包括如下步驟:
[0016]將待測(cè)樣品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后發(fā)生雜交反應(yīng)得到雜交液，其中，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補(bǔ)配對(duì)的15個(gè)堿基,并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個(gè)堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配；
[0017]向所述雜交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶發(fā)生寡核苷酸鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，得到寡核苷酸擴(kuò)增液，其中，胸腺嘧啶的錯(cuò)配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增，胞嘧啶的錯(cuò)配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增，所述第一 DNA切割酶對(duì)擴(kuò)增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的·互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還對(duì)擴(kuò)增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第二寡核苷酸；
[0018]向所述寡核苷酸擴(kuò)增液中加入第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發(fā)生雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)，得到熒光檢測(cè)液，其中，所述第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第一探針序列和結(jié)合在所述第一探針序列上的第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第二探針序列和結(jié)合在所述第二探針序列上的第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第一熒光團(tuán)和所述第二熒光團(tuán)不同，所述第二 DNA切割酶對(duì)雜交后的所述第一探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)分離，所述第三DNA切割酶對(duì)雜交后的所述第二探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)分離；
[0019]對(duì)所述熒光檢測(cè)液進(jìn)行熒光檢測(cè)，完成所述雙功能適配體檢測(cè)方法。
[0020]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
[0021]在一個(gè)實(shí)施例中，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
[0022]在一個(gè)實(shí)施例中，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI，所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
[0023]在一個(gè)實(shí)施例中，向所述寡核苷酸擴(kuò)增液中加入第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發(fā)生雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)的操作中，還需要向其中加入牛血清白蛋白。
[0024]這種雙功能適配體檢測(cè)方法，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時(shí)存在的情況下，會(huì)由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴(kuò)增，接著通過第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導(dǎo)致第一探針序列和第二探`針序列分別被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最終第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)被暴露出來，通過檢測(cè)熒光檢測(cè)液的熒光，可以同時(shí)對(duì)在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進(jìn)行檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為一實(shí)施方式的雙功能適配體檢測(cè)方法的原理圖；
[0026]圖2為如圖1所示的雙功能適配體檢測(cè)方法的流程圖；
[0027]圖3為寡核苷酸鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)得到的寡核苷酸擴(kuò)增液的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果圖；
[0028]圖4A為不同濃度Hg2+的熒光光譜曲線；
[0029]圖4B為如圖4A所示的熒光光譜曲線以520nm處的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，Hg2+濃度的對(duì)數(shù)值的橫坐標(biāo)擬合曲線；
[0030]圖5A為不同濃度Ag+的熒光光譜曲線；
[0031]圖5B為如圖5A所示的熒光光譜曲線以582nm處的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，Ag+濃度的對(duì)數(shù)值的橫坐標(biāo)擬合曲線；[0032]圖6為雙功能適配體檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)的熒光分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
[0034]一實(shí)施方式的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，用于同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)，包括:
[0035]第一模版DNA、第二模版DNA、DNA聚合酶、第一 DNA切割酶、第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶、dNTPs、第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針。
[0036]第一模版DNA中含有與第二模版DNA互補(bǔ)配對(duì)的15個(gè)堿基,并且第一模版DNA和第二模版DNA通過該15個(gè)堿基形成雜交后第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶(T)的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶(C)的錯(cuò)配。
[0037]胸腺嘧啶(T)的錯(cuò)配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端能夠以第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。當(dāng)Hg2+不存在時(shí)，由于3個(gè)胸腺嘧啶(T)的錯(cuò)配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端不能夠以第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。
[0038]胞嘧啶(C)的錯(cuò)配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端能夠以第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。當(dāng)Ag+不存在時(shí)，由于3個(gè)胞嘧啶(C)的錯(cuò)配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端不能夠以第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。
[0039]第一 DNA切割酶可以對(duì)擴(kuò)增出來的第一模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第一寡核苷酸，并且第一 DNA切割酶還可以對(duì)擴(kuò)增出來的第二模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第二寡核苷酸。
[0040]第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第一探針序列和結(jié)合在第一探針序列上的第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)，第一探針序列可以與第一寡核苷酸雜交，第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)。
[0041]第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第二探針序列和結(jié)合在第二探針序列上的第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)，第二探針序列可以與第二寡核苷酸雜交，第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)。
[0042]本實(shí)施方式中，第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針由探針合成公司“寶生物工程(大連)”制作。
[0043]本實(shí)施方式中，第一熒光團(tuán)為FAM (羧基熒光素)，第二熒光團(tuán)為TAMRA (四甲基羅丹明X 第一淬滅團(tuán)為 EclipseCEclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.),第二淬滅團(tuán)為 Eclipse (Eclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.X
[0044]本實(shí)施方式中，第一突光團(tuán)和第二突光團(tuán)不同。
[0045]第二 DNA切割酶識(shí)別雙鏈DNA，可以對(duì)雜交后的第一探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后第一突光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)分離，從而第一突光團(tuán)活化可以發(fā)出突光。[0046]第三DNA切割酶識(shí)別雙鏈DNA，可以對(duì)雜交后的第二探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)分離，從而第二熒光團(tuán)活化可以發(fā)出熒光。
[0047]這種雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時(shí)存在的情況下，會(huì)由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴(kuò)增，接著通過第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導(dǎo)致第一探針序列和第二探針序列分別被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最終第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)被暴露出來，通過熒光檢測(cè)，可以同時(shí)對(duì)在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進(jìn)行檢測(cè)。
[0048]本實(shí)施方式中，第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ IDN0.2所示的序列。
[0049]本實(shí)施方式中，第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二探針序列為SEQ IDN0.4所示的序列。
[0050]DNA聚合酶可以為DNA聚合酶Klenow fragment，第一 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶可以為DNA切割酶 Nt.AlwI。
[0051]下面結(jié)合圖1和圖2，提供一實(shí)施方式的采用上述雙功能適配體檢測(cè)試劑盒的一種雙功能適配體檢測(cè)方法，用于同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)，包括如下步驟:
[0052]S10、將待測(cè)樣品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后發(fā)生雜交反應(yīng)得到雜交液。
[0053]SlO中使用的緩沖液為第一反應(yīng)緩沖液，其中，IOX第一反應(yīng)緩沖液(0.2摩爾每升的三氨基甲烷醋酸，PH7.9,0.1摩爾每升的醋酸鎂，0.5摩爾每升的醋酸鉀，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)。`
[0054]第一模版DNA中含有與第二模版DNA互補(bǔ)配對(duì)的15個(gè)堿基,并且第一模版DNA和第二模版DNA通過15個(gè)堿基形成雜交后第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配。
[0055]本實(shí)施方式中，第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ IDN0.2所示的序列。
[0056]S20、向SlO得到的雜交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶發(fā)生寡核苷酸鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，得到含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的寡核苷酸擴(kuò)增液。
[0057]胸腺嘧啶(T)的錯(cuò)配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。當(dāng)Hg2+不存在時(shí)，由于3個(gè)胸腺嘧啶(T)的錯(cuò)配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端不能夠以第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。
[0058]胞嘧啶(C)的錯(cuò)配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。當(dāng)Ag+不存在時(shí)，由于3個(gè)胞嘧啶(C)的錯(cuò)配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端不能夠以第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增。
[0059]第一 DNA切割酶對(duì)擴(kuò)增出來的第一模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第一寡核苷酸，并且第一 DNA切割酶還對(duì)擴(kuò)增出來的第二模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第二寡核苷酸。
[0060]S30、向S20得到的寡核苷酸擴(kuò)增液中加入第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發(fā)生雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)，得到熒光檢測(cè)液。
[0061]S30中使用的緩沖液為第二反應(yīng)緩沖液，其中，IOX第二反應(yīng)緩沖液(0.1摩爾每升的三氨基甲烷鹽酸，PH7.9,0.1摩爾每升的氯化鎂，0.5摩爾每升的氯化鈉，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)。
[0062]一般而言，S30中進(jìn)行雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，還需要加入牛血清白蛋白。
[0063]牛血清白蛋白的作用是為了輔助第二 DNA切割酶。
[0064]第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第一探針序列和結(jié)合在第一探針序列上的第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)，第一探針序列可以與第一寡核苷酸雜交，第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)。
[0065]第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第二探針序列和結(jié)合在第二探針序列上的第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)，第二探針序列可以與第二寡核苷酸雜交 ，第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)。
[0066]本實(shí)施方式中，第一突光團(tuán)和第二突光團(tuán)不同。
[0067]本實(shí)施方式中，第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針由探針合成公司“寶生物工程(大連)”制作。
[0068]本實(shí)施方式中，第一熒光團(tuán)為FAM (羧基熒光素)，第二熒光團(tuán)為TAMRA (四甲基羅丹明X 第一淬滅團(tuán)為 EclipseCEclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.),第二淬滅團(tuán)為 Eclipse (Eclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.X
[0069]第二 DNA切割酶識(shí)別雙鏈DNA，可以對(duì)雜交后的第一探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后第一突光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)分離，從而第一突光團(tuán)活化可以發(fā)出突光。
[0070]第三DNA切割酶識(shí)別雙鏈DNA，可以對(duì)雜交后的第二探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)分離，從而第二熒光團(tuán)活化可以發(fā)出熒光。
[0071]本實(shí)施方式中，第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二探針序列為SEQ IDN0.4所示的序列。
[0072]DNA聚合酶可以為DNA聚合酶Klenow fragment，第一 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶可以為DNA切割酶 Nt.AlwI。
[0073]S40、對(duì)S30得到的熒光檢測(cè)液進(jìn)行熒光檢測(cè)，完成雙功能適配體檢測(cè)方法。
[0074]由于第一突光團(tuán)和第二突光團(tuán)不同，第一突光團(tuán)和第二突光團(tuán)活化后發(fā)出的突光也不同。
[0075]通過對(duì)熒光檢測(cè)液進(jìn)行熒光檢測(cè)，分析具體檢測(cè)得到的熒光波長和熒光強(qiáng)度，可以對(duì)Hg2+和Ag+兩種金屬離子進(jìn)行定性和定量分析。
[0076]這種雙功能適配體檢測(cè)方法，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時(shí)存在的情況下，會(huì)由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結(jié)構(gòu)的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴(kuò)增，接著通過第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導(dǎo)致第一探針序列和第二探針序列分別被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最終第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)被暴露出來，通過檢測(cè)熒光檢測(cè)液的熒光，可以同時(shí)對(duì)在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進(jìn)行檢測(cè)。
[0077]這種雙功能適配體檢測(cè)方法還具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0078]擴(kuò)增效率高，通過將兩步雙功能擴(kuò)增方式串聯(lián)起來，大大提高了擴(kuò)增效率，極大地提聞了檢測(cè)靈敏度；
[0079]特異性強(qiáng)，通過T-Hg2+-T與C-Ag+-C結(jié)構(gòu)，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性；
[0080]適用于實(shí)際樣品檢測(cè)，在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)不需要復(fù)雜的前處理步驟，而且在自來水樣檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)任何的基質(zhì)干擾效應(yīng)，在實(shí)測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。
[0081]下面為具體實(shí)施例。實(shí)施例中第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列，第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二探針序列為SEQ ID N0.4所不的序列，DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI，第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針由探針合成公司“寶生物工程(大連)”制作，第一熒光團(tuán)為FAM，第二熒光團(tuán)為TAMRA。第一淬滅團(tuán)為Eclipse，第二淬滅團(tuán)為Eclipse。
[0082]實(shí)施例1
[0083]試劑準(zhǔn)備:分別準(zhǔn)備以下濃度的試劑:1微摩爾每升的第一模版DNA，I微摩爾每升的第二模版DNA，2.5毫摩爾每升的dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)，IOX第一反應(yīng)緩沖液(0.2摩爾每升的三氨基甲烷醋酸，pH7.9，0.1摩爾每升的醋酸鎂，0.5摩爾每升的醋酸鉀，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)，IOX反應(yīng)緩沖液2 (0.1摩爾每升的三氨基甲烷鹽酸，PH7.9,0.1摩爾每升的氯化鎂，0.5摩爾每升的氯化鈉，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)，10單位每微升的DNA切割酶Nb.BbvC1、Nb.BtsI和Nt.AlwI，5單位每微升DNA聚合酶Klenowfragment (3，-5’ exo_), 100XBSA(牛血清蛋白，10mg/mL), 100微摩爾每升的第一突光團(tuán)淬滅團(tuán)探針(QF probe-Ι)和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針(QF probe-2)，無菌水以及不同濃度的汞離子和銀離子。
[0084]雙功能擴(kuò)增反應(yīng):將反應(yīng)溶液分為A液、B液、C液和D液，總體積為50微升。其中A液包含0.25微升第一模版DNA、0.25微升第二模版DNA、I微升dNTPs(四種脫氧核糖核苷酸的混合物)、1微升IOX第一反應(yīng)緩沖液、I微升目標(biāo)金屬離子(Hg2+或Ag+)和6微升無菌水；B液包含0.3 微升DNA切割酶Nb.BbvCI>0.2 微升DNA聚合酶Klenow fragment (3’-5’exo_)；C液包含0.125微升QF probe-Ι和0.3微升QF probe-2,5微升IOX第二反應(yīng)緩沖液、33.875微升(或33.7微升)的無菌水；D液包含0.5微升DNA切割酶Nb.BtsI和I微升DNA切割酶Nt.AlwI以及0.5微升BSA (牛血清蛋白，10mg/mL)。A液首先在95°C下孵育3分鐘，然后冷卻至37°C，再加入B液，使二者在37°C下反應(yīng)60分鐘，再與C液混合后于37°C下反應(yīng)15分鐘，接著加入D液在37°C下反應(yīng)45分鐘，最后可通過熒光儀收集信號(hào)。
[0085]擴(kuò)增原理結(jié)合圖1:第一步是第一模版DNA和第二模版DNA發(fā)生雜交反應(yīng)，兩者之間有15個(gè)堿基互補(bǔ)，但是在3端處各有三個(gè)堿基錯(cuò)配，分別是三個(gè)胸腺嘧啶和三個(gè)胞嘧啶。第二步是寡核苷酸鏈置換·擴(kuò)增反應(yīng)，當(dāng)加入Hg2+和Ag+時(shí)，模板鏈3端的錯(cuò)配堿基發(fā)生結(jié)合，形成T-Hg2+-T與C-Ag+-C的復(fù)合結(jié)構(gòu)，這就為擴(kuò)增反應(yīng)提供了條件。如果不存在Hg2+和Ag+，則會(huì)由于3端的錯(cuò)配導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)不能啟動(dòng)。此后，在DNA聚合酶Klenowfragment (3’ -5’ exo_)和dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)的作用下，以第一模版DNA和第二模版DNA為擴(kuò)增模板進(jìn)行延伸，從而形成完整的雙鏈結(jié)構(gòu)。隨后DNA切割酶Nb.BbvCI識(shí)別雙鏈結(jié)構(gòu)的切刻酶識(shí)別位點(diǎn)(該切刻酶僅識(shí)別雙鏈結(jié)構(gòu))，并在該位點(diǎn)的下游第2個(gè)堿基處對(duì)新合成鏈進(jìn)行切刻，這就產(chǎn)生了新的聚合酶復(fù)制位點(diǎn)。該位點(diǎn)可由聚合酶Klenow fragment (3? -5’ exo_)再次延伸，同時(shí)其鏈置換活力可將切刻后的下游寡核苷酸片段置換出來，而再次延伸后的序列又可被切刻酶Nb.BbvCI切刻，繼而再被聚合酶Klenowfragment (3’ -5’ exo_)延伸，這種反復(fù)的延伸和切刻循環(huán)即構(gòu)成了鏈置換擴(kuò)增反應(yīng),它能夠擴(kuò)增產(chǎn)生大量的短的寡核苷酸片段。而且，此種雙功能模板能夠同時(shí)產(chǎn)生兩種不同序列的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。第三步是雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生的寡核苷酸片段可分別同QF probe-Ι和QF probe-2探針 雜交結(jié)合。由于形成的雙鏈含有相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)，能夠分別被切刻酶Nb.BtsI和Nt.AlwI切割，導(dǎo)致QF probe-Ι和QF probe-2探針被切割成兩段，使得熒光團(tuán)與淬滅團(tuán)發(fā)生分離，從而產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號(hào)。此時(shí)寡核苷酸片段又能從雙鏈結(jié)構(gòu)中分離出來，與新的未被切斷的QF probe探針結(jié)合,這樣就形成了一個(gè)切割-分離-雜交的循環(huán)中，熒光信號(hào)得到很大程度的增強(qiáng)。而且QF probe-Ι和QF ριχΛθ_2探針具有不同的熒光團(tuán)，所以能夠產(chǎn)生不同發(fā)射波長的熒光，進(jìn)而達(dá)到雙功能熒光擴(kuò)增的目的。
[0086]實(shí)施例2
[0087]寡核苷酸鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).。
[0088]采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析對(duì)寡核苷酸鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0089]其結(jié)果如圖3所示，在不存在Hg2+和Ag+的情況下，即對(duì)照管電泳道(control道)未發(fā)現(xiàn)任何擴(kuò)增的條帶；在僅存在Hg2+或Ag+的情況下，在其電泳道的20bp往下處能夠發(fā)現(xiàn)明顯的寡核苷酸目標(biāo)條帶，這說明鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)。在同時(shí)存在Hg2+和Ag+的情況下，寡核苷酸目標(biāo)條帶也能夠明顯的被觀察到，而且其條帶明顯比單獨(dú)存在一種金屬離子時(shí)要亮，這說明在兩種金屬離子同時(shí)存在下時(shí)，成功擴(kuò)增出兩種不同的寡核苷酸?？傊?，整個(gè)雙功能鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)能夠很好地區(qū)分目標(biāo)信號(hào)與對(duì)照信號(hào)，可行性非常好。
[0090]靈敏度實(shí)驗(yàn)。
[0091]通過不同濃度的Hg2+和Ag+進(jìn)行了檢測(cè)分析，驗(yàn)證測(cè)試方法的靈敏度，結(jié)果如圖4A、圖4B、圖5A和圖5B所示。圖4A顯示了不同濃度Hg2+的熒光光譜曲線，表明該技術(shù)方案對(duì)不同濃度的Hg2+具有很好的區(qū)分度。為了評(píng)估其定量分析能力，我們采用520nm處的熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)，Hg2+濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)擬合曲線，得到圖4B。圖4B呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性方程為F=-43.32+110.881og10C (相關(guān)系數(shù)為0.9958)，經(jīng)過計(jì)算，該技術(shù)方案的檢測(cè)限可達(dá)到1.93皮摩爾每升。
[0092]圖5A顯示的是不同濃度Ag+的熒光光譜曲線，從圖中可以看出不同濃度下的熒光曲線具有很明顯的區(qū)分度。為了定量分析研究，我們采用582nm處的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，Ag+濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)擬合曲線，得到圖5B。圖5B表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性方程為F=-63.56+91.331og10C (相關(guān)系數(shù)為0.9967)，經(jīng)過計(jì)算，該技術(shù)方案的檢測(cè)限可達(dá)到15.80
皮摩爾每升。
[0093]因此這種測(cè)試方法在Hg2+和Ag+方面都具有很高的檢測(cè)靈敏度。[0094]特異性實(shí)驗(yàn)和實(shí)際水樣分析。
[0095]為了評(píng)估Hg2+和Ag+的特異性，選用了 7種其他金屬離子(Cu2+，Ca2+，Cd2+，F(xiàn)e3+，Pb2+，Mn2+，Zn2+)進(jìn)行了檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。
[0096]由圖6可以看出，在Hg2+和Ag+處具有強(qiáng)的熒光信號(hào)，而另外七種金屬離子則只具有微弱的熒光強(qiáng)度，表明該技術(shù)方案的特異性非常好。
[0097]此外，采用該檢測(cè)方法應(yīng)用于實(shí)際水樣的檢測(cè)，該實(shí)際樣本為自來水。結(jié)果如表1所示。
[0098]
【權(quán)利要求】
1.一種雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，用于同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)，其特征在于，包括: 第一模版DNA和第二模版DNA，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補(bǔ)配對(duì)的15個(gè)堿基，并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個(gè)堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配，所述胸腺嘧啶的錯(cuò)配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的所述第一模版DNA的3’末端能夠以所述第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增，所述胞嘧啶的錯(cuò)配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的所述第二模版DNA的3’末端能夠以所述第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增； DNA聚合酶和第一 DNA切割酶，所述第一 DNA切割酶可以對(duì)擴(kuò)增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還可以對(duì)擴(kuò)增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第二寡核苷酸； 第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針和第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針，所述第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第一探針序列和結(jié)合在所述第一探針序列上的第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第二探針序列和結(jié)合在所述第二探針序列上的第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第一熒光團(tuán)和所述第二熒光團(tuán)不同； 第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶和dNTPs，所述第二 DNA切割酶可以對(duì)雜交后的所述第一探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)分離，所述第三DNA切割酶可以對(duì)雜交后的所述第二探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的`雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述第一熒光團(tuán)為羧基熒光素，所述第二熒光團(tuán)為四甲基羅丹明。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙功能適配體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI,所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
6.一種雙功能適配體檢測(cè)方法，用于同時(shí)進(jìn)行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測(cè)，其特征在于，包括如下步驟: 將待測(cè)樣品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后發(fā)生雜交反應(yīng)得到雜交液，其中，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補(bǔ)配對(duì)的15個(gè)堿基,并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個(gè)堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個(gè)胸腺嘧啶的錯(cuò)配和3個(gè)胞嘧啶的錯(cuò)配； 向所述雜交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶發(fā)生寡核苷酸鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，得到寡核苷酸擴(kuò)增液，其中，胸腺嘧啶的錯(cuò)配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增，胞嘧啶的錯(cuò)配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配對(duì)結(jié)構(gòu)，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端為模版擴(kuò)增，所述第一 DNA切割酶對(duì)擴(kuò)增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還對(duì)擴(kuò)增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補(bǔ)序列進(jìn)行剪切形成第二寡核苷酸； 向所述寡核苷酸擴(kuò)增液中加入第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二DNA切割酶和第三DNA切割酶發(fā)生雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)，得到熒光檢測(cè)液，其中，所述第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第一探針序列和結(jié)合在所述第一探針序列上的第一熒光團(tuán)和第一淬滅團(tuán)，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針包括第二探針序列和結(jié)合在所述第二探針序列上的第二熒光團(tuán)和第二淬滅團(tuán)，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)發(fā)生淬滅反應(yīng)，所述第一熒光團(tuán)和所述第二熒光團(tuán)不同，所述第二 DNA切割酶對(duì)雜交后的所述第一探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第一熒光團(tuán)和所述第一淬滅團(tuán)分離，所述第三DNA切割酶對(duì)雜交后的所述第二探針序列進(jìn)行剪切并且剪切后所述第二熒光團(tuán)和所述第二淬滅團(tuán)分離； 對(duì)所述熒光檢測(cè)液進(jìn)行熒光檢測(cè)，完成所述雙功能適配體檢測(cè)方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙功能適配體檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙功能適配體檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙功能適配體檢檢測(cè)方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow frag ment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI,所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙功能適配體檢檢測(cè)方法，其特征在于，向所述寡核苷酸擴(kuò)增液中加入第一熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二熒光團(tuán)淬滅團(tuán)探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發(fā)生雙功能熒光擴(kuò)增反應(yīng)的操作中，還需要向其中加入牛血清白蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103667448SQ201310542874
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】張春陽, 朱桂池 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院