基于26個線粒體snp遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用線粒體SNP遺傳標(biāo)記對未知來源的人類生物學(xué)檢材進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個人識別。本發(fā)明的技術(shù)方案是基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒，包括分離包裝的復(fù)合擴(kuò)增引物混合物、多重單堿基延伸反應(yīng)引物混合物、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物混合物。本發(fā)明試劑盒應(yīng)用了單管內(nèi)復(fù)合擴(kuò)增和多重單堿基延伸技術(shù)，可以一次性獲得生物性檢材的26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的基因分型，快速進(jìn)行法醫(yī)學(xué)的個體識別。
【專利說明】基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于法醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù) 合檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種細(xì)胞器，擁有自身的遺傳物質(zhì)一線粒體 DNA (mitochondrial DNA ;mtDNA)。線粒體DNA是唯一的細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，呈閉合雙環(huán)結(jié) 構(gòu)。和核DNA不同，線粒體DNA分子小，僅有16569個堿基對（basePair，bp);單個細(xì)胞內(nèi) 拷貝數(shù)多，每個可存在10-1000個mtDNA分子；線粒體DNA突變率高，在不足2萬個堿基對 的線粒體基因組中具有眾多的多態(tài)性位點；線粒體DNA不參與重組，其中的各多態(tài)位點作 為一個整體，以單倍型（haplotype)的形式獨立向下傳遞，表現(xiàn)出母系遺傳特征。由于其獨 特的遺傳學(xué)特征，線粒體DNA為法醫(yī)DNA分析提供了新的遺傳標(biāo)記，在母系親屬之間的親緣 關(guān)系鑒定以及降解檢材、陳舊骨骼、牙齒等檢材的個人識別中有重要的應(yīng)用價值。此外，線 粒體DNA也是研究人類起源、進(jìn)化和遷移的理想工具之一。多個線粒體DNA遺傳標(biāo)記構(gòu)成 的單倍型組合，能清楚的構(gòu)建譜系樹。各個線粒體DNA單倍群的分布具有明顯的種族地理 特異性，可通過線粒體DNA單倍型分析，推斷未知生物樣本的種族或地理來源。因此，線粒 體DNA分析具有重要的法醫(yī)學(xué)意義。
[0003] 線粒體DNA根據(jù)其功能可分為控制區(qū)和編碼區(qū)兩個區(qū)域，其大部分堿基變異相對 集中在控制區(qū)。因此，法醫(yī)線粒體DNA分析多集中在控制區(qū)，且通常采用直接測序的方法。 但是，僅對HVRI和HVRII范圍內(nèi)的堿基變異進(jìn)行檢測所獲得的多態(tài)信息量很低，在法醫(yī)學(xué) 個體識別中的識別能力非常有限。而且，常用于檢測控制區(qū)的sanger直接測序法步驟煩 瑣，耗時長，成本高，對待測樣本DNA的含量和質(zhì)量依賴性很強。對于現(xiàn)行法醫(yī)學(xué)實驗室普 遍使用的毛細(xì)管電泳設(shè)備而言，sanger直接測序法使用的毛細(xì)管與常用的短串聯(lián)重復(fù)序列 (short tendem repeat, STR)檢測使用的毛細(xì)管不同，大多法醫(yī)實驗室并不常備，因此難以 廣泛應(yīng)用。為了提高線粒體DNA檢測的分辨能力，有研究將控制區(qū)與編碼區(qū)的多態(tài)性位點 聯(lián)合進(jìn)行檢測。但與控制區(qū)不同的是，編碼區(qū)的多態(tài)性位點分布較為零散，分型一定數(shù)量的 多態(tài)位點需要對較大范圍的線粒體DNA進(jìn)行測序。而線粒體全基因組測序無疑將獲得最大 的分辨能力，但是其難以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實際案件。因此，對廣泛存在于線粒體基因組的單核 苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP)進(jìn)行檢測就成為簡便而有效的辦法。 SNP是基因組特定核苷酸位置上單個堿基變異形成的DNA序列多態(tài)性，具有含量豐富、遺傳 穩(wěn)定、突變率低，易于高通量檢測等特點，是目前廣泛應(yīng)用的第三代DNA遺傳標(biāo)記。在法醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域，SNP遺傳標(biāo)記的分型首選單堿基延伸反應(yīng)技術(shù)。與sanger直接測序法相比，單堿 基延伸反應(yīng)技術(shù)擁有獨特的優(yōu)勢。該技術(shù)能夠一次性復(fù)合檢測多個SNP，具有擴(kuò)增片段小 (小于200bp)，所需模板DNA量少等優(yōu)點，特別適用于微量檢材，降解檢材和骨骼，毛發(fā)樣本 的檢測。而且，該技術(shù)能夠與當(dāng)今法醫(yī)遺傳學(xué)實驗室廣泛使用的遺傳標(biāo)記（STR)共同應(yīng)用 毛細(xì)管電泳平臺進(jìn)行檢測。因此，研究人員多采用單堿基延伸反應(yīng)技術(shù)建立可同時分型多 個線粒體SNP的法醫(yī)學(xué)檢測體系。
[0004] 在已經(jīng)建立的線粒體SNP檢測體系中，有的是基于全球人類線粒體進(jìn)化樹中定義 的單倍型類群特異的SNP，用以區(qū)分全世界大洲的各主要人群；有的則可以將某些人群中 頻率最高的單倍型類群劃分至更詳細(xì)的亞群；還有的方案則可以將單獨依據(jù)控制區(qū)無法準(zhǔn) 確劃分單倍型類群的樣本，劃分至正確的單倍型類群。但在這些方案中，前者幾乎完全由單 倍型類群特異的SNP構(gòu)成，這類SNP有的會因為缺乏人群多態(tài)性而使整個方案的分辨能力 降低；后兩者則必須與控制區(qū)的檢測聯(lián)合應(yīng)用?？傮w上，這些方案都沒有在使用一組適當(dāng)數(shù) 目SNP的前提下，盡可能的提高分辨能力。因此，這些方案都只能作為控制區(qū)測序的補充， 單獨應(yīng)用的價值有限，它們并不能解決控制區(qū)測序難以廣泛應(yīng)用的問題。
[0005] 綜上所述,篩選一組適宜的線粒體SNP遺傳標(biāo)記,應(yīng)用單堿基延伸技術(shù),構(gòu)建一種 適于中國人群的、快速、高效能的復(fù)合檢測體系，將為法醫(yī)的個人識別提供一種新的技術(shù)手 段；在此基礎(chǔ)上，開發(fā)出基于現(xiàn)有法醫(yī)遺傳學(xué)實驗室通用的毛細(xì)管電泳平臺的線粒體SNP 復(fù)合檢測試劑盒，將極大推動這種新技術(shù)在法醫(yī)個人識別中的推廣和應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是利用線粒體SNP遺傳標(biāo)記對未知來源的人類生物學(xué) 檢材進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個人識別。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒，包 括分離包裝的復(fù)合擴(kuò)增引物混合物、多重單堿基延伸反應(yīng)引物混合物、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn) 物混合物；所述的基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒中的復(fù)合擴(kuò)增引 物混合物包含了 26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的共計44條擴(kuò)增引物，各擴(kuò)增引物的核苷酸序 列分別如表4中SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 44所示：
[0008] 表4復(fù)合擴(kuò)增引物

【權(quán)利要求】
1.基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒，其特征在于：包括分離包 裝的復(fù)合擴(kuò)增引物混合物、多重單堿基延伸反應(yīng)引物混合物、等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物混合物； 所述的基于26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)復(fù)合檢測試劑盒中的復(fù)合擴(kuò)增引物混合物 包含了 26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的共計44條擴(kuò)增引物，各擴(kuò)增引物的核苷酸序列分別如 表 1 中 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 44 所示： 表1復(fù)合擴(kuò)增引物

上表中，符號前為加尾序列，符號后為特異性引物；其中，SNP位點1719與1736， 10397與10398,6392與6455,5417與5460分別采用的是同一對擴(kuò)增引物。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的多重單堿基延伸反應(yīng)引物混合物 包含26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的共計26條單堿基延伸引物，這些單堿基延伸引物的核苷 酸序列分別為表2中SEQ IDNo. 45至SEQID No. 70所示： 表2單堿基延伸引物

上表中，符號前為加尾序列，符號后為特異性引物；其中，SNP位點10398采用 了兩條單堿基延伸引物，即No. 51和No. 52,分別對應(yīng)相鄰SNP位點10397的兩個不同等位 基因A和G，而SNP10397的等位基因依賴這兩條引物加尾序列長度不同得以區(qū)分。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于：所述的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物混合物 由26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物構(gòu)成，包括52個熒光素標(biāo)記DNA片段， 對應(yīng)26個線粒體SNP遺傳標(biāo)記的所有已知52個等位基因；所述52個熒光素標(biāo)記DNA片段 的核苷酸序列、熒光素類型以及各自所對應(yīng)的SNP基因座在線粒體DNA中的位置如表3所 示： 表3等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物 I SNP I 各SNP對應(yīng)的等位《両分增標(biāo)準(zhǔn)物 I序列衣中的序g- ^ 位點 的核ff酸序列及標(biāo)G的熒光索炎嘴 ] 1736^ ^(GC)-CTmGCCAAACC ATTTACCCA A綠色熒光 SEQIDNoJi^ (GC)-CTTAGCC A A ACCATTTACTC.AG 藍(lán)色熒光 SE〇 ID No.72 5147(GCCTCOTCAACTTAAACTCTAGCArCACA綠色熒 >t SEQ ID No.73^ (GCCT(X')~TCAACTTAAACTCCACiCACX'AC(：?i：t!Lvc)t SEQID No.74 飛iffirn^ A綠色熒光 (GCCTCCTCCCrTCCCCT}-TACTAAACCCCATTAAACGCCTG SEQ ID No.76 __

上表中，符號前為加尾序列，符號后為特異性引物；毗鄰的SNP位點10397和 10398的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物共含有四個DNA片段，這四個DNA片段具有兩種不同的長度， 兩種不同顏色的熒光標(biāo)記，片段長度的不同代表10397位點的不同等位基因，熒光顏色的 差異代表10398位點的不同等位基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK104212894SQ201410422734
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】侯一平, 顏靜, 任崢, 羅海玻, 李英碧 申請人:四川大學(xué)