用于培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的合成表面的制作方法
【專利說明】
[0001] 本發(fā)明專利申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2009/032411，國(guó)際申請(qǐng)日為2009年1月 29日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00980103922. 2,發(fā)明名稱為"用于培養(yǎng)干細(xì)胞衍生 的心肌細(xì)胞的合成表面"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 優(yōu)先權(quán)
[0003] 本申請(qǐng)要求2008年1月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/062, 921的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容 作為整體在本文中引用作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)制品及其使用方法，更具體地說，涉及適于支持干細(xì)胞衍生 的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)的制品。
【背景技術(shù)】
[0005] 多能干細(xì)胞如人類胚胎干細(xì)胞（hESC)具有分化為三種胚層中的任一種的能力， 在人體中形成任何成人細(xì)胞類型。這種獨(dú)特的性能提供了用于開發(fā)對(duì)于大量嚴(yán)重的細(xì)胞退 化疾病，如糖尿病、脊髓損傷、心臟病等的新治療方法的潛力。例如，不像諸如皮膚或肝臟的 器官，心臟不能再生足量的心肌細(xì)胞來進(jìn)行大修。因此，心臟修補(bǔ)可受益于心肌細(xì)胞，其能 從hESC或其它多能干細(xì)胞中分化出來，植入心臟中。
[0006] 但是，在開發(fā)這種基于hESC的治療方法的過程中存在阻礙。這些阻礙包括在組織 培養(yǎng)中獲得并保持適量的未分化的hESC并控制其分化以產(chǎn)生特定的細(xì)胞類型。干細(xì)胞培 養(yǎng)，如hES細(xì)胞培養(yǎng)通常用少量的來自細(xì)胞銀行或細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞做種，然后在未分化的狀 態(tài)下擴(kuò)增直至分化對(duì)于給定的治療用途是所需的。為了達(dá)到這點(diǎn)，hESC或其分化的細(xì)胞目 前在含有動(dòng)物衍生的成分的表面或介質(zhì)（如滋養(yǎng)層、牛胎兒血清或MATRIGEL)存在下培養(yǎng)。 這些用于培養(yǎng)環(huán)境的動(dòng)物衍生的添加物將細(xì)胞暴露于潛在有害的病毒或其它傳染性試劑 下，這些有害的病毒或其它傳染性試劑會(huì)轉(zhuǎn)移到患者上或損害hESC的一般性培養(yǎng)和維持。 另外，這些生物產(chǎn)品具有批變異、免疫響應(yīng)和存儲(chǔ)壽命有限的缺點(diǎn)。
[0007] 已經(jīng)采取一些步驟來在不含動(dòng)物衍生的成分的介質(zhì)中或表面上培養(yǎng)hESC。但是， hESC或其分化的衍生物的響應(yīng)能以預(yù)測(cè)，因?yàn)楸砻婊蚺囵B(yǎng)介質(zhì)的成分改變。當(dāng)然也有一些 優(yōu)點(diǎn)。例如，已經(jīng)在不含限定的血清的介質(zhì)中培養(yǎng)hESC衍生的心肌細(xì)胞。雖然這種培養(yǎng) 體系不是完全排外的培養(yǎng)體系（當(dāng)使用的基體含有動(dòng)物衍生的成分如動(dòng)物膠和MATRIGEL 時(shí)），但是其確實(shí)提供了朝向hESC衍生的心肌細(xì)胞最終臨床應(yīng)用的步驟。作為進(jìn)一步的例 子，一些合成表面被證明能夠支持人類上皮干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞。但是，使用的體系依 賴用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清介質(zhì)，其仍然會(huì)潛在地導(dǎo)致上述對(duì)于所有生物動(dòng)物衍生的成分的問 題。迄今為止，使用化學(xué)限定的介質(zhì)和合成表面的完全不含動(dòng)物的體系并未被證明可用于 培養(yǎng)干細(xì)胞或延伸自干細(xì)胞的細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明公開了，尤其是，可用于在化學(xué)限定的介質(zhì)中培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞 的合成表面。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的方法。該方法包括： 在聚合物材料上沉積含有干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的懸浮液，并在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)沉積 的干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞。所述聚合物材料包含選擇的一種或多種丙烯酸酯單體的均聚物 或共聚物。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)物。所述培養(yǎng)物包括具 有置于表面上的聚合物材料的制品。該培養(yǎng)物還包括置于聚合物材料上的干細(xì)胞衍生的心 肌細(xì)胞以及其中培養(yǎng)了干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)。所述聚合物材料包含選擇的一 種或多種丙烯酸酯單體的均聚物或共聚物。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了用于在化學(xué)限定的介質(zhì)中培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞 的細(xì)胞培養(yǎng)制品。所述制品包括具有表面和置于表面上的聚合物材料的基材。所述聚合物 材料包含選擇的一種或多種丙烯酸酯單體的均聚物或共聚物。
[0012] 本文中提供的各種實(shí)施方式中的一種或多種提供了一種或多種相比用于培養(yǎng)干 細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的現(xiàn)有表面的優(yōu)點(diǎn)。例如，所述合成表面減少了與具有得自或衍生自 動(dòng)物源的成分的表面相關(guān)的污染組織。這些表面還可提供相比具有生物成分的那些表面改 善的存儲(chǔ)壽命。在化學(xué)限定的介質(zhì)中培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的能力還減少了潛在的污 染組織。另外，在合成表面或化學(xué)限定的介質(zhì)的能力下，批與批之間的變異會(huì)更少，導(dǎo)致培 養(yǎng)結(jié)果和預(yù)期的再現(xiàn)性改善。在結(jié)合附圖閱讀了本文后，這些及其它優(yōu)點(diǎn)將從下述具體描 述中容易明白。
【附圖說明】
[0013] 圖IA-B是合成聚合物層涂覆的制品的側(cè)視圖。
[0014] 圖2A-C是多壁細(xì)胞培養(yǎng)皿的截面圖。該培養(yǎng)皿是未涂覆的（圖2A)和涂覆的（圖 2B-C)〇
[0015] 圖3是在實(shí)施例1中描述的制劑I (A)、制劑18⑶和MATRIGEL (C)的化學(xué)限定的 介質(zhì)中和表面上培養(yǎng)的干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的熒光圖像。綠：Nkx 2. 5 ;紅：α -輔肌動(dòng)蛋 白。
[0016] 所述附圖無需按比例繪制。圖中使用的相同數(shù)字表示相同的成分、步驟等。但是， 應(yīng)明白，在給定的圖中使用數(shù)字來指代成分并不意味著限制另一張圖中標(biāo)有相同數(shù)字的成 分。另外，使用不同的數(shù)字指代成分并不意味著標(biāo)有不同數(shù)字的成分不能是相同的或類似 的。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 在以下的詳細(xì)描述中，對(duì)附圖的參照構(gòu)成其一部分，并且通過裝置、體系和方法的 若干【具體實(shí)施方式】進(jìn)行說明。要理解，其它實(shí)施方式也是可期待的，并且可在不偏離本發(fā)明 的范圍或精神的前提下作出。因此，下述詳細(xì)描述并非是限制性的。
[0018] 本文中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域使用的普通含義，除非另有說明。 本文中提供定義有助于理解本文中經(jīng)常出現(xiàn)的某些術(shù)語，并不意味著限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 如本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的，單數(shù)形式"一"、"一種"和"該"包括復(fù) 數(shù)形式的實(shí)施方式，除非文本中清楚地另有說明。如本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用 的，術(shù)語"或"通常包括"和/或"，除非文本中清楚地另有說明。
[0020] 除非另有說明，組合物（如溶液）中化合物的比例基于體積比。
[0021] 如本文中使用的，"具有"、"包括"、"包含"等以其開放的形式使用，通常是指"包 括，但不限于"。
[0022] 如本文中使用的，術(shù)語"丙烯酸酯"包括含有丙烯酸酯部分或甲基丙烯酸酯部分的 化合物。丙烯酸酯部分是下式表示的部分：CH 2CHC(0)0-。甲基丙烯酸酯部分是下式表示的 部分：CH2C(CH3)C(0)0-。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"丙烯酸酯"包括表1中公開的具體化合 物。本文中使用的"丙烯酸酯"和"甲基丙烯酸酯"可互換，除了文本清楚地另有說明之外， 例如，當(dāng)命名具體的化合物或化合物組時(shí)。
[0023] 本發(fā)明公開了，尤其是，具有用于培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的合成表面的制品 以及用于在該表面上培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方式中，所述合成表 面與化學(xué)限定的介質(zhì)結(jié)合使用以培養(yǎng)干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞。所述表面可用于將干細(xì)胞如 hESC分化為心肌細(xì)胞。
[0024] 1.細(xì)胞培養(yǎng)制品
[0025] 參看圖1，示出了用于培養(yǎng)細(xì)胞的制品100。該制品100包括具有表面15的基底 材料基材10。合成聚合物涂層20置于基底材料基材10的表面15上。盡管未示出，要理 解，合成聚合物涂層20可置于基底材料基材10的一部分上?；撞牧?0可以是任何適于 培養(yǎng)細(xì)胞的材料，包括陶瓷物質(zhì)、玻璃、塑料、聚合物或共聚物，它們的任意組合，或者材料 之間的涂層。所述基底材料10包括玻璃材料，如鈉鈣玻璃、耐火玻璃、高硼硅酸耐熱玻璃、 石英玻璃；硅；塑料或聚合物，包括樹枝狀聚合物如聚（氯乙烯）、聚（乙烯醇）、聚（甲基丙 烯酸甲酯）、聚（乙酸乙烯酯-馬來酸酐）、聚（二甲基硅氧烷）單甲基丙烯酸酯、環(huán)烯烴聚 合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亞胺；共聚物如聚（乙酸乙烯酯-合-馬來酸 酐）、聚（苯乙烯-合-馬來酸酐）、聚（乙烯-合-丙烯酸）或者它們的衍生物等。
[0026] 適于細(xì)胞培養(yǎng)的制品100的例子包括單井和多井板，如6、12、96、384和1536井 板、罐、培養(yǎng)皿、燒瓶、燒杯、板、滾瓶、載玻片如有室的和多室的培養(yǎng)載玻片、試管、蓋玻片、 杯、旋轉(zhuǎn)瓶、灌注室、生物反應(yīng)器和發(fā)酵桶。
[0027] 合成聚合物涂層20提供了其上可培養(yǎng)細(xì)胞的表面25。所述合成聚合物涂層20包 括聚合的（甲基