本發(fā)明涉及一種催化生產(chǎn)5-氟尿嘧啶的方法及應(yīng)用，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、5-氟尿嘧啶是重要的抗腫瘤藥物之一，也是合成氟代嘧啶類抗腫瘤藥物的關(guān)鍵中間體。5-氟尿嘧啶的合成方法為化學(xué)合成法，包括：直接合成法、縮合環(huán)化法、其他方法(如氟乙酸乙酯與甲酸乙酯縮合法)。直接氟化法是以尿嘧啶為原料，與氮氣稀釋的氟氣反應(yīng)，經(jīng)處理獲得5-氟尿嘧啶，該工藝相對簡單，收率高，但由于氟氣價格昂貴，氟氣的來源受到制約，同時，氟氣毒性大，對設(shè)備要求高等原因，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中應(yīng)用較少。其他方法主要是以氮雜環(huán)化合物的衍生物為起始原料，此法原料難得，成本高，不適宜產(chǎn)業(yè)化。隨著電解制氟工藝運行的成熟、安全、可靠，氟氣已不再成為直接合成5-氟尿嘧啶的瓶頸?；诖耍琧n105693628a提供了一種一步法合成5-氟尿嘧啶的生產(chǎn)工藝。然而，目前主流工業(yè)化路線為縮合環(huán)合法，以氟乙酸甲酯為起始原料，經(jīng)與甲酸乙酯在甲醇鈉的催化下等到氟代丙醛酸甲酯烯醇式鈉鹽，此中間體與甲異脲環(huán)合成2-甲氧基-5-氟尿嘧啶，后經(jīng)酸水解、重結(jié)晶等過程得到5-氟尿嘧啶。但，此法路線長，效率低，亟需找到一種簡單高效的5-氟尿嘧啶生產(chǎn)方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、[技術(shù)問題]

2、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)法催化生產(chǎn)5-氟尿嘧啶的方法與工藝步驟復(fù)雜、合成效率低。

3、[技術(shù)方案]

4、針對上述問題，本專利采用重組表達方式在大腸桿菌中高效表達了乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶基因pyrf。采用表達的乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶，以5-氟乳清酸為底物，高效催化合成5-氟尿嘧啶，實現(xiàn)了5-氟尿嘧啶的高效綠色生產(chǎn)，促進其在醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明提供了一種乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶突變體，在seq?id?no.1所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上，進行以下任一種突變：

6、(1)將第21位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸，得到突變體l21h；

7、(2)將第72位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸，得到突變體l72h；

8、(3)將第45位纈氨酸突變?yōu)楸彼幔玫酵蛔凅wv45a。

9、本發(fā)明還提供了編碼所述突變體的基因。

10、在一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

11、本發(fā)明還提供了攜帶所述基因的表達載體。

12、本發(fā)明還提供了表達所述突變體，或攜帶所述表達載體的微生物細胞。

13、本發(fā)明還提供了一種重組大腸桿菌，以大腸桿菌bl21(de3)為宿主，以petduet-1為表達載體，表達所述突變體。

14、本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)5-氟尿嘧啶的方法，以所述突變體，或所述微生物細胞，或所述重組大腸桿菌為催化劑，以5-氟乳清酸為底物，進行反應(yīng)。

15、在一種實施方式中，所述反應(yīng)體系中還含有磷酸鹽，所述磷酸鹽包括：磷酸鈉、磷酸鉀。

16、在一種實施方式中，所述反應(yīng)體系中，以終濃度計，含有：5-氟乳清酸0.01～1.0g/l、磷酸鹽50～300mm、乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶1.0～100mg/ml。

17、在一種實施方式中，于ph?5.5～8.5、20～40℃，反應(yīng)至少3.5h。

18、本發(fā)明還提供了所述突變體，或所述微生物細胞，或所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)5-氟尿嘧啶或含5-氟尿嘧啶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

19、有益效果

20、本發(fā)明以乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶作為催化劑，以5-氟乳清酸為原料，實現(xiàn)了高效催化生產(chǎn)5-氟尿嘧啶，工藝簡單。將乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶的第45位纈氨酸替換為丙氨酸后，乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶的表達酶活提高至野生酶的1.6倍，催化生產(chǎn)5-氟尿嘧啶的效率提高1.4倍。

技術(shù)特征：

1.一種乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶突變體，其特征在于，在seq?id?no.1所示的氨基酸序列基礎(chǔ)上，進行以下任一種突變：

2.編碼權(quán)利要求1所述突變體的基因。

3.攜帶權(quán)利要求2所述基因的表達載體。

4.表達權(quán)利要求1所述突變體，或攜帶權(quán)利要求3所述表達載體的微生物細胞。

5.一種重組大腸桿菌，其特征在于，以大腸桿菌bl21(de3)為宿主，以petduet-1為表達載體，表達權(quán)利要求1所述突變體。

6.一種生產(chǎn)5-氟尿嘧啶的方法，其特征在于，以權(quán)利要求1所述突變體，或權(quán)利要求4所述微生物細胞，或權(quán)利要求5所述重組大腸桿菌為催化劑，以5-氟乳清酸為底物，進行反應(yīng)。

7.如權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系中還含有磷酸鹽，所述磷酸鹽包括：磷酸鈉、磷酸鉀。

8.如權(quán)利要求6或7所述方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系中，以終濃度計，含有：5-氟乳清酸0.01～1.0g/l、磷酸鹽50～300mm、乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶1.0～100mg/ml。

9.如權(quán)利要求6～8任一所述方法，其特征在于，于ph?5.5～8.5、20～40℃，反應(yīng)至少3.5h。

10.權(quán)利要求1所述突變體，或權(quán)利要求4所述微生物細胞，或權(quán)利要求5所述重組大腸桿菌在生產(chǎn)5-氟尿嘧啶或含5-氟尿嘧啶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種催化生產(chǎn)5?氟尿嘧啶的方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以5?氟乳清酸為底物，以乳清酸核苷?5'?磷酸脫羧酶為催化劑，高效催化合成5?氟尿嘧啶；并通過分子改造乳清酸核苷?5'?磷酸脫羧酶，進一步提高了催化效率，實現(xiàn)了5?氟尿嘧啶的高效綠色生產(chǎn)，促進其在醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：陳禮偉,于廣,徐忠智,王沈軍,陳嘉慧
受保護的技術(shù)使用者：江蘇香地化學(xué)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21