本申請涉及發(fā)酵工程，具體涉及一種l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白、編碼其的核酸、包含該核酸的基因表達盒、包含該核酸和/或基因表達盒的重組載體、包含該核酸、該基因表達盒和該重組載體中的一種或多種的重組細胞、利用該重組細胞制備l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的方法、利用該重組細胞生產(chǎn)l-丙氨酸的方法。

背景技術(shù)：

1、l-丙氨酸應(yīng)用廣泛，主要用于合成新型綠色的螯合劑mgda、維生素b6、丙谷二肽、食品增味劑等。目前，生物發(fā)酵法已成為當前的丙氨酸主流生產(chǎn)方法。

2、大腸桿菌中l(wèi)-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白alae的是一種l-丙氨酸輸出蛋白，它利用質(zhì)子電化學勢催化l-丙氨酸的主動輸出。通過對alae跨膜結(jié)構(gòu)域中帶電氨基酸的取代實驗，研究表明alae跨膜結(jié)構(gòu)域中的帶電氨基酸殘基(r45和d84)在l-丙氨酸輸出中起關(guān)鍵作用。

3、在谷氨酸棒桿菌中，通過在乳酸脫氫酶基因ldha位點整合來源于大腸桿菌的丙氨酸輸出蛋白基因alae，阻斷丙酮酸到乳酸的代謝并增強l-丙氨酸的輸出，從而提高l-丙氨酸的產(chǎn)量。轉(zhuǎn)運蛋白的表達受到轉(zhuǎn)錄因子及其效應(yīng)物的嚴格調(diào)控，轉(zhuǎn)運蛋白及其調(diào)控因子是代謝改造的關(guān)鍵靶點。alae在l-丙氨酸轉(zhuǎn)運中扮演著重要角色，并且通過對該酶進行突變改造可以提高酶活性，進一步提高l-丙氨酸產(chǎn)量，為合成生物學和生物技術(shù)應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)。

4、然而目前尚未找到有效的alae的突變方式。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，至少提供一種l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白、編碼其的核酸分子、應(yīng)用、制備方法及生產(chǎn)l-丙氨酸的方法。

2、在本申請的第一方面，提供一種l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，其相對于序列如seq?id?no:2所示的氨基酸序列在第5位、第39位、第46位、第71位、第86位和第94位中的一位或多位具有突變，所述突變的方式選自取代、缺失和添加中的一種或多種。

3、在本申請的第二方面，提供一種核酸分子，其編碼如第一方面所述的l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白。

4、在本申請的第三方面，提供一種基因表達盒，其含有啟動子、如第二方面所述的核酸分子，和終止子。

5、在本申請的第四方面，提供一種重組載體，其包含骨架載體，和如下項目中的一種或多種：

6、1)如第二方面所述的核酸分子；

7、2)如第三方面所述的基因表達盒。

8、在本申請的第五方面，提供一種重組細胞，其包含第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的基因表達盒和如第四方面所述的重組載體中的一種或多種。

9、在本申請的第六方面，提供一種制備l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的方法，其包括：對如第五方面所述的重組細胞進行發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)誘導表達，得到含有l(wèi)-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的培養(yǎng)物

10、在本申請的第七方面，提供一種生產(chǎn)l-丙氨酸的方法，其包括：在底物葡萄糖存在條件下，對第五方面所述的重組細胞進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得l-丙氨酸。

11、本申請一實施方式獲得的l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相較于野生型具有明顯提高的丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白活性，使用含有前述l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的菌株生產(chǎn)l-丙氨酸，轉(zhuǎn)化率高，例如，轉(zhuǎn)化率可以實現(xiàn)70％以上，甚至可達95％以上。可以為l-丙氨酸的生產(chǎn)提供了強有力的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，其相對于序列如seq?id?no:2所示的氨基酸序列在第5位、第39位、第46位、第71位、第86位和第94位中的一位或多位具有突變，所述突變的方式選自取代、缺失和添加中的一種或多種。

2.如權(quán)利要求1所述的l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白滿足如下條件中的一項或多項：

3.如權(quán)利要求1或2所述的l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相對于序列如seq?id?no:2所示的氨基酸序列在第46位、第71位和第94位中至少兩位具有突變；

4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，其特征在于，所述l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白包含序列如seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:8、seq?id?no:10、seq?id?no:12、seq?id?no:14、seq?id?no:16、seq?id?no:18、seq?id?no:20、seq?id?no:22、seq?id?no:24、seq?id?no:26、seq?id?no:28、seq?id?no:30或者seq?id?no:32所示的氨基酸序列。

5.一種核酸分子，其編碼如權(quán)利要求1-4中任一項所述的l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白；

6.一種基因表達盒，其特征在于，其含有啟動子、如權(quán)利要求5所述的核酸分子，和終止子。

7.一種重組載體，其特征在于，其包含骨架載體，和如下項目中的一種或多種：

8.一種重組細胞，其特征在于，其包含權(quán)利要求5所述的核酸分子、權(quán)利要求6所述的基因表達盒和如權(quán)利要求7所述的重組載體中的一種或多種；

9.一種制備l-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的方法，其特征在于，其包括：對如權(quán)利要求8所述的重組細胞進行發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)誘導表達，得到含有l(wèi)-丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的培養(yǎng)物；

10.一種生產(chǎn)l-丙氨酸的方法，其特征在于，其包括：在底物葡萄糖存在條件下，對權(quán)利要求8所述的重組細胞進行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得l-丙氨酸；

技術(shù)總結(jié)
本申請公開了L?丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白、編碼其的核酸分子、應(yīng)用、制備方法及生產(chǎn)L?丙氨酸的方法。該L?丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白相對于序列如SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列在第5位、第39位、第46位、第71位、第86位和第94位中的一位或多位具有突變，突變的方式選自取代、缺失和添加中的一種或多種。含有前述L?丙氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的菌株在發(fā)酵過程中的轉(zhuǎn)化率高，例如可以實現(xiàn)70％以上，甚至可達95％以上?？梢詾長?丙氨酸的生產(chǎn)提供了強有力的工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：祁新華,張雅萍,吳計劃,朱亞敏,朱彥凱,柳昊然
受保護的技術(shù)使用者：萬華化學集團營養(yǎng)科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21