本發(fā)明涉及水稻育種領域，具體涉及一種鑒別水稻耐鹽基因stg5優(yōu)勢單倍型的分子標記及其應用。

背景技術：

1、隨著全球土壤鹽漬化面積不斷擴大，鹽脅迫已經(jīng)成為影響糧食安全最嚴重的非生物脅迫之一。鹽脅迫對水稻(oryza?sativa?l.)的產(chǎn)量和品質都會產(chǎn)生嚴重影響，因此，加強對水稻耐鹽脅迫分子機制的研究，挖掘具有分子設計育種利用價值的新基因，培育適應鹽堿脅迫的水稻新品種，對保障國家糧食安全、端牢中國飯碗具有非常重要的意義。

2、目前水稻中定位的耐鹽相關qtl有900多個，但真正克隆的基因不多，stg5是其中之一(wei?et?al.,2024)。stg5編碼ap2/erf轉錄因子，可以直接結合oshkt1；5；oshkt2；1，oshkt2；3和oshkt2；4的啟動子，在轉錄水平上調(diào)節(jié)多個oshkt基因家族成員的表達來調(diào)節(jié)na+和k+的穩(wěn)態(tài)，從而賦予水稻耐鹽性(wei?et?al.,2024)。單倍型分析結果表明，stg5在秈粳稻之間存在著明顯的秈粳分化，其中秈型stg5ind(indica型)為優(yōu)勢單倍型(wei?et?al.,2024)。

3、由于對作物耐鹽性狀的測定比較復雜，需要有專門的條件和豐富的經(jīng)驗，因此該表型測定工作給育種工作者帶來了很多不便。分子標記是一段能反映種間基因組差異的特異性dna片段，能夠使育種工作者降低對表型選育的依賴，從而加快水稻耐鹽品種的選育，因而受到了育種工作者的歡迎。將stg5的indica基因型導入粳稻水稻優(yōu)良受體材料，提高粳稻水稻品種的耐鹽性，將具有廣闊的應用前景。目前文獻尚無關于stg5分子標記的相關報道。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明提供了一種鑒別水稻耐鹽基因stg5優(yōu)勢單倍型的分子標記及其應用。本發(fā)明針對報道的stg5基因耐鹽優(yōu)勢單倍型(indica型)與鹽敏感型(japonica型)基因序列所存在的特異性差異位點，設計上游引物stg5-allele1、上游引物stg5-allele2及公用引物stg5-common，對水稻基因組dna進行pcr擴增并進行熒光掃描，根據(jù)熒光信號鑒別耐鹽優(yōu)勢單倍型、鹽敏感型和雜合體型，從而對stg5等位基因型進行精準、快速、高效地鑒定，為后續(xù)培育耐鹽水稻新品系提供有力的工具。

2、本發(fā)明的技術方案是：一種鑒別水稻耐鹽基因stg5優(yōu)勢單倍型的分子標記，其特征是，

3、與耐鹽優(yōu)勢單倍型(indica型)位點檢測相關的核苷酸序列如下所示(seq?no.1)：

4、gcttgggtgcttaattacgatcacgggtctaaacatagtgagctagttgaccaaaccaaagcgtgaagtgttaacaac；

5、與鹽敏感單倍型(japonica型)位點檢測相關的核苷酸序列如下所示(seq?no.2)：

6、gcttgggtgcttaattacgatcacgggtctaaacatggtgagctagttgaccaaaccaaagcgtgaagtgttaacaac。

7、本發(fā)明還提供了鑒定上述耐鹽優(yōu)勢單倍型(indica型)與鹽敏感型(japonica型)的parms分子標記的引物，具體為：

8、上游引物stg5-allele1(seqno.3)：

9、5’-gaaggtgaccaagttcatgctattacgatcacgggtctaaacatg-3’；

10、上游引物stg5-allele2(seqno.4)：

11、5’-gaaggtcggagtcaacggattattacgatcacgggtctaaacata-3’；

12、公用下游引物stg5-common：

13、5’-tgttaacacttcacgctttggttt-3’(seqno.5)。

14、上述分子標記的引物可用于水稻stg5耐鹽導入系的世代群體分離篩選檢測，也可用于鑒定水稻材料的stg5基因型耐鹽優(yōu)勢單倍型、敏感型及雜合體型。

15、本發(fā)明還公開了應用上述引物鑒定水稻材料的stg5基因型耐鹽優(yōu)勢單倍型、敏感型及雜合體型的方法，其特征是，包括以下步驟：

16、(1)利用上游引物stg5-allele1、上游引物stg5-allele2及公用引物stg5-common對水稻基因組dna進行pcr擴增，然后將pcr擴增產(chǎn)物轉移至熒光掃描酶標儀(hex、fam和rox三通道)檢測熒光信號強度，最后將信號值用snp?decoder軟件上分析，并用散點圖格式輸出，對產(chǎn)物進行基因分型；

17、(2)在散點圖中，紅色信號為耐鹽優(yōu)勢單倍型(indica型)，藍色信號為鹽敏感型(japonica型)，綠色信號為雜合體型。

18、本發(fā)明還可以使用quantstudio?5熒光定量pcr儀，genotyping模采集fam和hex熒光信號值并自動基因分型。

19、上述步驟(1)中所述的pcr擴增體系采用2×parms?master?mix，優(yōu)選體系為10μl體系。本試驗采用景肽生物公司的2×parms?pro?pcr?mix(10μl)，反應體系如下：2×parmspro?pcr?mix(包含2條通用熒光引物)5μl；10mmol/l?allele1引物0.15μl；10mmol/lallele2引物0.15μl；公用引物common0.4μl；模板dna?0.5μl；ddh2o?3.8μl。

20、上述步驟(1)所述的pcr擴增、掃描的反應程序優(yōu)選為：94℃變性15min；94℃預變性20s，65℃(-0.8℃每循環(huán))退火及延伸1min，擴增10個循環(huán)；94℃變性20s，55℃退火及延伸1min，擴增28～30個循環(huán)；25℃延伸1min；25℃熒光掃描，30s。

21、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及技術效果：

22、(1)開發(fā)了一種用于區(qū)分水稻耐鹽基因stg5的耐鹽優(yōu)勢單倍型(indica型)和敏感單倍型(japonica型)的分子標記引物stg5-allele1/allele2/common，對水稻基因組dna進行pcr擴增并進行熒光掃描，根據(jù)熒光信號鑒別耐鹽優(yōu)勢單倍型、鹽敏感型和雜合體型，從而對stg5等位基因型進行精準、快速、高效地鑒定，為后續(xù)培育耐鹽水稻新品系提供有力的工具。

23、(2)本標記通過熒光信號方式呈現(xiàn)結果，一目了然，精準度提高。該方法具有快速省時(省去電泳試驗檢測)，健康環(huán)保(避免有毒試劑溴化乙錠使用)，精準(避免電泳檢測觀察誤差)等優(yōu)點。

技術特征：

1.一種鑒別水稻耐鹽基因stg5優(yōu)勢單倍型的分子標記，其特征是，

2.一種鑒別水稻耐鹽基因stg5優(yōu)勢單倍型的parms分子標記引物，其特征是，用于鑒別耐鹽優(yōu)勢單倍型與鹽敏感單倍型；所述引物具體為：

3.權利要求2所述的parms分子標記引物在水稻stg5耐鹽導入系的世代群體分離篩選檢測中的應用。

4.權利要求2所述的parms分子標記引物在鑒定水稻材料的stg5基因型耐鹽優(yōu)勢單倍型、敏感型及雜合體型中的應用。

5.采用權利要求2所述的引物鑒定水稻材料的stg5基因型耐鹽優(yōu)勢單倍型、敏感型及雜合體型的方法，其特征是，包括以下步驟：

6.采用權利要求2所述的引物鑒定水稻材料的stg5基因型耐鹽優(yōu)勢單倍型、敏感型及雜合體型的方法，其特征是，利用上游引物stg5-allele1、上游引物stg5-allele2及公用引物stg5-common對水稻基因組dna進行pcr擴增和熒光掃描，使用quantstudio?5熒光定量pcr儀，genotyping模采集fam和hex熒光信號值并自動基因分型。

技術總結
本發(fā)明公開了一種鑒別水稻耐鹽基因STG5優(yōu)勢單倍型的分子標記及其應用。本發(fā)明針對報道的STG5基因耐鹽優(yōu)勢單倍型(Indica型)與鹽敏感型(Japonica型)基因序列所存在的特異性差異位點，設計上游引物STG5?Allele1、上游引物STG5?Allele2及公用引物STG5?common，對水稻基因組DNA進行PCR擴增并進行熒光掃描，根據(jù)熒光信號鑒別耐鹽優(yōu)勢單倍型、鹽敏感型和雜合體型，從而對STG5等位基因型進行精準、快速、高效地鑒定。

技術研發(fā)人員：鄭崇珂,謝先芝,解麗霞,彭永彬,和亞男,蔣聰慧,孫堯,李亞萍,周晉軍
受保護的技術使用者：山東省農(nóng)業(yè)科學院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/21