本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物，具體涉及一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、固氮微生物在常溫常壓下將空氣中的氮氣還原成銨，為植物生長提供一定量的氮素。但生物固氮是一個高耗能過程，每還原1分子氮合成2分子銨，需要消耗16個atp，因此生物固氮受產(chǎn)物銨的嚴(yán)格調(diào)控，即：高濃度的氮抑制生物固氮。不同的固氮微生物采用不同的調(diào)控機制控制固氮基因的表達(dá)。

2、變棲克雷伯氏菌(klebsiella?trevisan)是一種固氮細(xì)菌。變棲克雷伯氏菌具有生長速度快、固氮酶活性高的特點。與其他大多數(shù)固氮菌類似，這個菌的缺點是，只有在貧瘠的土壤中固氮效率高，而在肥沃的土壤(氮含量高)中的固氮效率低?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)體系中氮肥的大量使用導(dǎo)致土壤中的氮含量高。高濃度的氮抑制固氮基因(編碼固氮酶)表達(dá)，則導(dǎo)致固氮效率很低。

3、在變棲克雷伯氏菌(k.trevisan)中，20個固氮基因構(gòu)成8個轉(zhuǎn)錄單位(nifj、nifhnifd?nifk?nift?nify、nife?nifn?nifx、nifu?nifs?nifv、nifw?nifz?nifm、niff、niflnifa、nifb?nifq)，這20個固氮基因簇集在24kb的染色體dna區(qū)域。該20個固氮基因中，除nifl和nifa兩個基因是調(diào)控基因外，其他18個基因編碼的蛋白產(chǎn)物參與固氮酶的合成。調(diào)控基因nifl和nifa組成一個轉(zhuǎn)錄單位，共用一個啟動子，nifl和nifa的轉(zhuǎn)錄受ntrb和ntrc的調(diào)控。nifa是正調(diào)控蛋白，激活其他固氮基因的表達(dá)；而nifl是負(fù)調(diào)控蛋白，nifl通過與nifa相互作用而阻止nifa與其他固氮基因的啟動子結(jié)合，從而抑制其他固氮基因表達(dá)。在環(huán)境中氮濃度低時，nifa(nifa基因產(chǎn)物)作為轉(zhuǎn)錄正調(diào)控蛋白，激活其他7個轉(zhuǎn)錄單位(18個固氮基因)的表達(dá)，則合成固氮酶而進(jìn)行生物固氮；在環(huán)境中氮濃度高時，nifl(nifl基因產(chǎn)物)與nifa形成二聚體，阻止nifa與啟動子的結(jié)合，則抑制其他7個轉(zhuǎn)錄單位(18個固氮基因)的表達(dá)，則不能合成固氮酶和不能固氮。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明以變棲克雷伯氏菌(klebsiella?trevisan)為出發(fā)菌株構(gòu)建了變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。對負(fù)調(diào)控基因nifl進(jìn)行敲除、同時插入不受氮調(diào)控的tc啟動子驅(qū)動正調(diào)控基因nifa表達(dá)。nifl基因缺失和nifa上游啟動子被tc啟動子取代的工程菌株突破高濃度銨對固氮作用的抑制。變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la為耐銨和泌銨固氮微生物，提高在高銨條件下的固氮酶活性，突破了高濃度銨對生物固氮的抑制作用，提高了泌銨能力。

2、為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la，所述工程菌株fb-la以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan的基因組為基礎(chǔ)，缺失nifl基因編碼區(qū)的部分序列，然后插入tc啟動子且tc啟動子位于nifa基因上游；其中，nifl基因的核苷酸序列為seq?id?no:1所示；所述tc啟動子的核苷酸序列為seq?id?no:2所示。

4、進(jìn)一步地，所述缺失nifl基因的部分序列的核苷酸序列為seq?id?no:3所示；所述變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan為變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan?fb006，其保藏編號為cctcc?no：m?20232710。

5、本發(fā)明還提供了一種上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

6、(1)將nifl基因的部分序列和tc啟動子插入載體質(zhì)粒pgpgmr中，得到重組質(zhì)粒pgpgmr-la；

7、(2)以慶大霉素gm為篩選標(biāo)記，將所述重組質(zhì)粒pgpgmr-la轉(zhuǎn)入大腸桿菌sm10，

8、(3)將含有重組質(zhì)粒pgpgmr-la的大腸桿菌與變棲克雷伯氏菌液體培養(yǎng)物混合培養(yǎng)，篩選得到攜具有amp和gm抗性的變棲克雷伯氏菌的接合子；

9、(4)連續(xù)傳代培養(yǎng)單交換菌株，利用amp抗性，篩選發(fā)生第二次交換的雙交換菌株，該工程菌株稱為變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。

10、進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，重組質(zhì)粒pgpgmr-la的構(gòu)建方法如下：

11、a.以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan基因組dna為模板，利用引物對up-f/up-r，擴增nifl上游同源臂；其中，引物對up-f/up-r如下：

12、up-f：cgacggatcccaagcttcttctacagcacggtgcgtttaatc如seq?id?no:4所示，

13、up-r：gtttgttgaaggcgttatcgagcatcatattc如seq?id?no:5所示；

14、b.以變棲克雷伯氏菌klebsiella?trevisan基因組dna為模板，利用引物對down-f/down-r擴增nifl下游同源臂；其中，引物對down-f/down-r如下：

15、down-f：aatttacgacaactggcttcgcgaccgc如seq?id?no:6所示，

16、down-r：taacaatttgtggaattcccgcgccgcgcagttaaatttg如seq?id?no:7所示；

17、c.以phy300plk質(zhì)粒dna為模板，利用引物對la-f/la-r擴增tc啟動子；其中，引物對la-f/la-r如下：

18、la-f：cgataacgccttcaacaaacgggccatattg如seq?id?no:8所示，

19、la-r：gaagccagttgtcgtaaattcgattgtgaatag如seq?id?no:9所示；

20、d.載體質(zhì)粒pgpgmr被限制性內(nèi)切酶xbaⅰ和smaⅰ雙酶切，然后，利用gibsonassembly?master?mix(new?england?biolabs)，將nifl上游同源臂片段、nifl下游同源臂片段、tc?promoter片段，以及xbaⅰ和smaⅰ雙酶切的質(zhì)粒pgpgmr片段，進(jìn)行組裝，組裝得到重組質(zhì)粒pgpgmr-la。

21、本發(fā)明還提供了一種上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la在提高固氮酶活性或泌銨能力中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明還提供了一種上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。

23、進(jìn)一步地，所述植物為經(jīng)濟作物。

24、再進(jìn)一步地，所述經(jīng)濟作物為水稻、黃瓜和番茄中任意一種。

25、本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)植物生長的菌劑，所述菌劑含有上述的變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。

26、再進(jìn)一步地，所述植物為水稻、黃瓜和番茄中任意一種。

27、本發(fā)明的原理：

28、本發(fā)明對負(fù)調(diào)控基因nifl進(jìn)行敲除和利用不受氮調(diào)控的tc啟動子驅(qū)動正調(diào)控基因nifa表達(dá)。原nifl基因長度為1488bp，原nifl基因內(nèi)部缺失1375bp，nifl基因只保留113bp。nifa基因長度為1575bp，在nifa上游添加tc啟動子(240bp)啟動子。經(jīng)過改造的菌株稱為變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la，變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la能提高固氮菌的泌銨能力和提高固氮酶在高濃度氮條件下的固氮能力，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中具有重要價值。

29、在本發(fā)明的具體實施方式中，采用變棲克雷伯氏菌(klebsiella?trevisan?fb006以下簡稱為k.trevisan)，該菌株保藏于中國，武漢武漢大學(xué)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctcc?no：m?20232710，保藏日期：2023年12月28日。以該菌株為出發(fā)菌株，利用基因工程方法改造nifl和nifa，構(gòu)建得到工程菌株，該工程菌株有較強的泌銨能力和抗氮阻遏能力。

30、本發(fā)明的有益效果：

31、本發(fā)明利用生物工程技術(shù)獲得并公開了變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la。和野生型菌株(wt)相比，變棲克雷伯氏菌工程菌株fb-la在0mm銨條件的固氮酶活性顯著高于野生型菌株(wt)，而且在10mm和100mm銨濃度下仍然具有高度酶活性，nifl基因缺失和nifa上游插入tc啟動子的工程菌株突破了高濃度銨對固氮作用的抑制，提高了固氮酶活性，nifl基因缺失提高了泌銨能力，因此，該工程菌株將能在貧瘠和肥沃的土壤中均能發(fā)揮固氮作用，對黃瓜、番茄和水稻的生長有明顯的促進(jìn)效果，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。