背景技術：

1、最近開發(fā)的基因編輯劑能夠精確操作活生物體中的基因組dna，并提高了治療許多遺傳疾病的根本原因的可能性(anzalone?et?al.,2020；doudna,2020)。引導編輯的最近發(fā)展使得基因組dna序列的插入、缺失或替換成為可能，而不需要容易出錯的雙鏈dna斷裂。參見anzalone?et?al.,“search-and-replace?genome?editing?without?double-strandbreaks?or?donor?dna,”nature,2019,vol.576,pp.149-157，其內(nèi)容通過引用并入本文。引導編輯使用與工程化引導編輯向導rna(pegrna)配對的工程化cas9切口酶-逆轉錄酶融合蛋白，該工程化引導編輯向導rna不僅將cas9引導至靶基因組位點，而且還編碼用于安裝期望編輯的信息。引導編輯通過多步驟編輯過程進行：1)cas9結構域結合并切割靶基因組dna位點，其由pegrna的間隔序列指定；2)逆轉錄酶結構域使用帶切口的基因組dna作為引物，以使用pegrna上的工程化延伸作為逆轉錄的模板來啟動編輯的dna鏈的合成-這生成了含有編輯的dna序列的單鏈3’瓣；3)細胞dna修復通過位移5’瓣結構來解析3’瓣中間體，這個過程是經(jīng)由通過編輯的3’瓣的入侵，含有原始dna序列的5’瓣的剪切，以及新的3’瓣的連接以并入編輯的dna鏈，形成一條編輯的和一條未編輯的鏈的異源雙鏈體發(fā)生的；和4)細胞dna修復使用編輯的鏈作為修復的模板替換異源雙鏈體內(nèi)的未編輯的鏈，完成編輯過程。

2、體內(nèi)引導編輯的廣泛的治療應用需要安全有效的方法用于將引導編輯器(pe)遞送到多個組織和器官。腺相關病毒(aav)和慢病毒(lv)已被用于將編碼基因編輯劑的dna遞送到靶組織(levyet?al.,2020；newby?and?liu,2021)。然而，編碼編輯劑的dna的病毒遞送導致轉導細胞中的表達延長，這增加了脫靶編輯的頻率(akcakaya?et?al.,2018；davis?etal.,2015；wang?et?al.,2020；yehet?al.,2018)。此外，dna的病毒遞送提高了病毒載體整合到轉導細胞基因組中的可能性，這兩者都可以促進腫瘤發(fā)生或其他副作用(anzalone?etal.,2020；chandler?et?al.,2017)。此外，盡管轉染方法和病毒遞送載體(例如，aav或lv)的性能不斷發(fā)展，這些方法的效率可以顯著變化，特別是在對其環(huán)境的修飾高度敏感并且可以響應于轉染劑和/或載體而改變的原代細胞中。

3、體內(nèi)遞送基因編輯劑(例如，pe)的一種替代方法可以是直接遞送蛋白質(例如，pe)或核糖核蛋白(rnp)(例如，與pegrna復合的pe)而不是dna。rnp在細胞中的短壽命限制了脫靶編輯的機會。以前沒有報道過用于將pe?rnp遞送到體內(nèi)多個組織和器官的可概括的策略。因此，需要一種有效地將pe核糖核蛋白(rnp)遞送到有此需要的受試者的細胞、組織或器官中的方法，并且以通過限制和/或避免脫靶編輯而不犧牲靶標編輯來提高總體安全性的方式。

技術實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、本公開描述了病毒樣顆粒(vlp)的工程化以包裝引導編輯器(pe)、相關的引導編輯器向導rna(pegrna)和其他組分以實現(xiàn)有效的引導編輯。在一個方面，本公開提供了包含組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多蛋白和一種或多種融合蛋白的病毒樣顆粒(本文可互換地稱為“vlp”或“evlp”(“工程化病毒樣顆?！?)，其中gag-pro多蛋白和一種或多種融合蛋白通過脂質膜和病毒包膜糖蛋白包封，并且其中一種或多種融合蛋白中的每一種包含：(i)gag核衣殼蛋白；(ii)核輸出序列(nes)；(iii)可切割接頭；和(iv)核酸可編程dna結合蛋白(napdnabp)和/或包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域。在一些實施方案中，融合蛋白包含napdnabp和含有rna依賴性dna聚合酶活性的結構域兩者。在一些實施方案中，vlp包含含有napdnabp的第一融合蛋白和含有包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域的第二融合蛋白。在某些實施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含分裂內(nèi)含肽的一部分，以在將vlp遞送到靶細胞中之后促進napdnabp和包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域彼此融合。不受理論束縛，本文提供的vlp的組分在細胞膜處自組裝并按照自然發(fā)生的出芽機制出芽(例如，逆轉錄病毒出芽或其它包膜病毒的出芽機制)，以便從細胞中釋放完全成熟的vlp。一旦形成，gag-pol-pro切割gag-貨物的蛋白酶敏感接頭(即，[gag]-[可切割接頭]-[貨物]，其中貨物可以是例如pe-rnp)，從而在vlp內(nèi)釋放pe?rnp。因此，在各種實施方案中，本公開還提供了其中蛋白酶敏感性接頭已被切割的vlp(例如，產(chǎn)生兩種切割產(chǎn)物，其包含(i)包含gag核衣殼蛋白和核輸出序列的融合蛋白，和(ii)引導編輯器)。例如，本公開提供了vlp，其包含(i)組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多蛋白，(ii)引導編輯器蛋白質，其包含核酸可編程dna結合蛋白(napdnabp)和含有rna依賴性dna聚合酶活性的結構域(例如，逆轉錄酶)，和(iii)融合蛋白，其包含gag核衣殼蛋白和核輸出序列(nes)，其通過脂質膜和病毒包膜糖蛋白包封。在一些實施方案中，本公開提供了包含切割產(chǎn)物和未切割產(chǎn)物的混合物的vlp(即，一些引導編輯器已經(jīng)從gag蛋白切割并且是游離的，而一些尚未從gag蛋白切割)。在一些實施方案中，超過50％、超過60％、超過70％、超過80％或超過90％的引導編輯器已經(jīng)從vlp內(nèi)的gag蛋白切割。一旦將vlp施用于受體細胞并由所述受體細胞吸收，vlp的內(nèi)容物就被釋放，例如，釋放的pe?rnp。一旦在細胞中，rnp可以易位至細胞核(特別地，其中核定位信號(nls)與rnp連接)，其中dna編輯可以在由向導rna指定的靶位點處發(fā)生。本公開還提供了編碼本文所述的vlp的各種組分的多核苷酸和載體。

2、在另一方面，本公開提供了多種多核苷酸，其包含：(i)第一多核苷酸，其包含編碼病毒包膜糖蛋白的核酸序列的；(ii)第二多核苷酸，其包含編碼組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多蛋白的核酸序列；(iii)第三多核苷酸，其包含編碼一種或多種融合蛋白的核酸序列，其中該一種或多種融合蛋白中的每一種包含：(a)gag核衣殼蛋白；(b)核輸出序列(nes)；(c)可切割接頭；和(d)核酸可編程dna結合蛋白(napdnabp)和/或包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域；和(iv)第四多核苷酸，其包含編碼向導rna(grna)的核酸序列，其中該grna與由第三多核苷酸編碼的融合蛋白的napdnabp結合。在一些實施方案中，藥物組合物包含vlp，該vlp包含(i)組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多蛋白，(ii)引導編輯器蛋白質，其包含核酸可編程dna結合蛋白(napdnabp)和包含rna依賴性dna聚合酶活性(例如，逆轉錄酶)的結構域，和(iii)融合蛋白,其包含gag核衣殼蛋白和核輸出序列(nes)，其通過脂質膜和病毒包膜糖蛋白包封。

3、在另一方面，本公開提供了包含病毒樣顆粒(vlp)的藥物組合物，該病毒樣顆粒(vlp)包含組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多蛋白和一種或多種融合蛋白，其中gag-pro多蛋白和一種或多種融合蛋白通過脂質膜和病毒包膜糖蛋白包封，并且其中一種或多種融合蛋白中的每一種包含：(i)gag核衣殼蛋白；(ii)核輸出序列(nes)；(iii)可切割接頭；和(iv)核酸可編程dna結合蛋白(napdnabp)和/或包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域。

4、在另一方面，本公開提供了用于通過引導編輯在靶細胞中編輯核酸分子的方法，該方法包括使靶細胞與本文提供的任何組合物接觸，從而在靶位點處對核酸分子安裝一種或多種修飾。在一些實施方案中，細胞是哺乳動物細胞(例如，人細胞)。在一些實施方案中，細胞是來自獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)用途相關的動物的細胞。在一些實施方案中，細胞在受試者中。在某些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，對核酸分子的一種或多種修飾與減輕、緩解或預防疾病或病癥的癥狀相關。

5、在另一方面，本公開提供融合蛋白，其包含：(i)gag核衣殼蛋白；(ii)核輸出序列(nes)；(iii)可切割接頭；和(iv)核酸可編程dna結合蛋白(napdnabp)和/或包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域。在一些實施方案中，融合蛋白包含napdnabp和含有rna依賴性dna聚合酶活性的結構域兩者。在一些實施方案中，本公開提供了包含本文公開的第一融合蛋白和本文公開的第二融合蛋白的組合物，其中第一融合蛋白包含napdnabp，其中第二融合蛋白包含含有rna依賴性dna聚合酶活性的結構域。在某些實施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白各自包含分裂內(nèi)含肽的一部分以促進napdnabp和包含rna依賴性dna聚合酶活性的結構域彼此融合(例如，在將本文公開的vlp中的融合蛋白遞送到靶細胞中之后)。

6、在其他方面，本公開還提供了用于制備本文所述的pe-vlp的方法，以及用于引導編輯的方法，該方法包括將本文所述的pe-vlp遞送到靶細胞。還提供了包含本文所述的pe-vlp和融合蛋白的多核苷酸、載體、細胞和試劑盒。

7、在另一方面，本公開提供了通過將本文公開的任何多核苷酸或載體轉染、轉導、電穿孔或以其他方式插入到細胞中，并從多核苷酸或載體表達vlp的組分，從而允許病毒樣顆粒在細胞中自發(fā)組裝而產(chǎn)生的vlp。在一些實施方案中，本文所述的任何組合物、方法或細胞可以用于產(chǎn)生本文提供的vlp。

8、在另一方面，本公開提供了包含本文提供的任何vlp、多核苷酸、載體和融合蛋白的組合物。

9、在另一方面，本公開提供了使用本文提供的任何vlp、多核苷酸、組合物和融合蛋白在靶細胞中編輯核酸分子的方法。

10、在另一方面，本公開提供了包含本文所述的任何vlp、多核苷酸、載體、組合物和融合蛋白的細胞。

11、在另一方面，本公開提供了包含本文所述的任何vlp、多核苷酸、載體、組合物和融合蛋白的試劑盒。

12、應當理解，前述概念和下面討論的附加概念可以以任何合適的組合來排列，因為本公開在這方面不受限制。此外，當結合附圖考慮時，本公開的其他優(yōu)點和新穎特征將從以下各種非限制性實施方案的詳細描述中變得顯而易見。