本發(fā)明涉及生物，特別是涉及一種包膜病毒樣顆粒高效展示跨膜蛋白的方法。

背景技術：

1、跨膜蛋白是一類廣泛存在于生物體內(nèi)，能夠跨越細胞膜一次或多次的蛋白質(zhì)，以跨膜蛋白為靶點的創(chuàng)新藥研發(fā)一直是醫(yī)藥領域的研究熱點，其中離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白、g蛋白偶聯(lián)受體和激酶是藥物研發(fā)中最大的一類藥物靶點。然而跨膜蛋白的制備面臨著許多瓶頸，例如，跨膜蛋白通常嵌入到脂雙層中，因此在溶液中的溶解度往往較低；此外，跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)復雜，包含多個跨膜區(qū)域、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和糖基化修飾等，這些都增加了跨膜蛋白的制備難度。

2、病毒樣顆粒（vlp，virus-like?particle）來源于病毒的外層衣殼蛋白，由一種或者多種衣殼蛋白組分自動組裝形成的納米結(jié)構(gòu)的微小顆粒。vlp不含有病毒基因組，無感染性，同時還具有與天然病毒類似的結(jié)構(gòu)，此特殊的空間結(jié)構(gòu)能夠引起強烈的免疫應答反應，包括產(chǎn)生抗體和細胞介導的免疫反應。這樣的特性使得vlp具有廣泛的應用價值。vlp主要分為包膜病毒樣顆粒(evlp)和非包膜病毒樣顆粒(vlp)。當正確折疊的跨膜蛋白在細胞膜上表達時，包膜病毒的衣殼蛋白形成的病毒樣顆粒通過出芽的方式被包裹上攜帶有跨膜蛋白的細胞膜，形成evlp，將跨膜蛋白展示在evlp的表面，使這些復雜的跨膜蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘摹⒏邼舛鹊膃vlp形式的蛋白用于免疫和抗體篩選。

3、然而，通過evlp出芽的方式展示跨膜蛋白具有隨機性，同時相較于其他類型蛋白，跨膜蛋白通常表達量較低，只有正確地折疊且嵌入細胞膜位點上跨膜蛋白才能通過evlp展示，因此出芽形成的evlp中通常存在未展示跨膜蛋白或展示豐度較低的evlp，而后續(xù)evlp富集工藝也無法去除此部分evlp。低跨膜蛋白展示豐度的evlp在免疫動物后產(chǎn)生大量非特異性抗體，使得特異性抗體的篩選效率低。

4、所以目前缺乏能夠提高跨膜蛋白展示豐度的evlp技術，而提高evlp上跨膜蛋白的豐度，能夠增強實驗動物對跨膜蛋白免疫反應應答的效果和抗體篩選的效率，這將助力以跨膜蛋白為靶點的創(chuàng)新藥的研發(fā)。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種提高包膜病毒樣顆粒（evlp）展示跨膜蛋白或其功能片段豐度的方法，用于解決現(xiàn)有技術中的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供一種evlps展示跨膜蛋白或其功能片段的方法，包含如下步驟：將編碼目標蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白的基因，以及編碼包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的基因?qū)胨拗骷毎?，培養(yǎng)宿主細胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒樣顆粒。

3、所述編碼目標蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白的基因以核酸構(gòu)建體的形式導入宿主細胞，和/或，所述編碼包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的基因以核酸構(gòu)建體的形式導入宿主細胞。

4、本發(fā)明還提供一種vlp疫苗或vlp制劑，所述vlp疫苗或vlp制劑包含由上述方法獲得的已展示跨膜蛋白的病毒樣顆粒。

5、本發(fā)明還提供上述vlp制劑在制備抗體或篩選抗體中的用途。

6、如上所述，本發(fā)明一種提高包膜病毒樣顆粒展示跨膜蛋白或其功能片段豐度的方法，具有以下有益效果：基于evlp骨架蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)相互作用、目標跨膜蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)融合提高目標跨膜蛋白的膜定位，進而提高包膜病毒樣顆粒展示跨膜蛋白或其功能片段的效率；簡單的操作步驟減少了生產(chǎn)過程中的復雜性和成本；增強跨膜蛋白免疫反應應答的效果和抗體篩選的效率，促進以跨膜蛋白為靶點的創(chuàng)新藥的研發(fā)。

技術特征：

1.一種包膜病毒樣顆粒展示跨膜蛋白或其功能片段的方法，其特征在于，包含如下步驟：將編碼目標蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白的基因，以及編碼包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的基因?qū)胨拗骷毎?，培養(yǎng)宿主細胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒樣顆粒。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述跨膜蛋白為作為藥物靶點的跨膜蛋白。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述作為藥物靶點的跨膜蛋白為四次跨膜蛋白、七次跨膜蛋白或十一次跨膜蛋白。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述四次跨膜蛋白為claudin?6蛋白或cd20，或所述七次跨膜蛋白為gpcrs，或所述十一次跨膜蛋白為napi2b。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒樣顆粒骨架蛋白為hiv-1?gag蛋白、mlv?gag蛋白、siv?gag蛋白、fiv?gag蛋白、htlv-1?gag蛋白或htlv-1?gag蛋白中的一種或多種。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標蛋白為跨膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)或跨膜蛋白的功能片段的胞內(nèi)區(qū)。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.1所示的氨基酸序列。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，編碼gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的核苷酸序列如seq?idno.3所示的核苷酸序列。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，編碼包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.4所示的核苷酸序列。

11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述編碼目標蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白的基因以核酸構(gòu)建體的形式導入宿主細胞，和/或，所述編碼包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的基因以核酸構(gòu)建體的形式導入宿主細胞。

12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下條件中的任一項或多項：

13.一種vlp制劑，其特征在于，所述vlp制劑包含如權(quán)利要求1~12任一所述方法獲得的已展示跨膜蛋白的包膜病毒樣顆粒。

14.如權(quán)利要求13所述的vlp制劑在制備抗體或篩選抗體中的用途。

技術總結(jié)
本發(fā)明提供一種提高包膜病毒樣顆粒展示跨膜蛋白豐度的方法，包含如下步驟：將編碼目標蛋白與gp41蛋白胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白的基因，以及編碼包膜病毒樣顆粒骨架蛋白的基因?qū)胨拗骷毎囵B(yǎng)宿主細胞以出芽形成展示有跨膜蛋白或其功能片段的包膜病毒樣顆粒。此方法在不影響跨膜蛋白構(gòu)象的基礎上，提高了包膜病毒樣顆粒展示跨膜蛋白或其功能片段的豐度。

技術研發(fā)人員：張瑜,崔利蘭,徐志豪,高凡,石加加
受保護的技術使用者：蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/21