本發(fā)明屬于乳酸菌，具體涉及動物雙歧桿菌乳亞種制備及其應用。

背景技術：

1、動物雙歧桿菌乳亞種?bifidobacterium?animalis?subsp.?lactis是一種常用于食品生產(chǎn)的乳酸菌。曾被稱為乳雙歧桿菌，具有革蘭氏陽性桿菌且具有多種形態(tài)，其形態(tài)主要特征是有分叉的桿菌。動物雙歧桿菌乳亞種主要分布于人體腸道中，部分牲畜如豬、狗的消化道中也有分布。動物雙歧桿菌乳亞種分類上屬于乳酸菌雙歧桿菌屬，通常被認為具有促進機體生長、維持腸道菌群平衡、增強免疫能力和抑制有害菌群生長的功能。值得注意的是，不同的乳酸菌株在功能和應用上有側重點。我們開發(fā)的動物雙歧桿菌乳亞種dd26經(jīng)動物試驗發(fā)現(xiàn)是一株具有增強免疫力功能的菌株。

2、乳酸菌對機體有許多有益作用，乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)是其一項突出的重要功能。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)作用就是通過調(diào)節(jié)宿主的免疫系統(tǒng)增強免疫功能。近年來的研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌中幾種特定基因化合物介導了免疫調(diào)節(jié)作用。乳酸菌對宿主免疫生物學影響的研究表明乳酸菌調(diào)節(jié)免疫的機制是調(diào)節(jié)系統(tǒng)和黏膜免疫細胞以及腸道上皮細胞。乳酸菌對免疫系統(tǒng)的具有直接調(diào)節(jié)作用，乳酸菌能夠與巨噬細胞、樹突狀細胞等固有免疫細胞表面的模式識別受體相互作用，激活細胞內(nèi)的信號通路，促進細胞因子的分泌和吞噬功能的增強；乳酸菌增強腸道黏膜屏障的完整性，促進黏蛋白的分泌和緊密連接蛋白的表達，減少病原體的入侵，誘導腸道黏膜固有層中免疫細胞的活化和免疫球蛋白?a（iga）的分泌，形成局部的免疫防御。乳酸菌對免疫系統(tǒng)具有間接調(diào)節(jié)作用，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸、短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)腸道?ph?值，為有益菌群的生長創(chuàng)造有利環(huán)境，同時抑制有害菌的繁殖，間接影響免疫系統(tǒng)的平衡；乳酸菌能改善腸道菌群的組成和多樣性，增加有益菌的豐度，促進菌群代謝產(chǎn)物的生成，如丁酸等，這些代謝產(chǎn)物可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的分化和功能，影響免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。乳酸菌可以調(diào)控宿主細胞中的基因表達和信號通路。小鼠動物試驗表明乳酸菌能有效地促進小鼠胸腺的生長。胸腺是人體重要免疫器官之一，能促進t淋巴細胞的增殖，增強免疫。這也從另一方面說明乳酸菌可以通過增強免疫力來抑制病原菌的增殖。乳酸菌在維持必要防御機制和過度防御機制包括先天性和適應性免疫反應之間的平衡方面發(fā)揮著重要的作用。乳酸菌具有治療與免疫應答相關疾病的潛力，如過敏性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種具有增強免疫力功能的動物雙歧桿菌乳亞種制備及其應用。

2、一種動物雙歧桿菌乳亞種，所述動物雙歧桿菌乳亞種?dd26已于2024年06月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc?no.?30870。

3、進一步的，所述的動物雙歧桿菌乳亞種dd26菌株干燥菌粉由中國科學院微生物研究所進行了菌種鑒定；

4、試驗項目包括細胞形態(tài)和理化試驗，分子生物學鑒定（16s?rrna基因序列測定和tuf基因序列測定），抗生素敏感性實驗，菌種穩(wěn)定性評價；

5、實驗結果顯示：f1代測序和f5代測序16s?rrna基因序列和tuf基因序列結果相同。圖1為f1代和f5代tuf基因序列對比圖。

6、本發(fā)明的動物雙歧桿菌乳亞種dd26菌株經(jīng)中國科學院微生物研究所檢測鑒定結果結論如下：

7、在本實驗室條件下，根據(jù)送檢菌種的細胞形態(tài)、生理生化實驗、16s?rrna基因和tuf基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，江蘇徳禧生物科技有限公司送檢菌種(菌株編號:dd26)鑒定結果為:?動物雙歧桿菌乳亞種bifidobacteriumanimalis?subsp.?lactis。

8、本發(fā)明的動物雙歧桿菌乳亞種dd26菌株由中國科學院微生物研究所菌種穩(wěn)定性評價結論如下：

9、經(jīng)連續(xù)5代傳代培養(yǎng)后，進行對比實驗，送檢菌種的形態(tài)特征、理化特征等分類鑒定形狀，以及抗生素敏感性未發(fā)現(xiàn)可見變化。說明送檢菌種的性狀可穩(wěn)定遺傳。

10、一種所述的動物雙歧桿菌乳亞種的工作菌株制備的方法，由以下步驟制備而成：

11、取含有動物雙歧桿菌乳亞種dd26菌株的樣品，加入液體活化培養(yǎng)基中，于厭氧箱35-38℃恒溫培養(yǎng)10-12h。(2)?取上述活化好的菌液，接種至茄子瓶斜面內(nèi)；每支茄子瓶斜面接種200μl菌液，于厭氧箱35-38℃下培養(yǎng)20-24h。(3)用20ml保護劑將茄子瓶斜面培養(yǎng)基上菌苔刮下，混合均勻，分裝于無菌旋蓋凍存管中于-80℃保存，得動物雙歧桿菌乳亞種dd26工作菌株。

12、進一步的，所述的液體活化培養(yǎng)基配方組成包括為蛋白胨、酵母粉、葡萄糖（一水）、氯化鈉、無水乙酸鈉、l-半胱氨酸鹽酸鹽（一水）、純化水；調(diào)節(jié)ph6.8±0.1，分裝后121℃滅菌20min。所述的茄子瓶斜面培養(yǎng)基配方組成為蛋白胨、酵母粉、葡萄糖（一水）、氯化鈉、無水乙酸鈉、l-半胱氨酸鹽酸鹽（一水）、純化水、瓊脂條；調(diào)節(jié)ph6.8±0.1，分裝后121℃滅菌20min所述的保護劑配方組成為脫脂乳粉、酵母粉、l-半胱氨酸鹽酸鹽（一水）、純化水；調(diào)節(jié)ph6.5±0.1，分裝后115℃滅菌20min。

13、一種所述的動物雙歧桿菌乳亞種凍干粉的制備方法，由以下步驟制備而成：

14、一種動物雙歧桿菌乳亞種發(fā)酵方法，包括：

15、將動物雙歧桿菌乳亞種菌種接種到茄子瓶固體培養(yǎng)基上進行活化；

16、將經(jīng)過活化的所述菌種移種到一級液體培養(yǎng)基中進行擴培；

17、將經(jīng)過擴培的所述一級菌種移種到二級液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；

18、將經(jīng)過發(fā)酵的所述二級菌種移種到三級液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵液過濾得到動物雙歧桿菌乳亞種菌泥；

19、所述活化固體培養(yǎng)基使用mrs配方。

20、所述一級液體培養(yǎng)基配方為酵母粉10-12.5g/l、一水合葡萄糖4-6g/l、蛋白胨4-6g/l、氯化鈉2-4g/l、無水乙酸鈉2-4g/l。調(diào)節(jié)ph為6.8。

21、所述二級液體培養(yǎng)基配方為酵母粉16-20g/l、一水合葡萄糖20-25g/l、蛋白胨16-20g/l、無水乙酸鈉2-4g/l、低聚半乳糖2-4g/l。調(diào)節(jié)ph為6.8。

22、所述三級級液體培養(yǎng)基配方為酵母粉16-20g/l、一水合葡萄糖14-18g/l、蛋白胨15-20g/l、無水乙酸鈉2-4g/l、低聚半乳糖3-5g/l。調(diào)節(jié)ph為6.8。

23、在發(fā)酵過程中，向所述二級、三級液體培養(yǎng)基補充3m氫氧化鈉溶液；二級液體培養(yǎng)基ph在5-6.5，od600值大于1.5；三級液體培養(yǎng)基ph在5-6.5，od600值大于2。

24、在一個具體的可實施方案中，包括：

25、s1、取動物雙歧桿菌乳亞種dd26菌種按體積比為1：（8-10）的比例接種到固體培養(yǎng)基上，之后置于37℃無氧的環(huán)境下活化24h；

26、s2、將經(jīng)活化的菌種按照60cm2固體培養(yǎng)基接種（200-300）ml液體培養(yǎng)基的接種比例移種到一級液體培養(yǎng)基中，之后置于37℃無氧的環(huán)境下擴培12h；

27、s3、將經(jīng)擴培的菌種按照（2-3）vol%的接種量移種到二級液體培養(yǎng)基中，之后置于37℃無氧的環(huán)境下發(fā)酵8-12h；在發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐通入氮氣，并向二級液體培養(yǎng)基中流加3m氫氧化鈉，控制二級液體培養(yǎng)基的ph在5-6.5；

28、s4、發(fā)酵時間大于8h，發(fā)酵液取樣并檢測od600，當od600大于1.5，即可判斷為二級發(fā)酵完成；

29、s5、將經(jīng)發(fā)酵的二級菌種按照（4-5）vol%的接種量移種到三級級液體培養(yǎng)基中，之后置于37℃無氧的環(huán)境下發(fā)酵10-14h；在發(fā)酵過程中，發(fā)酵罐通入氮氣，并向三級級液體培養(yǎng)基中流加3m氫氧化鈉，控制二級液體培養(yǎng)基的ph在5-6.5；

30、s6、發(fā)酵時間大于10h，發(fā)酵液取樣并檢測od600，當od600大于2.0并且不再明顯增加，即可判斷為發(fā)酵終點并停止發(fā)酵。發(fā)酵液檢測活菌數(shù)。

31、通過采用上述技術方案，優(yōu)化了動物雙歧桿菌乳亞種的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，有利于獲得理想的動物雙歧桿菌乳亞種發(fā)酵培養(yǎng)效果。

32、在一個具體的可實施方案中，所述s3中，發(fā)酵時以60-100rpm速度對二級液體培養(yǎng)基進行攪拌；所述s4中，發(fā)酵時以60-100rpm速度對三級液體培養(yǎng)基進行攪拌。

33、一種動物雙歧桿菌乳亞種離心及凍干方法，包括：

34、s7、收集菌體：將所述動物雙歧桿菌乳亞種發(fā)酵液進行離心，棄去上清液，獲得動物雙歧桿菌乳亞種菌泥；

35、s8、配制保護劑：保護劑由以下重量份的原料配制滅菌而成：麥芽糊精4-6份、海藻糖1-3份、抗性糊精2-4份和d抗壞血酸鈉0.5-1份，余量為純化水；

36、s9、真空冷凍干燥：將所述動物雙歧桿菌乳亞種菌泥與保護劑混合制得乳化液；將所述乳化液進行真空冷凍干燥，至菌粉水分小于5%完成，制成凍干菌粉60目篩網(wǎng)粉碎，真空包裝后進行儲存。

37、通過采用上述技術方案，在真空冷凍干燥時加入保護劑，可以保護菌種免受低溫的侵害，從而進一步增強菌種的存活率。

38、在一個可具體的實施方案中，所述動物雙歧桿菌乳亞種菌泥與保護劑的質(zhì)量比為1：（1-2）。

39、通過采用上述技術方案，優(yōu)化動物雙歧桿菌乳亞種菌泥與保護劑的質(zhì)量比，有利于增強乳酸菌菌種冷凍干燥后的存活率。

40、在一個具體的可實施方案中，所述動物雙歧桿菌乳亞種離心工藝還包括菌泥清洗，具體為：管道式離心得到的菌泥用等體積的無菌生理鹽水洗滌，在轉速為3000-5000r/min，離心3-5min棄去上清液得到雙歧桿菌乳亞種菌泥。

41、本發(fā)明的動物雙歧桿菌乳亞種dd26具有增強免疫力的功能。