背景技術(shù)：

1、微生物胞外多糖對(duì)生產(chǎn)細(xì)胞(producing?cell)具有多種保護(hù)功能，例如抵御干旱、毒素和非生物脅迫，截留營(yíng)養(yǎng)物和胞外酶，作為細(xì)胞對(duì)表面的粘附物，以及通過(guò)創(chuàng)建如生物膜中所見(jiàn)的繁殖傳導(dǎo)微環(huán)境來(lái)維持結(jié)構(gòu)目的。

2、因此，胞外多糖是改善有益微生物在表面的存活和定植的有用工具，例如在植物處理中。胞外多糖的產(chǎn)生防止或減少例如葉上的植物有益微生物被雨水或風(fēng)沖走，并改善葉、枝條和根表面的定植。例如，這在植物有益類芽孢桿菌屬的應(yīng)用中是有利的，類芽孢桿菌屬的植物表面定植使得植物顯著地抵御真菌病原體，同時(shí)改善根的營(yíng)養(yǎng)物攝取。例如，多粘類芽孢桿菌a26的生物膜多糖能夠拮抗禾谷鐮孢(timmusk?s,copolovici?d,copolovicil,teder?t,nevo?e,behers?l.paenibacillus?polymyxa?biofilm?polysaccharidesantagonise?fusarium?graminearum.[多粘類芽孢桿菌生物膜多糖拮抗禾谷鐮孢]scirep.[科學(xué)報(bào)告]2019年1月24日；9(1):662.doi:10.1038/s41598-018-37718-w)。一些類芽孢桿菌屬物種的生物膜形成可以有效地幫助它們定植在植物根部，并幫助宿主植物在惡劣條件下適應(yīng)和存活。

3、此外，胞外多糖和產(chǎn)生胞外多糖的微生物可以例如通過(guò)吸水和通過(guò)向植物提供氨來(lái)增強(qiáng)土壤肥力并提高產(chǎn)量一致性。在這種情況下，胞外多糖可以幫助在細(xì)菌周圍建立微親氣環(huán)境，因此可以使微生物固定大氣氮所需的氧敏感酶固氮酶具有活性。

4、胞外多糖的其他應(yīng)用依賴于它們改變液體流變特性的能力，特別是它們通過(guò)同時(shí)具有生物可降解性來(lái)增加粘度的能力。例如，這可用于地下石油和天然氣提取、化妝品、食物、飼料和藥物制劑。例如，胞外多糖在組織工程、藥物遞送和傷口敷料中用作支架或基質(zhì)(nwodo?uu,green?e,okoh?ai.bacterial?exopolysaccharides:functionality?andprospects.[細(xì)菌胞外多糖：功能和前景]int?j?mol?sci.[國(guó)際分子科學(xué)雜志]2012；13(11):14002-14015.公開(kāi)于2012年10月30日.doi:10.3390/ijms131114002)。此外，來(lái)自類芽孢桿菌屬物種的胞外多糖用作抗腫瘤劑、抗氧化劑或絮凝劑(he?x,li?q,wang?n,chens.effects?of?an?eps?biosynthesis?gene?cluster?of?paenibacillus?polymyxa?wly78on?biofilm?formation?and?nitrogen?fixation?under?aerobic?conditions.[需氧條件下多粘類芽孢桿菌wly78的eps生物合成基因簇對(duì)生物膜形成和固氮的影響]microorganisms.[微生物]2021年1月30日；9(2):289.doi:10.3390/microorganisms9020289)，這表明微生物胞外多糖具有廣泛的生物技術(shù)和工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。胞外多糖由糖單元構(gòu)成，可以僅由一種單體(例如，多糖果聚糖(levan)中的果糖)組成，也可以由不同的單體組成。多糖的實(shí)例特別是但不限于葡聚糖、果聚糖(fructan)、凝結(jié)多糖、結(jié)冷膠(gellan)、黃原膠、生物乳化劑(emulsan)、葡萄聚糖、纖維素、褐藻膠(aliginate)、可拉酸(colonic?acid)、凝結(jié)多糖、葡萄聚糖、迪特膠(diutan)、果聚糖(levan)、琥珀酰聚糖、威藍(lán)膠(welan)及其組合。相應(yīng)地，以下文獻(xiàn)已經(jīng)描述了胞外多糖產(chǎn)生的制造材料和方法：出版物wo?2015118516和wo?2016044768描述了使用胞外多糖的土壤接種，特別是用于改善土壤肥力；出版物wo?2020163251描述了胞外多糖用于改善產(chǎn)量一致性的應(yīng)用；出版物wo?2014176061描述了胞外多糖用于處理地下地層(subterraneous?formation)的應(yīng)用，特別是在石油和天然氣提取中；并且出版物wo?2014160350描述了使用胞外多糖處理廢水。wo2017151742中描述了用于胞外多糖沉淀和將植物有益微生物截留在其中的材料和方法。參與多粘類芽孢桿菌胞外多糖產(chǎn)生的基因和代謝已在rütering等人,tailor-madeexopolysaccharides-crispr-cas9?mediated?genome?editing?in?paenibacilluspolymyxa[定制胞外多糖-crispr-cas9介導(dǎo)的多粘類芽孢桿菌基因組編輯],syntheticbiology[合成生物學(xué)]2017,doi:10.1093/synbio/ysx007中進(jìn)行了詳細(xì)研究，該文獻(xiàn)以其全文并入本文，特別是作為多粘類芽孢桿菌的胞外多糖糖單體組成和參與胞外多糖合成的基因的參考。

5、除了這些好處外，胞外多糖是工業(yè)液相發(fā)酵中引起關(guān)注的主要原因。由于胞外多糖引起的發(fā)酵培養(yǎng)基粘度的增加，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)移速率會(huì)降低，從而降低發(fā)酵產(chǎn)率并需要更高的能量來(lái)攪拌發(fā)酵培養(yǎng)基。因此，通常嘗試減少或消除微生物中的胞外多糖產(chǎn)生。

6、許多微生物在發(fā)酵過(guò)程中主要在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)中產(chǎn)生胞外多糖。在后期發(fā)酵階段，特別是在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)，胞外多糖被降解并作為營(yíng)養(yǎng)物消耗，從而回收消耗在胞外多糖產(chǎn)生上的一些代謝能。因此，發(fā)酵液的最大胞外多糖含量經(jīng)常先于目標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)物的最大含量出現(xiàn)。例如，在類芽孢桿菌屬發(fā)酵中，最大粘度且因此最大胞外多糖含量在達(dá)到殺鐮孢菌素(fusaricidin)a、b或d的最大含量之前達(dá)到，因此需要用胞外多糖含量交換殺鐮孢菌素含量。這顯然是不期望的，特別是在植物保護(hù)應(yīng)用中。此外，在收獲后發(fā)酵液的儲(chǔ)存過(guò)程中，胞外多糖通常在幾小時(shí)或幾天內(nèi)從細(xì)胞或剩余的酶中降解。因此，為了獲得高水平的胞外多糖，下游加工通常對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格。

7、因此，本發(fā)明的目的是減輕或彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)。特別地，本發(fā)明的目的是提供包含等位基因的改變的核酸，相比于相應(yīng)的野生型，這些核酸使得相應(yīng)的微生物在發(fā)酵液中產(chǎn)生更高的胞外多糖含量。此外，本發(fā)明的目的是提供這樣的核酸、等位基因和微生物，與相應(yīng)的野生型相比，它們?cè)试S在發(fā)酵后期增加發(fā)酵罐內(nèi)容物中胞外多糖的含量，優(yōu)選地當(dāng)除了微生物產(chǎn)生的胞外多糖之外的至少一種目標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)物(優(yōu)選地抗微生物物質(zhì))的最大含量可獲得時(shí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進(jìn)一步包含突變體spo0a基因的微生物，其中該微生物表現(xiàn)出增加的和/或穩(wěn)定的胞外多糖產(chǎn)生和/或減少的胞外多糖降解。

2、本發(fā)明還提供了增加或穩(wěn)定微生物胞外多糖產(chǎn)生或減少或防止微生物胞外多糖降解的方法，該方法包括在該微生物中提供以下中的一種或多種的步驟：

3、a)突變體degu基因，其中

4、-該degu基因編碼具有降低的dna結(jié)合活性和/或缺乏功能性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的degu蛋白，和/或

5、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對(duì)每個(gè)替代方案aa)和ab)的優(yōu)選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

6、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

7、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；

8、b)突變體degs基因，其中

9、-該degs基因編碼缺乏功能性單結(jié)合結(jié)構(gòu)域、功能性磷酸受體結(jié)構(gòu)域和/或功能性atp酶結(jié)構(gòu)域的degs蛋白，和/或

10、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成；

11、c)突變體spo0a基因，其中

12、ca)該突變位于dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域或接收結(jié)構(gòu)域，并導(dǎo)致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

13、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

14、-a257v、更優(yōu)選地a257s，

15、-i161r、更優(yōu)選地i161l，

16、-按優(yōu)選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r。

17、本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，其包含用于表達(dá)以下中的一種或多種的表達(dá)盒：

18、a)突變體degu基因，其中

19、-該degu基因編碼具有降低的dna結(jié)合活性和/或缺乏功能性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的degu蛋白，和/或

20、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對(duì)每個(gè)替代方案aa)和ab)的優(yōu)選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

21、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

22、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；

23、b)突變體degs基因，其中

24、-該degs基因編碼缺乏功能性單結(jié)合結(jié)構(gòu)域、功能性磷酸受體結(jié)構(gòu)域和/或功能性atp酶結(jié)構(gòu)域的degs蛋白，和/或

25、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成；

26、c)突變體spo0a基因，其中

27、ca)該突變位于dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域或接收結(jié)構(gòu)域，并導(dǎo)致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

28、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

29、-a257v、更優(yōu)選地a257s，

30、-i161r、更優(yōu)選地i161l，

31、-按優(yōu)選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r。

32、此外，本發(fā)明提供了改善植物健康的方法，該方法包括將包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進(jìn)一步包含突變體spo0a基因的微生物(其中該微生物表現(xiàn)出增加的和/或穩(wěn)定的胞外多糖產(chǎn)生和/或減少的胞外多糖降解)施用于

33、a)植物材料和/或

34、b)植物培養(yǎng)基質(zhì)。

35、本發(fā)明還提供了產(chǎn)生胞外多糖的方法，該方法包括：

36、i)培養(yǎng)包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進(jìn)一步包含突變體spo0a基因的微生物，其中該微生物表現(xiàn)出增加的和/或穩(wěn)定的胞外多糖產(chǎn)生和/或減少的胞外多糖降解，以及

37、ii)任選地將該微生物與該胞外多糖分離。

38、本發(fā)明還提供了

39、以下物質(zhì)的用途：包含突變體degu基因和/或突變體degs基因，以及任選地進(jìn)一步包含突變體spo0a基因的微生物，其中該微生物表現(xiàn)出增加的和/或穩(wěn)定的胞外多糖產(chǎn)生和/或減少的胞外多糖降解，

40、或degu基因或蛋白，其中

41、-該degu基因編碼具有降低的dna結(jié)合活性和/或缺乏功能性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的degu蛋白，和/或

42、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對(duì)每個(gè)替代方案aa)和ab)的優(yōu)選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

43、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

44、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a，

45、和/或degs基因或degs蛋白，其中

46、-該degs基因編碼缺乏功能性單結(jié)合結(jié)構(gòu)域、功能性磷酸受體結(jié)構(gòu)域和/或功能性atp酶結(jié)構(gòu)域的degs蛋白，和/或

47、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成，

48、和/或spo0a基因或spo0a蛋白，其中

49、ca)該突變位于dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域或接收結(jié)構(gòu)域，并導(dǎo)致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

50、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

51、-a257v、更優(yōu)選地a257s，

52、-i161r、更優(yōu)選地i161l，

53、-按優(yōu)選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r，

54、用于以下中任一項(xiàng)：

55、-胞外多糖組合物的產(chǎn)生，

56、-植物、植物葉、植物根和/或植物種子的處理，

57、-土壤接種，優(yōu)選地用于增強(qiáng)土壤肥力，

58、-產(chǎn)量一致性的改善，

59、-地下地層的處理，

60、-廢水的處理，

61、-藥物或化妝品載劑的制備，

62、-藥物或化妝品組合物的制備，

63、-皮膚水合組合物的制備，

64、-食物或飼料添加劑的制備，

65、-抗腫瘤劑的制備，

66、-抗氧化劑的制備，

67、-絮凝劑的制備。

68、本發(fā)明還提供了以下中的一種或多種：

69、a)突變體degu基因，其中

70、-該degu基因編碼具有降低的dna結(jié)合活性和/或缺乏功能性dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的degu蛋白，和/或

71、-該degu基因編碼degu蛋白，其中突變按對(duì)每個(gè)替代方案aa)和ab)的優(yōu)選性的遞減順序包含以下中的一種或多種或由其組成：

72、aa)q218*、q218k、q218n、q218d、q218r，和/或

73、ab)d223*、d223*+m220n、d223*+m220n+e221g、d223*+m220n+v222g、d223*+m220n+e221g+v222g、d223*+m220d、d223*+m220e、d223*+m220h、d223*+m220f、d223*+m220w、d223*+m220s、d223*+m220a；

74、b)突變體degs基因，其中

75、-該degs基因編碼缺乏功能性單結(jié)合結(jié)構(gòu)域、功能性磷酸受體結(jié)構(gòu)域和/或功能性atp酶結(jié)構(gòu)域的degs蛋白，和/或

76、-該degs基因編碼degs蛋白，其中該突變包含l99f、l99c、l99d、l99e、l99g、l99h、l99k、l99n、l99p、l99q、l99r、l99s、l99w或l99y或由其組成；

77、c)突變體spo0a基因，其中

78、ca)該突變位于dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域或接收結(jié)構(gòu)域，并導(dǎo)致spo0a蛋白磷酸化的減少或消除和/或二聚化的減少或消除，和/或

79、cb)該突變由以下中的任一種組成或包含以下中的任一種：

80、-a257v、更優(yōu)選地a257s，

81、-i161r、更優(yōu)選地i161l，

82、-按優(yōu)選性的遞減順序：a257s+i161i、a257a+i161l、a257v+i161i、a257s+i161f或a257a+i161r，

83、用于增加或穩(wěn)定微生物胞外多糖產(chǎn)生或防止該微生物胞外多糖降解的用途，該微生物選自厚壁菌門(phylum?firmicutes)，芽孢桿菌綱、梭菌綱或厚壁菌綱(negativicutes)的分類等級(jí)中的任一種。