草水提物 100mg/kg組、夏枯草水提物200mg/kg組，每組16只。另外未i.pSTZ的16只正常C57小 鼠作為正常組（Control組）。每兩周檢測一次體重和血糖變化。
[0047] (3)造模成功1個月后開始給藥（0.lml/10g)，夏枯草水提物100mg/kg組、夏枯 草水提物200mg/kg組分別給予不同濃度的夏枯草水提物溶液，終劑量分別為：100mg/kg， 200mg/kg，M〇del組給予同體積的溶媒對照，給藥1個月后每組取6只小鼠進行伊文氏藍實 驗，其它剩余10只小鼠用戊巴比妥鈉（30mg*kg-l，腹腔）麻醉，從腹主動脈取血，并摘取眼 球，迅速剝離視網(wǎng)膜組織后冷凍儲存?zhèn)溆谩?br>[0048] 2. 1. 4伊文氏藍滲漏實驗：將伊文氏藍溶解于PBS中，配制濃度為0. 2g?L1的溶 液。小鼠腹腔注射（l〇ul?g4配制的伊文氏藍溶液，注射后2h用PBS灌注小鼠左心室徹 底去除血管內(nèi)殘留的伊文氏藍染料，然后迅速摘取眼球剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜組織置離心管中，將視 網(wǎng)膜組織冷凍干燥后稱取重量，接下來將視網(wǎng)膜組織與120ul甲酰胺在70°C孵育18h提取 伊文氏藍染料，將該提取液離心兩次（l〇〇〇〇g，4°C)，小心吸取合并上清，使用分光光度計 在620nm測定該上清液的吸光度值。伊文氏藍染料在甲酰胺提取物中的量是根據(jù)預(yù)先制作 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得，結(jié)果以伊文氏藍含量除以干燥視網(wǎng)膜重量的形式表達。
[0049] 2. 1. 5酶聯(lián)免疫分析實驗：全血于室溫靜置2h后，于4°C，4000g離心15min，分離 上層血清，按照試劑盒說明書檢測TNF-a和IL-10的含量。
[0050] 2. 1. 6胞漿胞核蛋白的提取：根據(jù)試劑盒使用說明，用胞漿/胞核蛋白抽提試劑盒 提取視網(wǎng)膜組織中胞漿和胞核部分的蛋白，并使用BCA蛋白定量試劑盒測定樣本的蛋白濃 度，將所有樣品統(tǒng)一到相等的蛋白濃度。
[0051] 2. 1. 7蛋白電泳實驗：制備好的蛋白樣本通過SDS-PAGE膠進行電泳，將膠上蛋白 轉(zhuǎn)印至？￥0?膜，用含5%脫脂牛奶的1851'溶液封閉111后，加入一抗，4°(：孵育過夜。洗去 一抗后，與二抗室溫孵育lh，TBST洗去過量抗體后，加入化學(xué)發(fā)光液進行顯像，蛋白條帶用 GeneTools圖像分析軟件進行定量。
[0052] 2. 1. 8統(tǒng)計分析：實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤（J士S )表示，采用SPSS16. 0統(tǒng)計軟 件進行分析，以O(shè)ne-WayAN0VA方式進行方差分析，兩兩比較采用LSD法，P〈0. 05表示差異 具有顯著性
[0053] 2. 2實驗結(jié)果
[0054] 2. 2. 1夏枯草水提物（PV)對糖尿病小鼠血糖和體重的影響
[0055] 從圖1可見，夏枯草水提物各劑量組均不能改善糖尿病小鼠體重的減輕，也不能 降低升高的血糖。說明夏枯草水提物沒有明顯改善糖尿病的藥效活性。
[0056] 2. 2. 2夏枯草水提物（PV)對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜BRB滲漏的影響
[0057] 由圖2可見，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中伊文氏藍滲漏值明顯升高 (P〈0. 001)，而PVdOOdOOmg.kg1)均對此有顯著的改善作用（P〈0. 001)。血視網(wǎng)膜屏障 (BRB)的損壞是非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病的特征，我們的研究表明：夏枯草水提物可以緩 解BRB損傷導(dǎo)致的滲漏，因此具有改善糖尿病視網(wǎng)膜病，特別是非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病 的藥效活性。
[0058] 2. 2. 3夏枯草水提物（PV)降低糖尿病小鼠血清中升高的IL-1 0、TNF-a含量
[0059] 由圖3所示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清中白介素-10 (IL-10)、腫瘤壞死因 子-<1〇'陬-€〇含量明顯高于正常組（?〈0.05)。與其對比，？￥(100,2001^，1^ 1)給藥后血 清中IL-10、TNF-a含量的升高均得到不同程度的降低（P〈0.01，P〈0.05，P〈0.001)。我們 的研究表明：夏枯草水提物通過抑制促炎因子的釋放，抵御視網(wǎng)膜炎性損傷，改善了糖尿病 視網(wǎng)膜病。
[0060] 2. 2. 4夏枯草水提物（PV)對糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中Iba-1表達、NF-kBp65磷酸化 及核轉(zhuǎn)位的影響
[0061] 如圖4A和4B可見，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織中Iba-1蛋白表達明顯上調(diào) (P〈0. 001)。與之相比，PV(100、200mg，kg4給藥后明顯降低了視網(wǎng)膜組織中升高的Iba-1 表達（P〈0. 001)。Ibal是神經(jīng)小膠質(zhì)細胞活化的標(biāo)志物，已有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的 活化及其介導(dǎo)的炎性損傷在糖尿病視網(wǎng)膜病發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用。我們的 研究表明：夏枯草水提物通過抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細胞的激活，從而抑制了視網(wǎng)膜的炎性損傷。
[0062] 如圖5A-C所示，與正常組比較，STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠視網(wǎng)膜組織中磷酸化NF- k B P65蛋白的表達明顯增加（P〈0.001)，并且胞核中NF-kB p65蛋白的表達也明顯增加 (P〈0.001)。與之相比，PVdOOJOOmg.kg1)給藥后可以降低升高的磷酸化NF-kB p65 蛋白的表達（P〈〇.05,P〈0. 001)，同時也降低了胞核中增加的NF-kB p65蛋白的表達 (P〈0. 001)，但對胞漿中p65蛋白的表達無明顯的影響。NF- kB是機體重要的炎性損傷調(diào)控 因子，我們的研究表明：夏枯草水提物通過抑制NF-kB信號通路，從而抑制了糖尿病視網(wǎng) 膜病過程中視網(wǎng)膜的炎性損傷。
[0063] 實施例3:不同批次夏枯草水提物改善糖尿病視網(wǎng)膜病的藥效活性
[0064] 3. 1實驗材料和方法
[0065] 3. 1. 1動物：SPF級C57小鼠，雄性，體重18_24g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中 心。動物合格證編號：SCXK(滬）2012-0002。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，飼養(yǎng)一 周后使用。飼養(yǎng)條件為：溫度22±1°C，濕度55±5%，12小時光暗循環(huán)，飼料與水消毒后自 由攝取。實驗嚴(yán)格按照國家和上海中醫(yī)藥大學(xué)動物中心動物使用管理條例進行。
[0066] 3. 1. 2藥物的配制：取適量不同批次的夏枯草水提物（按實施例1制備）浸膏溶 于生理鹽水中，灌胃給藥，濃度為l〇〇mg/kg。
[0067] 3. 1. 3動物實驗：
[0068] (1)將0. 1M檸檬酸溶液與檸檬酸三鈉溶液以14:11的比例混勾，調(diào)混合液PH至 4. 3-4. 5,待用。稱取適量STZ粉末，避光溶解，使之成為5. 5mg/ml的溶液，立即給予已禁食 12h的小鼠腹腔注射，0.lml/10g，最終給予STZ的劑量為55mg/kg，連續(xù)給藥5天。
[0069] (2)末次給藥一周后用割尾法測小鼠血糖濃度，血糖值彡16. 7mmol/L(250mg/dl) 視為造模成功。將造模成功的小鼠隨機分為5組：DR模型組（DRmodel組）、夏枯草水提 物（PV)組、夏枯草水提物-l(PV-l)組，夏枯草水提物-2(PV-2)組，夏枯草水提物-3(PV-3) 組，每組6只。另外未i.pSTZ的6只正常C57小鼠作為正常組（Control組）。
[0070] (3)造模成功1個月后開始給藥（0.lml/10g)，分別給予不同批次的夏枯草水提物 溶液，劑量為：100mg/kg，M〇del組給予同體積的溶媒對照，給藥1個月后進行伊文氏藍實驗 檢測血視網(wǎng)膜屏障（BRB)的滲漏。
[0071] 3. 1. 4伊文氏藍滲漏實驗：將伊文氏藍溶解于PBS中，配制濃度為0. 2g?L1的溶 液。小鼠腹腔注射（l〇ul?g4配制的伊文氏藍溶液，注射后2h用PBS灌注小鼠左心室徹 底去除血管內(nèi)殘留的伊文氏藍染料，然后迅速摘取眼球剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜組織置離心管中，將視 網(wǎng)膜組織冷凍干燥后稱取重量，接下來將視網(wǎng)膜組織與120ul甲酰胺在70°C孵育18h提取 伊文氏藍染料，將該提取液離心兩次（l〇〇〇〇g，4°C)，小心吸取合并上清，使用分光光度計 在620nm測定該上清液的吸光度值。伊文氏藍染料在甲酰胺提取物中的量是根據(jù)預(yù)先制作 的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得，結(jié)果以伊文氏藍含量除以干燥視網(wǎng)膜重量的形式表達。
[0072] 3. 2實驗結(jié)果
[0073] 由圖6可見，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中伊文氏藍滲漏值明顯升高 (P〈0. 001)，而PV(100mg?kg丨），PV-1 (100mg?kg丨），PV-2 (100mg?kg丨），PV-3 (100mg?kg丄） 均對此有顯著的改善作用（P〈〇. 001)。血視網(wǎng)膜屏障（BRB)的損壞是非增殖性糖尿病視網(wǎng) 膜病的特征，我們的研究表明：：各批次的夏枯草水提物均可以緩解BRB損傷導(dǎo)致的伊文氏 藍滲漏，因此其具有改善糖尿病視網(wǎng)膜病，特別是非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病的藥效活性。
[0074] 本發(fā)明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神 之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對其進行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請 所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 夏枯草水提物在制備預(yù)防或者治療糖尿病性視網(wǎng)膜病的藥物或食品中的應(yīng)用，所述 夏枯草水提物含0. 1~20wt %迷迭香酸。2. 如權(quán)利要求1所述的夏枯草水提物的應(yīng)用，其中所述的夏枯草水提物含I. 98wt%迷 迭香酸。3. 如權(quán)利要求1所述的夏枯草水提物的用途，其中所述的糖尿病性視網(wǎng)膜病為非增殖 性糖尿病性視網(wǎng)膜病。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種夏枯草水提物的醫(yī)藥用途，所述包含夏枯草水提物含0.1～20wt％迷迭香酸。本發(fā)明的夏枯草水提物可用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病。
【IPC分類】A61K31/216, A61P9/10, A61P27/02, A23L1/29, A61K36/536, A61P3/10
【公開號】CN105106303
【申請?zhí)枴緾N201510604313
【發(fā)明人】季莉莉, 王崢濤, 梅茜鈺, 陸賓, 周玲玉, 盛雨辰
【申請人】上海中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年9月21日