專利名稱：夏枯草及其提取物在制備抑制血管生成產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及夏枯草及其提取物抑制血管生長(zhǎng)(血管新生)的新用途，特別涉及夏枯草及其提取物在制備抑制血管生成產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管新生是指由原已存在的毛細(xì)血管通過出芽形成新的毛細(xì)血管的過程。它不僅是機(jī)體正常發(fā)育、生殖和組織修復(fù)等生理過程的基礎(chǔ)，也在多種病理過程中起重要作用。若血管新生過度，與類風(fēng)濕、腫瘤、視網(wǎng)膜眼底病和牛皮癬等疾病有關(guān)，血管新生抑制劑潛在及廣泛的用途使其成為當(dāng)前藥物研發(fā)熱點(diǎn)。(Judah Folkman. Angiogenesis :an organizing principle for drug discovery ？ Drug Discovery,2007,6 (4) :273-286.)
夏枯草(Prunella vulgaris Linn.)為常用傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒味苦，具有清火明目、散結(jié)消腫的功效，歷代醫(yī)家多用于治療瘟病、乳癰、目痛、黃疸、淋病和高血壓等病癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明夏枯草具有廣泛的藥理作用，如具有降壓、降糖、抗菌、 抗炎、抗過敏、抗氧化、清除自由基及抗病毒等作用，國(guó)外夏枯草作為一種自我康復(fù)藥物，在緩解咽喉疼痛、發(fā)熱及加速傷口愈合等方面得到廣泛的應(yīng)用并受到重視。
篩選血管生成活性物質(zhì)可利用內(nèi)環(huán)境與人體相似，且血管新生過程易于觀察的動(dòng)物模型來(lái)檢測(cè)，其中雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoie membrane, CAM)是研究血管形成與抗血管形成的理想體內(nèi)模型。血管新生主要發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中，雞胚孵育第3-5 天、7-10天血管生長(zhǎng)最活躍，12天以后CAM血管逐漸萎縮，故選取8-12天為藥物刺激最佳時(shí)間，利用立體顯微鏡，觀察并計(jì)算血管的數(shù)量。該技術(shù)不僅可用于定性、定量研究體內(nèi)血管新生，還具有實(shí)驗(yàn)材料易得、操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短、不需要特殊設(shè)備、結(jié)果易于觀察和適合大樣本重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。最早將CAM作為腫瘤轉(zhuǎn)移和侵蝕模型開展研究也正是基于其豐富和直觀的血管生長(zhǎng)特性(Leighton，J. Invasion and metastasis of heterologous tumors in the chick embryo. In "Progress. Experimental Tumor Research"1964 ；14 :98.)。目前CAM模型用于評(píng)價(jià)新藥的作用已經(jīng)得到了美國(guó)食品和藥品管理局的認(rèn)可(Vargas A, Zeisser-Labouebe Μ, Lange N, et al. The chick embryo and its chorioallantoic membrane(CAM)for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Adv Drug Deliv Rev,2007,59(11) :1162-1176.)。
基于CAM模型評(píng)價(jià)中藥對(duì)血管生成活性的影響和作用，不但能進(jìn)一步挖掘傳統(tǒng)中藥的價(jià)值，還能對(duì)血管生成性疾病的治療，延長(zhǎng)人類壽命作出貢獻(xiàn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供夏枯草及其提取物的新用途。表現(xiàn)在制備抑制血管生成的藥物及保健品中單獨(dú)使用或與其他藥物和有效成分配伍使用。
上述夏枯草提取物可為夏枯草水或醇提取物。夏枯草水提取物也可按照常規(guī)方法進(jìn)行制備，如可用下述方法得到選取藥材夏枯草(唇形科植物夏枯草I^imella vulgarisLinn.的花、果穗及全草)加入5 10倍純水，加熱，煮沸后保持微沸狀態(tài)繼續(xù)加熱0. 5 1小時(shí)，然后過濾收集濾液1 ；接著在濾渣中再加入5 10倍純水，加熱，煮沸后保持微沸狀態(tài)繼續(xù)加熱0. 5 1小時(shí)，然后過濾收集濾液2 ；將濾液1與濾液2混勻，干燥得到夏枯草水提取物。
夏枯草醇提取物可按照常規(guī)方法進(jìn)行制備，如可用下述方法得到粉碎的夏枯草和無(wú)水乙醇或50%乙醇以1 10 (體積分?jǐn)?shù))混合，沸水回流證，收集提取液，粗濾后殘?jiān)俅畏兴亓鞒?，合?次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到夏枯草醇提濃縮液。
用夏枯草或提取物制備的藥物可以制成片劑、膠囊、口服液、粉劑、顆粒劑、膏劑、 霜?jiǎng)?、注射劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
用夏枯草或提取物制備的保健品可以制成片劑、膠囊、口服液、粉劑、顆粒劑、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明采用CAM這一模式生物，以整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作為檢測(cè)手段，采用血清藥理學(xué)方法觀察夏枯草對(duì)血管生成的影響，發(fā)現(xiàn)夏枯草可顯著抑制血管生成，藥效作用比西藥反應(yīng)停更明顯，CAM視野下無(wú)密集血管生成，未能見到清晰的血管脈絡(luò)狀網(wǎng)絡(luò)，為該藥的作用機(jī)制研究提供了新的內(nèi)容和方向，也為中藥開發(fā)利用研究提供了新的思路和手段。


圖1為夏枯草提取物以及反應(yīng)停抑制CAM血管生成圖。 圖2.為夏枯草提取物以及反應(yīng)停對(duì)血管數(shù)量影響的結(jié)果
實(shí)驗(yàn)研究、夏枯草抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成的試驗(yàn)
1 材料
1.1 雞胚
購(gòu)于種雞或養(yǎng)雞場(chǎng)。
1.2藥物和試劑
夏枯草水提取物按照下述方法進(jìn)行制備選取藥材夏枯草(唇形科植物夏枯草 Prunella vulgaris Linn.花、果穗及全草)水煎兩次，煎液過濾，混合后加熱濃縮至Ig/ mL，此為夏枯草水提取物。
夏枯草醇提取物按照下述方法進(jìn)行制備粉碎的夏枯草和無(wú)水乙醇或50%乙醇以1 10 (體積分?jǐn)?shù))混合，沸水回流證，收集提取液，粗濾后殘?jiān)俅畏兴亓鞒兀喜?2次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到夏枯草醇提濃縮液lg/mL。
反應(yīng)停(化學(xué)名α-苯酞茂二酰亞胺，通用名沙利度胺，酞胺哌啶酮。Sigma公司)。
混合纖維素酯微孔濾膜(0.45 μ m，上海興亞凈化材料廠)；定性濾紙(杭州富陽(yáng)特種紙廠)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。
1. 3 儀器
MIR-553恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，S6E體視顯微鏡(德國(guó)Leica公司)， XTS30-D體視顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)，臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭公司)、MLS-3780 高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)等。
2 方法
2. 1試驗(yàn)分組及含藥血清制備
雄性昆明種小鼠隨機(jī)分成夏枯草水提取物組、夏枯草無(wú)水乙醇提取物組、夏枯草 50%乙醇提取物組、西藥反應(yīng)停陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，兩個(gè)藥物組常規(guī)按體重灌胃給與相當(dāng)于人臨床用藥劑量5倍的藥物，生理鹽水組采用等劑量的生理鹽水，一日1次， 于第5d最后1次灌服藥物后lh，摘眼球取血，離心制備血清約0. 5mL，置于無(wú)菌試管中， 56°C滅活30min，密封_20°C冰箱中凍存。
2. 2雞胚培養(yǎng)
種蛋以1%。新潔爾滅水溶液浸洗揩干，氣室朝上，置于(37士0. 5) °C恒溫箱中孵化培養(yǎng)，內(nèi)置濕盤保持相對(duì)濕度在65%，每天翻蛋2次，3d后于透射燈下觀察種蛋生長(zhǎng)情況， 剔除未受精卵。
2. 3雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)
取7d齡雞胚，隨機(jī)分組，碘伏消毒蛋氣室表面，用砂輪和解剖針啟開約lcm2的窗口，暴露CAM，無(wú)菌膠帶封口，繼續(xù)孵化。隔日，取直徑約0. 5cm,經(jīng)預(yù)先高壓滅菌的混合纖維素微孔濾膜片作為載體置于CAM上，并分別滴加不同組別的含藥血清20 μ L于載體上，密封后繼續(xù)孵育72h，加1 1甲醇和丙酮混合液室溫固定15min，以載體為中心剪下CAM約 3cm2，展膜于濾紙上，涼干。
2. 4結(jié)果觀察
以濾紙為背景，體視顯微鏡下查看載體周圍的血管數(shù)，比較各組血管生成情況。
2. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用ANOVA方差檢驗(yàn)分析壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)果，定量資料以又士S表示；采用兩樣本t檢驗(yàn)方法比較組間血管數(shù)量差異。
3 結(jié)果
3. ICAM血管生成表現(xiàn)形式
圖1.藥物影響血管生成的鏡檢結(jié)果
由圖1可見，CAM自然狀態(tài)的血管生成呈葉脈狀，給藥組在載體周圍呈現(xiàn)不同程度放射狀生長(zhǎng)的血管網(wǎng)，其中西藥反應(yīng)停組、夏枯草醇提取物組和夏枯草50%醇提取物組視野中的血管數(shù)量少于生理鹽水對(duì)照組，但仍可見到清晰的血管網(wǎng)絡(luò)，而夏枯草水提取物組不僅無(wú)密集血管生成，視野下未能見到清晰的血管脈絡(luò)狀網(wǎng)絡(luò)。
3. 2血管計(jì)數(shù)
表1.各組血管生長(zhǎng)數(shù)量(X士 SD，η = 9)
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組別血管數(shù)量
生理鹽水組
反應(yīng)停組
夏枯草水提取物組
夏枯草醇提取物組
夏枯草50 %醇提取物組114. 33 士 17. 5 71. 89 士 11. 72= 25. 00 士 7. 58*# 75. 11 士 8. 81* 77. 89 士 8. 10*
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與生理鹽水組相比P < 0. 01，#與反應(yīng)停組相比P < 0. 01
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果從形態(tài)和數(shù)量?jī)煞矫娑ㄐ?、定量地表明夏枯草提取物具有顯著的抑制血管生長(zhǎng)作用，其中夏枯草水提取物抑制效果比西藥反應(yīng)停更顯著，醇提取物的抑制作用與西藥反應(yīng)停相當(dāng)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法適用于藥品和保健品制備，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實(shí)施例1、夏枯草提取物的片劑制備
夏枯草加入5 10倍純水，分2次煎煮，合并藥液濃縮至藥液比1 1，加入過 100目篩的輔料混勻，選用乳糖，淀粉，糊精為稀釋劑，CMS-Na為崩解劑，乙醇為潤(rùn)濕劑，外加的硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑，制備合適軟材，經(jīng)16目篩網(wǎng)制粒，80°C干燥，整粒，上機(jī)壓片， 包薄膜衣，即得成品，平均片重約為每片0. ^g，劑量為每片0. 125g。
實(shí)施例2、夏枯草提取物的膠囊制備
夏枯草水提物或醇提物，加入過100目篩的輔料混勻，選用乳糖，淀粉，糊精為稀釋劑，乙醇為潤(rùn)濕劑，擠壓過40目篩制粒，于60°C干燥，過篩整粒，灌注1號(hào)膠囊，制得成品， 劑量為每膠囊0. 125g，每膠囊重約0. 3g。
實(shí)施例3、夏枯草提取物的口服液制備
夏枯草加入5 10倍純水，分2次煎煮，合并2次煎煮液，濃縮成藥液比1 1，經(jīng)澄清劑處理工藝去除鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、蠟質(zhì)等膠體不穩(wěn)定成分，沉淀后取上清液，加純化水至規(guī)定體積煮沸，冷卻后分裝成IOml/支，100°C滅菌30分鐘即得成品，每支劑量為0. 125g。
本發(fā)明中，夏枯草提取物對(duì)血管生長(zhǎng)具有極顯著的抑制作用，提示該藥物及其提取物在血管生成性疾病方面的潛在價(jià)值。
權(quán)利要求
1.夏枯草或夏枯草提取物在制備抑制血管生成產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物或保健品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述夏枯草提取物為夏枯草水或醇提取物。
全文摘要
本發(fā)明公開了夏枯草或其提取物的新用途。夏枯草或其提取物的新用途為抑制血管生成，在類風(fēng)濕性疾病、腫瘤、視網(wǎng)膜眼底病和牛皮癬等血管異常增生性疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明不僅為該藥的開發(fā)應(yīng)用研究提供了新的內(nèi)容和方向，也為中藥治療血管異常增生性疾病研究提供了新的手段。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102526182SQ20101061067
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者宋軍, 王閩慧 申請(qǐng)人:宋軍, 王閩慧