本發(fā)明涉及基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的繁榮與進(jìn)步，健康問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視。在致命的10大疾病中，排名前幾的心臟病、惡性腫瘤、腦血管病變、糖尿病嚴(yán)重影響人們的生活，而且這些疾病還呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，死亡率也越來(lái)越高，趨向于年輕化，這些疾病常常會(huì)引起很多并發(fā)癥?；蛑委熃o人們帶來(lái)了曙光，從1990年至今，實(shí)現(xiàn)了在生物醫(yī)藥領(lǐng)域和臨床上基因治療對(duì)人類(lèi)疾病進(jìn)行基因干預(yù)治療，在治療疾病的潛力得到了認(rèn)可，比傳統(tǒng)治療疾病的方法有很多不可比擬的優(yōu)點(diǎn)?；蛑委熞呀?jīng)成為當(dāng)代生命科學(xué)領(lǐng)域最具前景性的研究方向。2003年基因組計(jì)劃的成功，推動(dòng)了基因治療的進(jìn)步?；蛑委熤荚诟淖兓蛩剑蠨NA和mRNA兩個(gè)水平。2009年美國(guó)就有354項(xiàng)關(guān)于基因治療的計(jì)劃在試行，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了2008年的全球的116項(xiàng)。英國(guó)在2014年推出了“十萬(wàn)基因組計(jì)劃”擬通過(guò)對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序，有效確定引發(fā)癌癥及其他疾病的基因。

抗體也是生物科學(xué)領(lǐng)域的主力軍，最普遍的用法是通過(guò)Western blot去揭示細(xì)胞中特定蛋白的表達(dá)量的多少，抗體另一方面還被用于熒光染色和免疫組化。根據(jù)2015年Biocompare發(fā)表的一份報(bào)告，在科研上用于抗體的生產(chǎn)的市場(chǎng)規(guī)模很龐大，并且仍在增長(zhǎng)，抗體的種類(lèi)也越來(lái)越多，但是抗體的質(zhì)量得不到保證，在抗體的購(gòu)買(mǎi)方面損失了很多的資金，只科研用于抗體市場(chǎng)規(guī)模就達(dá)到25億美金，每年因購(gòu)買(mǎi)質(zhì)量差的抗體導(dǎo)致的損失達(dá)到8億美金。2015年9月Uhlén和美國(guó)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)分別舉辦了關(guān)于抗體迫在眉睫的問(wèn)題的解決的會(huì)議，解決方案之一就是抗體的效果的評(píng)價(jià)。同一種抗體在幾次試驗(yàn)下表現(xiàn)出的性質(zhì)不同，會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)料的結(jié)果。斯坦福大學(xué)反向DNA疫苗開(kāi)創(chuàng)一型糖尿病新療法，這種疫苗是以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)的反向DNA疫苗，通過(guò)靶向抑制異常表達(dá)的T細(xì)胞保護(hù)胰島B細(xì)胞不受傷害，來(lái)治療糖尿病。2015年4月，科學(xué)家證明了納米涂層細(xì)菌能有效轉(zhuǎn)運(yùn)口服DNA疫苗，這種疫苗可以刺激人體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用治療疾病，主要目的是有效增加口服疫苗生物利用度，尋找一個(gè)有效的載體物質(zhì)。一些常見(jiàn)的方法如基因槍法、電穿孔法、顯微注射等方法，但這些方法目前的缺點(diǎn)是無(wú)法確保基因進(jìn)入體內(nèi)不被降解、無(wú)靶向性、會(huì)產(chǎn)生機(jī)體的免疫反應(yīng)，目前陽(yáng)離子聚合物載體作為非病毒型載體已經(jīng)受到了人們的重視，將潛在的病毒型載體的安全性隱患排除。這種陽(yáng)離子載體既可應(yīng)用于基因治療又可簡(jiǎn)化疫苗的生產(chǎn)以及DNA疫苗的不成熟性，可保護(hù)DNA進(jìn)入體內(nèi)不被DNA水解酶水解。常見(jiàn)的陽(yáng)離子聚合物基因載體毒性低、轉(zhuǎn)染效率高、具有靶向性且在細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯免疫反應(yīng)。因此合成以陽(yáng)離子聚合物為基礎(chǔ)的DNA納米載體載體很有意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供一種TMC/京尼平/pDNA納米載體及其制備方法。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種TMC/京尼平/pDNA納米載體，包括包裹pDNA的TMC/京尼平納米球；所述的TMC/京尼平/pDNA納米載體粒徑在100nm-500nm。

本發(fā)明還提供一種制備上述的TMC/京尼平/pDNA納米載體的方法，通過(guò)單體殼聚糖合成三甲基殼聚糖，通過(guò)交聯(lián)劑京尼平，先形成納米球，再將DNA載入納米球中。

步驟如下：

（一）制備碘化三甲基殼聚糖

（1）分別稱(chēng)取研碎的脫乙酰度DD=80%-95%的殼聚糖、2.3倍殼聚糖摩爾量的NaI、 2.3倍殼聚糖摩爾量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%NaOH溶液、10倍殼聚糖摩爾量的CH₃I溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮中，得到混合溶液；將混合溶液在40-60℃條件下水浴1h，然后將混合溶液離心進(jìn)行分離，通過(guò)乙醚對(duì)沉淀洗滌2次、過(guò)濾除去乙醚后再將沉淀溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中后在40-60℃條件下水浴1h；

（2）再次稱(chēng)取與上步等量的NaI、NaOH溶液、CH₃I依次加入上步1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，在40-60℃條件下水浴0.5h后再加入與NaI等摩爾量的CH₃I和0.5倍NaI摩爾量的NaOH繼續(xù)攪拌1h，得到碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

（二）制備去碘化的三甲基殼聚糖

將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進(jìn)行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對(duì)沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

（三）TMC/京尼平納米球的制備

稱(chēng)取上述制備的三甲基殼聚糖溶解在體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入與三甲基殼聚糖摩爾比1:1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應(yīng)中顏色變化后再持續(xù)攪拌進(jìn)行6h，即制得TMC/京尼平納米球；

（四）TMC/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）將上步所得TMC/京尼平納米球通過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無(wú)菌操作臺(tái)備用。

（2）將（1）中的TMC/京尼平溶液取1mL加入離心管1中，另取藥用量的pDNA加入離心管2中，加入無(wú)菌水稀釋至2μg/mL；向離心管1中分批加入稀釋后的pDNA后渦旋30s,再將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得到TMC/京尼平/pDNA納米載體納米球。

作為優(yōu)選項(xiàng)：所述步驟（二）中水浴過(guò)程中通過(guò)使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH₃I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

本發(fā)明中TMC/京尼平納米球作為陽(yáng)離子聚合物納米粒，可以通過(guò)靜電作用與pDNA結(jié)合，起到保護(hù)pDNA的作用，可以與不同濃度的pDNA結(jié)合，形成的納米球粒徑和電位均有所不同；粒徑和帶電荷的不同使納米粒子進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行基因治療和對(duì)抗體生產(chǎn)的影響不同；陽(yáng)離子聚合物載體的分散性好，尺寸可控，穩(wěn)定性好，與pDNA凝集很穩(wěn)定，整體帶正電荷，第三種電荷反轉(zhuǎn)復(fù)合物可以在不同pH條件下進(jìn)行電荷反轉(zhuǎn)，更加有利于載體進(jìn)入細(xì)胞。

本發(fā)明還提供TMC/京尼平/pDNA納米載體在基因治療和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明的DNA納米載體，可以與不同濃度的可以表達(dá)綠色熒光蛋白的pDNA進(jìn)行結(jié)合，從而可以對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，更好的用于生物檢測(cè)。

殼聚糖衍生物分別是天然的非病毒型載體和合成型的非病毒型載體，主要表現(xiàn)在其安全性可降解性、生物相容性、釋藥可控性、轉(zhuǎn)染效率高。在一定程度上保證DNA納米載體整體帶正電荷，采用復(fù)凝集法制備陽(yáng)離子聚合物的DNA納米載體。在特定pH條件下，在水中分散性很好，粒徑分布均勻。

TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體分別以天然陽(yáng)離子聚合物和合成陽(yáng)離子聚合物對(duì)于DNA的結(jié)合程度，毒性大小以及粒徑分布產(chǎn)生影響。

綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為：

1、本發(fā)明制備方法工藝簡(jiǎn)單，成本低；

2、本發(fā)明制備的納米顆粒穩(wěn)定性好，并且在水中分散性好，粒徑可控；

3、本發(fā)明制備的pDNA納米載體比在PBS和油相中尺寸和帶電荷量影響更??；

4、本發(fā)明制備的納米顆粒比兩單體的物質(zhì)穩(wěn)定性更好，更能改變整個(gè)物質(zhì)的電荷分布，更加適合基因治療和抗體生產(chǎn)的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中三甲基殼聚糖的制備過(guò)程示意圖；

圖2為本發(fā)明制備的載體進(jìn)入細(xì)胞示意圖。

具體實(shí)施方式

制備TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體，包括如下實(shí)驗(yàn)步驟：

（1）制備TMC(三甲基殼聚糖)

①稱(chēng)取一定量研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），NaI固體, NaOH溶液、CH3I溶液加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮的燒瓶中40-60℃水浴1h.通過(guò)乙醇溶液將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行沉淀，通過(guò)離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過(guò)乙醚洗滌2次過(guò)濾除去乙醇。

②將①中的產(chǎn)物溶解在1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40-60℃水浴，量取一定量的NaI固體, NaOH溶液、CH3I加入含有1-甲基-2-吡咯烷酮溶液的燒瓶中，40-60℃水浴0.5h.再加入CH3I和NaOH固體繼續(xù)攪拌1h.

③碘化三甲基殼聚糖去碘化 將上述制備的產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，代替鹽酸，進(jìn)行脫碘化。用乙醇沉淀此聚合物，用乙醚與乙醇交替洗滌并離心，通過(guò)真空干燥得到白色粉末。

（2）制備TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球

稱(chēng)取一定量上述制備的三甲基殼聚糖溶解在體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下按照一定配比混合逐滴加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行6h.制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

(3）制備TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體

將制得的TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球使用0.45μm的濾膜進(jìn)行處理，pDNA(0.1mg/mL)分批加入到殼聚糖納米球溶液中，分別渦旋30s后，將離心管放入孵育器中37℃進(jìn)行培養(yǎng)1h.既可制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體。

以下實(shí)施例描述了本發(fā)明的特殊實(shí)施例子，以便對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，這些實(shí)施例只是說(shuō)明而不表示本發(fā)明所有的可能性，本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例中提到的材料、反應(yīng)條件或參數(shù)，任何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗(yàn)的人，都可以按照本專(zhuān)利的原理，利用其他類(lèi)似材料或反應(yīng)條件實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所描述的DNA納米載體的制備，這些不脫離本發(fā)明描述的基本概念。因此，這些修改或不同的應(yīng)都在本發(fā)明的覆蓋范圍內(nèi)。

實(shí)施例1

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱(chēng)取2g研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反應(yīng)過(guò)程中需要冷凝CH3I通過(guò)乙醇溶液將進(jìn)行沉淀，通過(guò)離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過(guò)乙醚洗滌2次過(guò)濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴，移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，60℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH繼續(xù)攪拌1h.

3、 制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進(jìn)行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對(duì)沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH3I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4 、TMC/京尼平納米球的制備

稱(chēng)取10mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在10ml體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行6h.制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

5、 TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）、將4中的TMC/京尼平納米球通過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無(wú)菌操作臺(tái)備用。

（2）、將（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA(3kb)加入2ml離心管2中，加入無(wú)菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

實(shí)施例2

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱(chēng)取2g研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、11.5mlCH3I溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮中40℃水浴1h.反應(yīng)過(guò)程中需要冷凝CH3I通過(guò)乙醇溶液將進(jìn)行沉淀，通過(guò)離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過(guò)乙醚洗滌2次過(guò)濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中40℃水浴，移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取4.8gNaI,11ml15%NaOH溶液、7mlCH3I依次加入80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，40℃水浴0.5h.再加入2mlCH3I和0.6gNaOH繼續(xù)攪拌1h。

3 、制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進(jìn)行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對(duì)沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH3I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4、 TMC/京尼平納米球的制備

稱(chēng)取10mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在10ml體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行1h，制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

5、TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）、 將4中的TMC/京尼平納米球通過(guò)0.22μm濾膜進(jìn)行滅菌操作，放入無(wú)菌操作臺(tái)備用；

（2）、 將（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中，取10μlpDNA(5kb)加入2ml離心管2中，加入無(wú)菌水稀釋至2ug/ml，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。

實(shí)施例3

1、制備碘化三甲基殼聚糖

稱(chēng)取1g研碎的殼聚糖（DD=80%-95%），2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、5.75mlCH3I溶解在40ml1-甲基-2-吡咯烷酮中60℃水浴1h.反應(yīng)過(guò)程中需要冷凝CH3I通過(guò)乙醇溶液將進(jìn)行沉淀，通過(guò)離心進(jìn)行分離。上述所得產(chǎn)品通過(guò)乙醚洗滌2次過(guò)濾除去乙醇。

2、將1中的產(chǎn)品溶解在80ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中60℃水浴，移除吸附在碘化三甲基殼聚糖多余的乙醚。量取2.4gNaI,5.5ml15%NaOH溶液、3.5mlCH3I依次加入40ml1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，60℃水浴0.5h.再加入1mlCH3I和0.3gNaOH繼續(xù)攪拌1h;

3、 制備去碘化的三甲基殼聚糖

將2中制備的將上步所得碘化三甲基殼聚糖產(chǎn)品溶解在10%的NaCl溶液中，進(jìn)行脫碘化，然后用乙醇沉淀，收集沉淀，對(duì)沉淀用乙醚與乙醇交替洗滌后離心，真空干燥得到白色粉末，即去碘化的三甲基殼聚糖產(chǎn)品；

所述乙醇沉淀的具體操作為使用醇沉法加入5倍體積的乙醇溶液進(jìn)行沉淀，除去溶解在乙醇中多余的 CH₃I，離心得到去碘化三甲基殼聚糖。

4 、TMC/京尼平納米球的制備

稱(chēng)取5mg上述制備的三甲基殼聚糖溶解在5ml體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中，室溫下逐滴加入1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的京尼平溶液，邊滴邊攪拌，反應(yīng)進(jìn)行15min后顏色變化，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行6h，制得TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平納米球。

5、 TMC（三甲基殼聚糖）/京尼平/pDNA納米載體納米球的制備

（1）、 將4中的TMC/京尼平納米球通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行滅菌操作，放入無(wú)菌操作臺(tái)備用。

（2）、將（1）中的TMC/京尼平溶液取1ml加入離心管1中，取8μlpDNA(3kb)加入2ml離心管2中，加入無(wú)菌水稀釋至100μl，分批加入稀釋后的pDNA,渦旋30s混合溶液,將離心管1放入孵育器中，37℃孵育1h，即得。