專利名稱：通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸的方法
通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法背景技術(shù)
已知L-鳥(niǎo)氨酸有關(guān)于肝功能的刺激作用并經(jīng)常用作藥劑配料和在運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)中使用。
目前通過(guò)多種方法制備L-鳥(niǎo)氨酸。一種方法是借助微生物的發(fā)酵制備。另一種方法是精氨酸的堿水解，例如用氫氧化鋇(CN 1594282A)。另一種方法是通過(guò)固定具有精氨酸酶活性的微生物的精氨酸生物轉(zhuǎn)化(KR589121B1)。從L-瓜氨酸制備L-鳥(niǎo)氨酸的方法在專利文獻(xiàn)(JP 42007767B4)中也已有所描述。
特征在于分泌L-鳥(niǎo)氨酸至培養(yǎng)基中的微生物在該文獻(xiàn)中已有所描述。所述微生物的實(shí)例是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬 (Bacillus, JP 43010996B4、JP 57041912B)、埃希氏菌屬(Escherichia, US 3668072A)、普羅威登斯菌屬(Providencia, JP 03195494)或節(jié)桿菌屬(Arthrobacter, US 3574061)的細(xì)菌。
生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的微生物特征常常在于對(duì)氨基酸L-精氨酸或L-瓜氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷(短桿菌、芽孢桿菌、棒狀桿菌在EP 392708B1和KR 161147B1中有所描述，而埃希氏菌在US 366072A中有所描述)。另外，對(duì)2-噻唑-丙氨酸、磺胺脒或2-氟丙酮酸有抗性的微生物已有描述(日本開(kāi)放出版號(hào)61119194)。EP 0393708B1描述了 L-鳥(niǎo)氨酸生產(chǎn)者特征在于對(duì)ornithole和霉酹酸的更低的抗性。所述特性也可以是組合的形式。
通過(guò)從細(xì)胞被動(dòng)擴(kuò)散的方式的堿性氨基酸(例如L-賴氨酸、L-精氨酸和L-鳥(niǎo)氨酸)的釋放是非常差的(Bellmann 等人(Microbiology 2001; 147:1765-74)) 對(duì)賴氨酸已通過(guò)實(shí)例的方式有很好的描述。Vrlijc等人(Journal of Bacteriology 1995; 177(14) : 4021-7)已研究多種輸出缺乏的谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)突變體。對(duì)于一個(gè)突變體，測(cè)量到174nML_賴氨酸的細(xì)胞內(nèi)濃度，而在細(xì)胞外測(cè)量到只有0. 7mM的數(shù)值。
Vrlijc 等人(Molecular Microbiology 1996;22(5):815-26 和 Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology 1999; 1:327-336)和 EP 0868527B1 鑒定并描述了作為L(zhǎng)-賴氨酸輸出蛋白(LysE)的新型(exporter)。一個(gè)確定的LysE無(wú)義突變體不再能運(yùn)送L-賴氨酸至細(xì)胞外。該LysE基因所編碼的多肽是長(zhǎng)233個(gè)氨基酸或氨基酸殘基并示于SEQ ID No. 2。在賴氨酸生產(chǎn)者中過(guò)表達(dá)LysE基因，發(fā)現(xiàn)L-賴氨酸的分泌增加。
Von Bellmann 等人(Microbiology 2001; 147:1765-74)已就谷氛酸棒狀桿菌中的多種堿性氨基酸的運(yùn)送更詳細(xì)地表征了 LysE輸出蛋白。作者說(shuō)明所述轉(zhuǎn)運(yùn)子特異地輸出氨基酸L-賴氨酸和L-精氨酸至細(xì)胞外。作者還調(diào)查了 LysE是否也輸出L-鳥(niǎo)氨酸至細(xì)胞外。為此目的，首先制備稱作ATCC13032: :argF的L-精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的谷氨酸棒狀桿菌菌株。
在包含40g/l葡萄糖的50ml稱為CGXII的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株(分批培養(yǎng))。 在24小時(shí)的孵育期后測(cè)量到60mM L-鳥(niǎo)氨酸，對(duì)應(yīng)7. 9g/l。在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)大約70分鐘的孵育期在所述菌株的細(xì)胞中測(cè)量到大約200mM的L-鳥(niǎo)氨酸濃度。為了澄清是否LysE也輸出L-鳥(niǎo)氨酸至細(xì)胞外，用復(fù)制質(zhì)粒pEC71ysE轉(zhuǎn)化所述菌株13032: : argF。此措施旨在為所述菌株提供增加的LysE活性，從而使得該菌株可以以更高的輸出速率轉(zhuǎn)運(yùn)L-鳥(niǎo)氨酸至培養(yǎng)基中。然而，所述措施沒(méi)有增加L-鳥(niǎo)氨酸的輸出速率。對(duì)對(duì)照菌株(13032: :argF)和在所述轉(zhuǎn)化子(帶有pEC71ysE的13032: :argF)中測(cè)定到同樣的輸出速率(每分鐘O. 6nmol (mg 干重))。由此該作者下結(jié)論L-鳥(niǎo)氨酸不被LysE輸出蛋白所轉(zhuǎn)運(yùn)。他們還得出在谷氨酸棒狀桿菌中一定有另一個(gè)未知的對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸的輸出功能(輸出蛋白)的結(jié)論(Bellmann等人，2001，1771頁(yè)的圖5b)和1772頁(yè)的21-28行)。
在谷氨酸棒狀桿菌R中鑒定到一變體LysE (見(jiàn)SEQ ID No. 4)，其與如SEQ ID No. 2 所示的來(lái)自菌株ATCC 13032的LysE輸出蛋白的氨基酸序列不同在于N末端延伸三個(gè)氨基酸殘基。所述氨基酸殘基的序列是甲硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸(MVI)。來(lái)自菌株R的該 LysE多肽在EP 1266966B1已描述為在環(huán)區(qū)域形成上不同于野生型蛋白(或者更具體地不能再形成所述環(huán))，因此能夠?qū)崿F(xiàn)改進(jìn)的L-賴氨酸和L-精氨酸的輸出的變體。
另一 LysE 變體已由 Gunji 和 Yasueda 所描述(Journal of Biotechnologyl27, 2006, 1- 13)。此作者對(duì)專性甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌甲基營(yíng)養(yǎng)嗜甲基菌 (Methylophilus methylotrophus)的L-賴氨酸的形成有興趣。他們用稱為pSE的含有谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869LysE基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化甲基營(yíng)養(yǎng)嗜甲基菌以改進(jìn)甲基營(yíng)養(yǎng)嗜甲基菌的賴氨酸的形成。然而，此作者發(fā)現(xiàn)他們?cè)诩谆鶢I(yíng)養(yǎng)嗜甲基菌中能夠以穩(wěn)定方式建立的只有突變形式的LysE基因(lysE24)。由于插入一個(gè)胸腺嘧啶殘基，在所述lysE24等位基因中LysE基因的開(kāi)放讀框已被移位，導(dǎo)致在432bp后該讀框的終止。截短的讀框編碼在C 端比谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的野生型LysE蛋白質(zhì)短92個(gè)氨基酸殘基的LysE蛋白質(zhì)。 它的長(zhǎng)度是141個(gè)氨基酸殘基。另外，該截短蛋白質(zhì)的最后6個(gè)C端氨基酸(殘基135-141) 不同于所述野生型LysE氨基酸序列的氨基酸。測(cè)試了攜帶在質(zhì)粒上(pSE24)的所述修飾的LysE等位基因的甲基營(yíng)養(yǎng)嗜甲基菌菌株的賴氨酸形成。為此，以分批補(bǔ)料的形式培養(yǎng)50 小時(shí)在O. 31稱作SEIIc的基本培養(yǎng)基中測(cè)定該菌株。此作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子也形成了少量的 (O. 07mM，對(duì)應(yīng)11.8mg/l)L-鳥(niǎo)氨酸，以及O. 55mM L-賴氨酸和O. 19mM L-精氨酸。如作者所解釋，這一觀察到的L-鳥(niǎo)氨酸的形成是由于該突變轉(zhuǎn)運(yùn)子的底物特異性的改變或者可能地該菌株的細(xì)胞內(nèi)L-精氨酸庫(kù)的改變。EP 1266966B1 (發(fā)明人=Gunji和Yasueda)描述了 LysE24轉(zhuǎn)運(yùn)子在分泌L-賴氨酸和L-精氨酸上的積極作用。
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是提供用于發(fā)酵制備L-鳥(niǎo)氨酸的新方法。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及制備L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟
a)在培養(yǎng)基中發(fā)酵分泌L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌，所述細(xì)菌選自棒狀桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、節(jié)桿菌和腸桿菌，其過(guò)表達(dá)編碼具有L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID No. 2的氨基酸序列具有至少(彡)35%、彡40%、彡50%、 彡 55%、彡 60%、彡 65%、彡 70%、彡 75%、彡 80%、彡 85%、彡 90%、彡 92%、彡 94%、彡 96%、彡 97%、 彡98%、彡99%或100%，優(yōu)選地彡70%，特別優(yōu)選地彡90%，非常特別優(yōu)選地彡96%和最優(yōu)選地100%的相同性，5CN 102947460 A書明說(shuō)3/24 頁(yè)
b)在所述培養(yǎng)基中積累所述L-鳥(niǎo)氨酸，其中獲得發(fā)酵液，
c)其中排除以DSM23239保藏的質(zhì)粒pEC71ysE的過(guò)表達(dá)，
d)其中所編碼的多肽的長(zhǎng)度，適當(dāng)?shù)厥轻?46至彡286個(gè)氨基酸或氨基酸殘基。
優(yōu)選選擇選自彡171至彡286、彡196至彡261、彡203至彡258、彡218至彡243、 彡228至< 236和彡228至< 233個(gè)氨基酸或氨基酸殘基的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。
特別優(yōu)選在彡203至彡258、彡218至彡243、彡228至彡236和彡228至彡233 的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度，非常特別的優(yōu)選在彡228至彡236和彡228至彡233的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。
在本文以下提及的L-鳥(niǎo)氨酸，該術(shù)語(yǔ)也包含其鹽，例如L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽或L-鳥(niǎo)氨酸硫酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明的方法使用選自棒狀桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、節(jié)桿菌屬和腸桿菌屬的細(xì)菌。
在棒狀桿菌屬中，優(yōu)選基于以下物種的菌株·
Corynebacterium efficiens,例如模式菌株 DSM44549,
谷氨酸棒狀桿菌，例如模式菌株ATCC13032或R菌株，和
產(chǎn)氛棒狀桿菌(Corynebacteriumammoniagenes),例如 ATCC6871 菌株，
非常特別優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌物種。
某些谷氨酸棒狀桿菌物種的代表在現(xiàn)有技術(shù)中也以其它名稱為人所知。這些包括例如
菌株ATCC13870,被稱為嗜醋酸棒狀桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum),
菌株DSM20137,被稱為百合棒狀桿菌(Corynebacterium Iilium),
菌株ATCC17965，被稱為棲糖蜜棒狀桿菌(Corynebacterium melassecola),
菌株ATCC14067,被稱為黃色短桿菌(Brevibacterium f Iavum),
菌株ATCC13869,被稱為乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum),和
菌株ATCC14020,被稱為散枝短桿菌(Brevibacterium divaricatum)。
術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus) ”已同樣用于谷氨酸棒狀桿菌。某些Corynebacterium efficiens物種的代表在現(xiàn)有技術(shù)中也已稱為熱產(chǎn)氨棒狀桿菌 (Corynebacterium thermoaminogenes),例如菌株 FERM BP-1539。
在芽孢桿菌屬中，優(yōu)選枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)物種。
在節(jié)桿菌屬中，優(yōu)選朽1檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)物種。
在腸桿菌科中，優(yōu)選埃希氏菌屬、歐文菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬、泛菌屬(Pantoea)和沙雷氏菌屬(Serratia)。特別優(yōu)選埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬。非常特別優(yōu)選埃希氏菌屬的大腸桿菌物種(Escherichia coli)、沙雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌物種(Serratia marcescens)和普羅威登雷斯菌屬的雷氏普羅威登斯菌物種(Providencia rettgeri)。
用于過(guò)表達(dá)L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白的方法的細(xì)菌或菌株(起始菌株)，優(yōu)選具有分泌L-鳥(niǎo)氨酸至周圍的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基并在其中積累L-鳥(niǎo)氨酸的能力。該表述“生產(chǎn)”在本文如下也用于此意。更具體地，用于所述過(guò)表達(dá)方法的菌株具有在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中濃縮或積累 ^0. lg/l、0.3g/l) lg/1、彡3g/l) 10g/l L-鳥(niǎo)氨酸的能力。起始菌株優(yōu)選通過(guò)誘變和選擇、通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)兩種方法的組合制備的菌株。6
顯而易見(jiàn)且不需要進(jìn)一步解釋，適用于本發(fā)明的方法的細(xì)菌也可以通過(guò)首先在野生型菌株(例如在谷氨酸棒狀桿菌菌株ATCC 13032或在菌株ATCC 14067)中過(guò)表達(dá)編碼具有L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID No. 2具有至少(> )35%相同性，適當(dāng)?shù)厮幋a的多肽的長(zhǎng)度位于如上所述的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，接下來(lái)再通過(guò)在現(xiàn)有技術(shù)中所描述的進(jìn)一步的遺傳方法使所述細(xì)菌生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸。只用所提及的多核苷酸轉(zhuǎn)化野生型(例如菌株ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869或ATCC17965)不會(huì)導(dǎo)致根據(jù)本發(fā)明的方法。
分泌或產(chǎn)生L-鳥(niǎo)氨酸的谷氨酸棒狀桿菌物種的菌株的實(shí)例是
在US 5188947中所描述的乳發(fā)酵短桿菌FERMBP 2344和谷氨酸棒狀桿菌FERMBP 2345。
分泌或產(chǎn)生L-鳥(niǎo)氨酸的檸檬節(jié)桿菌物種的菌株的實(shí)例是
在US 5188947中所描述的檸檬節(jié)桿菌FERMBP 2342。
分泌或產(chǎn)生L-鳥(niǎo)氨酸的枯草芽孢桿菌物種的菌株的實(shí)例是
在JP 57041912中所描述的枯草芽孢桿菌B0R32 (FERMP 3647)。
分泌或產(chǎn)生L-鳥(niǎo)氨酸的雷氏普羅威登斯菌物種的菌株的實(shí)例是
在JP 03195494所描述的雷氏普羅威登斯菌ARGA6(FERM P11147)。
分泌或產(chǎn)生L-鳥(niǎo)氨酸的大腸桿菌物種的菌株的實(shí)例是
在US 3668072 中所描述的大腸桿菌 B1919(ATCC 21104)。
L-鳥(niǎo)氨酸生產(chǎn)細(xì)菌通常對(duì)氨基酸L-瓜氨酸或L-精氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的。作為替代，也可以考慮對(duì)L-瓜氨酸或L-精氨酸是營(yíng)養(yǎng)延緩(bradytrophic)的L-鳥(niǎo)氨酸生產(chǎn)細(xì)菌。術(shù)語(yǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷和營(yíng)養(yǎng)延緩的定義可以在例如W001/09286的第9頁(yè)上找到。在本領(lǐng)域營(yíng)養(yǎng)延緩型也稱為滲漏突變體。所用的營(yíng)養(yǎng)延緩細(xì)菌具體是其中的基因產(chǎn)物ArgF(鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶)、ArgG (精氨琥珀酸合酶)或ArgH (精氨琥珀酸裂解酶)的活性與野生型中的活性相比大于(>)零但等于或小于(()10%，優(yōu)選 > 零并< 1%的細(xì)菌。
現(xiàn)有技術(shù)已公開(kāi)稱為L(zhǎng)ysE基因并編碼具有L-賴氨酸輸出蛋白活性的蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸。所述多肽也稱為縮寫LysE。
輸出蛋白是位于細(xì)胞的細(xì)胞膜上并從所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中向輸出代謝物(例如 L-賴氨酸或L-鳥(niǎo)氨酸)進(jìn)入周圍的培養(yǎng)基的蛋白。如果為此所需的能量以三磷酸腺苷 (ATP)的形式提供，這被稱為初級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸或初級(jí)輸出。如果所述能量以離子梯度的形式， 例如鈉離子，提供，稱之為次級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸或次級(jí)輸出(Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko and L. Stryer ;Biochemie [生物化學(xué)]第五版，378-384 頁(yè)，Spektrum Akademischer Verlag [出版商]，Heidelberg, Germany, 2003)。測(cè)定L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白活性的操作說(shuō)明可以在 Bellmann 等人(Microbiology 2001; 147:1765-74)中找到。
在本發(fā)明的研究過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)棒狀桿菌屬(優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌)和微球菌屬 (優(yōu)選藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus))的賴氨酸輸出蛋白具有除L-賴氨酸輸出蛋白活性外的L-鳥(niǎo)氨酸輸出活性。
本發(fā)明的方法利用編碼對(duì)L-鳥(niǎo)氨酸具有輸出活性的多肽的基因，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID No. 2的氨基酸序列具有至少(彡)35%、彡40%、彡50%、彡55%、彡60%、 彡 65%、彡 70%、彡 75%、彡 80%、彡 85%、彡 90%、彡 92%、彡 94%、彡 96%、彡 97%、彡 98%、彡 99%或100%，優(yōu)選地≥70%，特別優(yōu)選地≥90%，非常特別優(yōu)選地≥96%，最優(yōu)選地≥100%的相同性，所編碼的多肽的長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)匚挥谏鲜龅拈L(zhǎng)度范圍內(nèi)。
適合的L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白的實(shí)例是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032 (SEQID No. 2)、 谷氨酸棒狀桿菌R(SEQ ID如.4)、谷氨酸棒狀桿菌々1014067出0 ID No. 5)，谷氨酸棒狀桿菌 ATCC13869(EQ ID No. 7), Corynebacterium efficiens YS314(EQ ID No. 9), 溶血棒狀桿菌(Corynebacterium diphteriae) NCTC 13129 (SEQ ID No. 10)、紋帶棒狀桿菌(Corynebacterium striatum)ATCC6940(SEQ ID No. 11) > Corynebacterium aurimucosum ATCC700975 (SEQ ID No. 12)、馬氏棒狀桿菌(Corynebacterium matruchotii) ATCC33806(SEQ ID No. 13) > Corynebacterium pseudogenitalium ATCC33035 (SEQ ID No. 14)、擁擠棒狀桿菌(Corynebacterium accolens) ATCC49725 (SEQ ID No. 15)、 Corynebacterium glucuronalyticum ATCC51867(SEQ ID No. 16)、藤黃微球菌 NCTC2665(SEQ ID No. 17)^Corynebacterium tubuculostearicum SK141(SEQ ID No. 18)和馬氏棒狀桿菌ATCC14266(SEQ ID No. 19)的賴氨酸輸出蛋白或LysE多肽。SEQ ID No. 18 和SEQ ID No. 19在本領(lǐng)域中也稱為ArgO多肽。
在本研究中，測(cè)定了谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067和谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的 LysE基因的核苷酸序列(SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 8)。谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067和谷氨酸棒狀桿菌ATCC13869的LysE多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 5和7中所示。它們與如SEQ ID No. 2所示的谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032LysE的氨基酸序列相同。
表I列出來(lái)自國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI，Bethesda, MD, US)的數(shù)據(jù)庫(kù)采集的棒狀桿菌屬的各種代表菌和藤黃微球菌的LysE多肽的錄入號(hào)。另外，表I對(duì)序列列表中所示的LysE多肽的氨基酸序列作出引用。最后，表I顯示所編碼的LysE多肽的長(zhǎng)度(氨基酸的數(shù)目)。
表I:
權(quán)利要求
1.制備L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于進(jìn)行以下步驟a)在培養(yǎng)基中發(fā)酵分泌L-鳥(niǎo)氨酸的細(xì)菌，所述細(xì)菌選自棒狀桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、 節(jié)桿菌和腸桿菌，其過(guò)表達(dá)編碼具有L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白活性的多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID No. 2的氨基酸序列具有> 35%的相同性，b)在所述培養(yǎng)基中積累L-鳥(niǎo)氨酸，其中獲得發(fā)酵液，和c)其中排除以DSM23239保藏的質(zhì)粒pEC71ysE的過(guò)表達(dá)，d)并且其中所編碼的多肽的長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)厥?gt;146至< 286個(gè)氨基酸或氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求I的方法，其特征在于所編碼的多肽包含SEQID No. 2或SEQ ID No. 4的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其特征在于在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)的情況下，與ATCC13032或ATCC14067或ATCC13869相比，過(guò)表達(dá)使L-鳥(niǎo)氨酸輸出蛋白活性水平增加至少10%。
4.權(quán)利要求1-3的方法，其特征在于過(guò)表達(dá)通過(guò)一或多種措施實(shí)現(xiàn)，所述措施選自a)增加拷貝數(shù)，b)使用強(qiáng)啟動(dòng)子，和c)突變啟動(dòng)子，和d)過(guò)表達(dá)激活蛋白。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其特征在于所述細(xì)菌是棒狀桿菌，優(yōu)選谷氨酸棒狀桿菌。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其特征在于額外地弱化一或多種基因，所述基因選自a)編碼α-酮戊二酸脫氫酶(EC I. 2. 4. 2) El亞基的odhA基因，b)編碼二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(EC2. 3. I. 61)的sucA基因，c)編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DapA，EC4. 2. I. 52)的dapA基因，d)編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DapB,EC I. 3. I. 26)的dapB基因，e)編碼內(nèi)消旋_二氨基庚二酸脫氫酶(Ddh，EC I. 4. I. 16)的ddh基因，f)編碼二氨基庚二酸脫羧酶(LysA，EC4. I. I. 20)的IysA基因，g)編碼L-精氨酸生物合成的阻抑蛋白(ArgR)的argR基因，h)編碼鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(ArgF，EC2. I. 3. 3)的argF基因，i)編碼精氨琥珀酸合酶(ArgG，EC6. 3. 4. 5)的argG基因，j)編碼精氨琥珀酸裂解酶(ASAL) (ArgH, EC 4. 3. 2. I)的argH基因， k)編碼天冬氨酸激酶(LysC，EC 2. 7. 2. 4)的IysC基因，和 I)編碼天冬氨酸半醛脫氫酶(Asd，EC I. 2. I. 11)的asd基因。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其特征在于額外地增強(qiáng)一或多種基因，所述基因選自a)由gdh基因編碼的谷氨酸脫氫酶(EC1.4. 1.3),b)由argj基因編碼的谷氨酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC2. 3. I. 35和EC2. 3. I. I)，c)由argB基因編碼的乙酰谷氨酸激酶(EC2. 7. 2. 8)，d)由argC基因編碼的N-乙酰-Y-谷氨酰磷酸還原酶(EC I. 2. I. 38)，e)由argD基因編碼的乙酰鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(EC2. 6. I. 11),f)由PtsG基因編碼的葡萄糖攝取系統(tǒng)的葡萄糖特異性組分EIIB(PtsG)(EC 2. 7. I. 69),由ptsS基因編碼的蔗糖攝取系統(tǒng)的蔗糖特異性組分EIIB(PtsS) (EC 2. 7. I. 69)，由zwf基因編碼的葡萄糖_6磷酸I-脫氫酶(EC I. I. I. 49)，由Pgi基因編碼的葡萄糖_6磷酸異構(gòu)酶(EC 5. 3. I. 9)，由pfkA基因編碼的磷酸果糖激酶(EC 2. 7. I. 11),由fda基因編碼的果糖二磷酸醛縮酶(EC 4. I. 2. 13)，由gap基因編碼的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(EC I. 2. I. 59)，由Pgk基因編碼的磷酸甘油酸激酶(EC 2. 7. 2. 3)，由Pyk基因編碼的丙酮酸激酶(EC 2. 7. I. 40)，由aceE基因編碼的丙酮酸脫氫酶(EC I. 2. 4. I)的El亞基，由ppc基因編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(EC 4. I. I. 31)，由Pyc基因編碼的丙酮酸羧化酶(EC 6. 4. I. I)，由acn基因編碼的順烏頭酸酶(EC 4. 2. I. 3)，和由icd基因編碼的異檸檬酸脫氫酶(EC I. I. I. 42)。
8.權(quán)利要求1-7的方法，特征在于其選自分批方法、分批補(bǔ)料方法、重復(fù)分批補(bǔ)料方法和連續(xù)方法。
9.權(quán)利要求1-8的方法，特征在于從含有L-鳥(niǎo)氨酸的發(fā)酵液中回收L-鳥(niǎo)氨酸或含有 L-鳥(niǎo)氨酸的液體或固體產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用微生物通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥(niǎo)氨酸的方法，其特征在于增加所述氨基酸的輸出。
文檔編號(hào)C12P13/10GK102947460SQ201180017430
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月30日
發(fā)明者W·克萊斯, R·格斯特邁爾 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限公司