一種雙菌混合發(fā)酵生產(chǎn)l-鳥氨酸的方法
【專利摘要】一種基于微生物發(fā)酵法在L?鳥氨酸的生產(chǎn)中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。以重組菌B.subtilis 168/pMA5?argI作為精氨酸酶來源菌株和L?精氨酸高產(chǎn)菌株C.crenatum SYPA 5?5進(jìn)行雙菌混合發(fā)酵法以葡萄糖為底物生產(chǎn)L?鳥氨酸。對(duì)B.subtilis 168/pMA5?argI的轉(zhuǎn)接時(shí)間和轉(zhuǎn)接量進(jìn)行優(yōu)化，在2.5L C.crenatum SYPA5?5發(fā)酵液中，B.subtilis 168/pMA5?argI的最佳轉(zhuǎn)接時(shí)間為72h，C.crenatum SYPA5?5和B.subtilis 168/pMA5?argI的菌種轉(zhuǎn)接比例為1:500～530，在5?L發(fā)酵罐中發(fā)酵96h后L?鳥氨酸的積累量達(dá)到32.4g/L。在此過程中，高濃度L?精氨酸被轉(zhuǎn)化成L?鳥氨酸，可解除L?精氨酸合成的反饋抑制作用，從而促進(jìn)L?精氨酸合成量的提高。而L?精氨酸又被轉(zhuǎn)化成L?鳥氨酸，可進(jìn)一步提高L?鳥氨酸的產(chǎn)量。
【專利說明】
一種雙菌混合發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及到含精氨酸酶基因的重組枯草芽孢桿菌和高產(chǎn)L-精氨酸鈍齒棒桿菌混合發(fā)酵，應(yīng)用于L-鳥氨酸的生產(chǎn)，屬于生物工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]L-精氨酸酶(E.C.3.5.3.1)是尿素循環(huán)中的一種關(guān)鍵酶，其催化L-精氨酸形成L-鳥氨酸和尿素，精氨酸酶廣泛存在于各種動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，來源于Bacillus brevis,Bacillus subtil is和Baci I Ius thuringiensis等微生物的精氨酸酶已經(jīng)獲得較好的研究。
[0003]鈍齒棒桿菌C.crenatumSYPA5-5是通過篩選及層級(jí)誘變獲得的一株高產(chǎn)L-精氨酸菌株，其發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸的水平達(dá)到36.lg/L，通過進(jìn)一步的代謝工程改造和發(fā)酵工藝優(yōu)化，L-精氨酸的發(fā)酵水平可達(dá)50.1-56.3g/L。
[0004]鳥氨酸是一種堿性氨基酸，易溶于水和乙醇，微溶于乙醚等有機(jī)溶劑。鳥氨酸接受二分子NH4+和一分子C02形成一分子L-精氨酸。L-精氨酸亦可以在精氨酸酶的作用下被水解成鳥氨酸和尿素。
[0005]L-鳥氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，是人體內(nèi)尿素循環(huán)的重要中間代謝產(chǎn)物，因此其對(duì)肝臟的解毒功能具有重要的保障作用。L-鳥氨酸能夠刺激體內(nèi)生長激素的分泌，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以及糖類和脂質(zhì)的分解代謝作用。L-鳥氨酸和其他氨基酸一起制成的復(fù)方氨基酸有很好的保肝護(hù)肝以及激發(fā)病態(tài)下肝臟的活力的作用。聯(lián)合使用L-鳥氨酸和苯乙酸能有效治療肝性腦病，特別是對(duì)于鳥氨酸循環(huán)障礙的患者，L-鳥氨酸能通過促進(jìn)谷氨酰胺的合成和排泄來穩(wěn)定的降低患者血氨濃度。鳥氨酸α-酮戊二酸鹽是很好的臨床營養(yǎng)劑，促進(jìn)外科創(chuàng)傷病人的恢復(fù)，改善慢性營養(yǎng)不良，改善免疫功能。同時(shí)鳥氨酸和蘋果酸鹽和檸檬酸鹽合用能夠改善食品和飲料的口味，減少苦味。在歐洲、美國以及日本，L-鳥氨酸都是作為膳食藥物來銷售的。
[0006]工業(yè)上L-鳥氨酸的合成包括化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和L-精氨酸水解法。化學(xué)合成作為早期L-鳥氨酸的生產(chǎn)方法，一般以丙烯醛、氰化氫、氨氣、C02為原料合成L-鳥氨酸。但效果并不是很理想，主要表現(xiàn)在于合成的步驟繁瑣，產(chǎn)物得率低，而且得到的產(chǎn)物是L-鳥氨酸和D-鳥氨酸的混合物，為后期的分離純化帶來很大的困難。同時(shí)化學(xué)法合成L-鳥氨酸由于其環(huán)境的危害性，越來越不被現(xiàn)代工業(yè)所接受。生物合成法相對(duì)化學(xué)合成法具有生產(chǎn)成本較低，環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸主要是通過誘變或者基因工程的方法獲得L-鳥氨酸高產(chǎn)菌株，以較為便宜的葡萄糖甚至是淀粉等最為初始原料合成L-鳥氨酸。在這方面日本起步較早，上世紀(jì)五六十年代就開始鳥氨酸生產(chǎn)的研究，主要以誘變篩選為主。1957年kinoshita等首先報(bào)道了利用谷氨酸棒狀桿菌的瓜氨酸或精氨酸的突變株發(fā)酵生產(chǎn)鳥氨酸。此后，okumurahe Shibuya等人在這方面也做了大量的工作總結(jié)出了具有精氨酸缺陷型及精氨酸氧肟酸鹽抗性的谷氨酸棒桿菌以及具有精氨酸和瓜氨酸，以及霉酚酸抗性等標(biāo)記的檸檬酸節(jié)桿菌突變株用于工業(yè)生產(chǎn)中。國內(nèi)陳寧、劉樹慶等人在1999年開始研究鳥氨酸的生產(chǎn)，并以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，通過硫酸二乙酯和紫外線誘變定向選育出一種鳥氨酸生產(chǎn)菌，并通過發(fā)酵優(yōu)化使得鳥氨酸產(chǎn)量達(dá)到9.85g/L。近幾年，隨著代謝工程技術(shù)的興起，通過代謝工程改造的方法，鳥氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)取得一定的進(jìn)展，其中，中山大學(xué)蔣玲艷等人以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，通過表達(dá)異源的谷氨酸脫氫酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶，增加代謝流中NADPH的含量，使得L-鳥氨酸產(chǎn)量得到提高，最終到14.8g/L，而后蔣又通過代謝進(jìn)化和代謝工程的方法，最后得到鳥氨酸的產(chǎn)量為24.lg/L。通過發(fā)酵法進(jìn)行鳥氨酸生產(chǎn)可以利用較簡(jiǎn)單的碳源，如葡萄糖等，成本非常低廉，適合于工業(yè)的發(fā)展，但發(fā)酵周期一般都相對(duì)較長，而且發(fā)酵的產(chǎn)量較低對(duì)于后期分離需要較高的技術(shù)需求。
[0007]L-精氨酸水解法生產(chǎn)L-鳥氨酸包括，堿水解法和酶水解法，特別是酶水解，由于其反應(yīng)效率高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)專一性高而受到越來越多的重視。近幾年，國內(nèi)有人開始嘗試以精氨酸為底物進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-鳥氨酸。北京化工大學(xué)徐燾，通過篩選得到一株精氨酸酶活力較高的蘇云金芽孢桿菌，以此細(xì)胞作為生物催化劑，以L-精氨酸為底物進(jìn)行L-鳥氨酸生產(chǎn)，并最終得到43.57g/L L-鳥氨酸。而后張濤等人提取蘇云金芽孢桿菌的精氨酸酶，以精氨酸為底物，精氨酸酶純酶作催化劑，并最終得到72.lg/L的精氨酸酶。宋偉等人構(gòu)建表達(dá)外源精氨酸酶的E.coli BL21，并以重組細(xì)胞為催化劑，L-精氨酸為底物，最終得到112.3g/L的L-鳥氨酸
[0008]本發(fā)明通過將來源于Bacilluscereus的精氨酸酶基因argl成功在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，以重組菌B.subtilis 168/pMA5-argI作為精氨酸酶來源菌株和L-精氨酸高產(chǎn)菌株C.crenatum SYPA 5_5進(jìn)行雙菌混合發(fā)酵法以葡萄糖為底物，實(shí)現(xiàn)L-鳥氨酸的高效生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的主要研究?jī)?nèi)容:本發(fā)明以高產(chǎn)L-精氨酸菌株C.crenatum SYPA5-5和高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸菌株B.subtilis 168/pMA5-argI為基礎(chǔ)，進(jìn)行雙菌混合發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸。對(duì)其菌種比例等條件進(jìn)行優(yōu)化，在C.crenatum SYPA5-5先單獨(dú)發(fā)酵72h后，以
B.subtilis 168/pMA5-argI 和C.crenatum SYPA5-5 的生物量 1: 500-530 的比例轉(zhuǎn)接
B.subtilis 168/pMA5-argI細(xì)胞培養(yǎng)液為最佳。在5-L發(fā)酵罐中發(fā)酵96h后L-鳥氨酸的產(chǎn)量達(dá)到32.4g X L—1，L-精氨酸的含量?jī)H為0.3g X L—1，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為底物混菌發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸。
[0010]本發(fā)明采取的技術(shù)方案:
[0011 ] B.subtilis 168/pMA5_argI具有高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸的能力，且pMA5質(zhì)粒的Hpa II啟動(dòng)子是一種組成型啟動(dòng)子，不需要誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。因此以重組菌B.subtilis 168/pMA5-argl作為精氨酸酶來源菌株和L-精氨酸高產(chǎn)菌株C.crenatum SYPA 5_5進(jìn)行混菌發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為底物一步法生產(chǎn)L-鳥氨酸。
[0012]1.雙菌混合發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸的初步研究
[0013]將C.crenatumSYPA 5-5轉(zhuǎn)接LBG活化后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得二級(jí)種子，并以10%的接種量轉(zhuǎn)接5-L發(fā)酵罐中，裝液量2.5L。在發(fā)酵60h時(shí)添加200mL OD6qq為5.2至5.5左右的B.subtilis 168/pMA5-argI重組菌培養(yǎng)液(即生物量比例為1:125左右)。發(fā)酵96h后測(cè)定發(fā)酵液中L-精氨酸和L-鳥氨酸的含量。
[0014]結(jié)果表明，由于B.subtilis 168/pMA5-argI具有高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸的能力，其將L-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸的速率相較于C.crenatum SYPA5-5通過L-鳥氨酸多步合成L-精氨酸的效率高很多，因此發(fā)酵液中L-精氨酸的積累量較少，而基本被轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸。
[0015]2.B.subtilis 168/pMA5_argI添加時(shí)間對(duì)L-鳥氨酸生產(chǎn)的影響
[0016]由于枯草芽孢桿菌的生長速率比鈍齒棒桿菌的生長速率快，因此在混菌發(fā)酵中
C.crenatum SYPA5-5的生長競(jìng)爭(zhēng)力較弱。因此B.subtilis 168/pMA5_argI接入發(fā)酵液中的時(shí)間對(duì)L-鳥氨酸的產(chǎn)量具有很大的影響。
[0017]C.crenatum SYPA 5-5轉(zhuǎn)接LBG培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接到250mL搖瓶，其中裝液量25mL ο 分別研究在發(fā)酵過程中的 Oh、12h、24h、36h、48h、60h、72h、和 84h 中加入 I OOOyL，ODboo為5.2左右的重組菌B.subtilis 168/pMA5_argI (即此時(shí)B.subtilis 168/pMA5_argI和
C.crenatum SYPA 5-5的生物量比例為1: 250左右)。研究不同時(shí)間段內(nèi)接入B.subtilis168/pMA5-argI對(duì)L-鳥氨酸產(chǎn)量的影響。
[0018]3.雙菌株添加比例對(duì)L-鳥氨酸生產(chǎn)的影響
[0019]在雙菌混合發(fā)酵中，若是B.subtilis 168/pMA5-argI的轉(zhuǎn)接量太少，則其不能完全轉(zhuǎn)化發(fā)酵液中積累的L-精氨酸，但是若其轉(zhuǎn)接量過大，則其迅速生長，消耗培養(yǎng)基中的葡萄糖和其他營養(yǎng)成分，影響C.crenatum SYPA5-5生產(chǎn)L-鳥氨酸。在250mL搖瓶中，裝液量為25mL分別在C.crenatum SYPA 5-5發(fā)酵72h后轉(zhuǎn)接 100yL、200yL、500yL、100yL和2000yL的細(xì)胞OD6QQ為5.2-5.5左右的B.subtilis 168/pMA5_argI培養(yǎng)液，即此時(shí)C.crenatum SYPA5-5和B.subtilis 168/pMA5_argI菌株的生物量比例分別為1:2500、1:1250、1:500、1:250、1:125，研究其對(duì)L-鳥氨酸產(chǎn)量的影響。
[0020]4.5-L發(fā)酵罐中混菌發(fā)酵法生產(chǎn)L-鳥氨酸
[0021 ]根據(jù)混菌發(fā)酵中B.subtilis 168/pMA5_argI的轉(zhuǎn)接時(shí)間和轉(zhuǎn)接量進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果。在5-L發(fā)酵罐中進(jìn)一步對(duì)混菌發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸進(jìn)行研究。在C.crenatum SYPA 5_5發(fā)酵7211后，轉(zhuǎn)接5011^(006()()?5.2-5.5)的8.8111^1118 168/pMA5_argI 進(jìn)行混菌發(fā)酵(B.subtilis 168/pMA5-argI 和 SYPA5-5 的生物量比值約為 1:500-530)。發(fā)酵9611后測(cè)定發(fā)酵液中的L-鳥氨酸、L-精氨酸含量，生物量和殘?zhí)堑取?br>[0022]用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中L-鳥氨酸和L-精氨酸的含量。
[0023]氨基酸分析色譜條件
[0024](a)色譜柱:安捷倫色譜柱TC-C18 250*4.6*5
[0025](b)柱溫:40°C
[0026](C)流動(dòng)相:A相:稱取8.0克結(jié)晶乙酸鈉于1000毫升燒杯中，加入1000毫升水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶水溶解，再加入225微升三乙胺，攪拌并滴加5 %的醋酸，將PH調(diào)到7.20 ± 0.05;加入5毫升四氫呋喃，混合后備用。
[0027]B相:稱取12.0克結(jié)晶乙酸鈉于800毫升燒杯中；加入400毫升水?dāng)嚢柚了薪Y(jié)晶溶解;滴加5 %醋酸將pH調(diào)到7.20 ± 0.05;將此溶液加入800毫升乙腈和800毫升甲醇，混合后備用。
[0028](d)檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器338nm
[0029]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0030]pMA5質(zhì)粒的Hpa I I啟動(dòng)子是一種組成型啟動(dòng)子，不需要誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，B.subtilisl68/pMA5_argI具有高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸的能力，C.crenatum SYPA5-5具有高效合成L-精氨酸的能力，可實(shí)現(xiàn)一步法以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸，在5-L發(fā)酵罐中發(fā)酵96h后L-鳥氨酸的積累量達(dá)到32.4g/L。此法具有底物價(jià)格低廉且發(fā)酵過程不需誘導(dǎo)等優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1:將C.crenatumSYPA 5-5轉(zhuǎn)接LBG活化后，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得二級(jí)種子，并以10 %的接種量轉(zhuǎn)接5-L發(fā)酵罐中，裝液量2.5L，控制發(fā)酵罐溫度為30 V，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600r/min，pH 7.0。在發(fā)酵60h時(shí)添加200mL OD6qq為5.2至5.5左右的B.subtilis 168/pMA5-argI重組菌培養(yǎng)液(即生物量比例為1:125左右)。發(fā)酵9611后測(cè)定發(fā)酵液中L-精氨酸和L-鳥氨酸的含量。
[0032]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖，60;酵母粉，1;(NH4) 2 S04，2; KH2PO4,2.7； K2HP04,0.5；MgSO4.7Η20，0.2。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖，120;(NH4)2S04，20，酵母粉，8 ； KH2PO4,27； K2HP04,0.5；MnSO4.H20,0.5；MgSO4.7Η20，0.2。
[0034]由于B.subtilis 168/pMA5-argI生長速率快，且具有高效轉(zhuǎn)化L-鳥氨酸的特性，所以在向C.crenatum SYPA5-5發(fā)酵液中轉(zhuǎn)接B.subtilis 168/^]\^5-&找1培養(yǎng)液1211后，發(fā)酵液中前期發(fā)酵積累的L-精氨酸迅速被轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸。同時(shí)，由于此前報(bào)道中提到發(fā)酵過程中精氨酸合成途徑受到發(fā)酵液中高濃度的產(chǎn)物L(fēng)-精氨酸的反饋抑制，在此混菌發(fā)酵中，高濃度L-精氨酸被轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸，因此在一定程度上解除L-精氨酸對(duì)其合成途徑的反饋抑制作用，從而促進(jìn)L-精氨酸產(chǎn)量的提高。而L-精氨酸又被轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸，進(jìn)一步提高L-鳥氨酸的產(chǎn)量。
[0035]另一方面，由于L-鳥氨酸同時(shí)又是L-精氨酸合成途徑中的中間代謝物。在L-精氨酸合成途徑中L-鳥氨酸被轉(zhuǎn)化成L-瓜氨酸，最終形成L-精氨酸。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由于B.subtilis 168/pMA5-argI具有高效轉(zhuǎn)化L-精氨酸的能力，其將L-精氨酸轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸的速率相較于C.crenatum SYPA5-5通過L-鳥氨酸多步合成L-精氨酸的效率高很多，因此發(fā)酵液中L-精氨酸的積累量較少，而基本被轉(zhuǎn)化成L-鳥氨酸。當(dāng)72h后再轉(zhuǎn)接B.subtilis168/pMA5-argI，發(fā)酵液中的L-鳥氨酸的積累量達(dá)到最高，為26.8g.L一、
[0036]在5-L發(fā)酵罐中進(jìn)一步對(duì)混菌發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸進(jìn)行研究。在C.crenatum SYPA
5-5發(fā)酵7211后，轉(zhuǎn)接5011^(006()()?5.2-5.5)的8.8111^丨1丨8 168/pMA5_argI 進(jìn)行混菌發(fā)酵(B.subtilis 168/pMA5-argI 和 SYPA5-5 的生物量比值約為 1:500-530)。發(fā)酵9611后測(cè)定發(fā)酵液中的L-鳥氨酸、L-精氨酸含量，生物量和殘?zhí)堑取?br>[0037]結(jié)果表明，在發(fā)酵的前72h，C.crenatum SYPA 5-5的細(xì)胞OD6Qo達(dá)到57.6，殘?zhí)菫?6.4g.L—1左右。此時(shí)發(fā)酵液中共累積到L-精氨酸29.6g.L—1，L_鳥氨酸的含量?jī)H為0.5g.L—1。在此時(shí)轉(zhuǎn)接B.subtilis 168/pMA5-argI 12h后，L-精氨酸的含量迅速降到1.2g.L—1，以此同時(shí)L-鳥氨酸的含量則達(dá)到27.Sg.L—1。發(fā)酵液中殘?zhí)鞘Ｏ陆档?6.2g.L—S細(xì)胞OD6(X)則達(dá)到63.5，繼續(xù)發(fā)酵12h后(發(fā)酵96h)，發(fā)酵液中累積L-鳥氨酸32.4g.L—S而L-精氨酸的含量?jī)H有0.3g.L—I混菌的細(xì)胞OD6qq也達(dá)到69.8，發(fā)酵液中葡萄糖基本消耗完。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種以葡萄糖為底物雙菌混合發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸的方法，其特征在于，在發(fā)酵Oh時(shí)在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種C.crenatum SYPA 5_5以葡萄糖為底物發(fā)酵合成L-精氨酸，隨后在發(fā)酵體系中接種重組菌B.subtilis 168/pMA5_argI轉(zhuǎn)化L-精氨酸合成L-鳥氨酸。2.權(quán)利要求1所述的重組菌B.subtil is 168/pMA5_argI接種時(shí)間優(yōu)選發(fā)酵開始后的.72h.3.權(quán)利要求1所述的C.crenatum SYPA5-5和B.subtilis 168/pMA5_argI兩種菌株接種比例優(yōu)選1:500?530。4.權(quán)利要求1所需的發(fā)酵條件，其特征在于，首先將在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的C.crenatum SYPA5-5以10%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至5_L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵罐溫度為30°C，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速600r/min,pH 7.0；種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖，60;酵母粉，10; (NH4)2SO4，2;KH2PO4，.2.7；K2HP04,0.5；MgSO4.7H20,0.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖,120； (NH4)2SO4^O,酵母粉，8；KH2PO4,27；K2HP04,0.5；MnSO4.H20,0.5；MgS04.7Η20，0.2。
【文檔編號(hào)】C12P13/10GK105950697SQ201610574795
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】饒志明, 徐美娟, 王梅洲, 楊套偉, 張顯
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)