一種催化效率與熱穩(wěn)定性提高的n-乙酰谷氨酸激酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種催化效率與熱穩(wěn)定性提高的N?乙酰谷氨酸激酶突變體，屬于生物工程領(lǐng)域。將來源于鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum SYPA5?5)的N?乙酰谷氨酸激酶的基因進(jìn)行定點突變，使其編碼的氨基酸序列在第91位由苯丙氨酸F突變?yōu)榻M氨酸H。本發(fā)明所述的N?乙酰谷氨酸激酶突變體的催化效率是野生型的2.12倍，在37℃下的半衰期是突變前的2.78倍。本發(fā)明所得N?乙酰谷氨酸激酶突變體更有利于精氨酸的生產(chǎn)需求，為高效合成L?精氨酸奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種催化效率與熱穩(wěn)定性提高的N-乙酰谷氨酸激酶突變體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種催化效率與熱穩(wěn)定性提高的N-乙酰谷氨酸激酶突變體，屬于生物 工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] L-精氨酸是一種堿性半必須氨基酸，它具有多種生理功能。它是合成胞漿蛋白和 核蛋白的必需氨基酸;作為唯一的氨來源參與肌酸的合成;作為尿素循環(huán)的重要中間體，在 肝臟中扮演著排除多余氨的角色，防止氨過量積累而引起中毒；它還具有調(diào)節(jié)人體免疫力 的功能，可抑制腫瘤生長、促進(jìn)受傷組織愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥氨酸及 肌丁胺的直接前體，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。 因此，L-精氨酸在醫(yī)藥、食品及化工領(lǐng)域方面具有重要而廣泛的應(yīng)用。
[0003] N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl glutamate kinase)簡稱NAGK，是L-精氨酸合成途 徑的第二個酶和關(guān)鍵限速酶，同時它受終產(chǎn)物L(fēng)-精氨酸的反饋抑制。在ATP的作用下，它催 化N-乙酰谷氨酸的λ-αχτ磷酸化從而生成L-精氨酸合成的中間體N-乙酰谷氨酸磷酸。
[0004] L-精氨酸生產(chǎn)方法有水解法和發(fā)酵法。水解法存在操作費(fèi)時，收率和產(chǎn)量低，成本 高等問題，并且存在嚴(yán)重的污染而不適合大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸成 為國內(nèi)外氨基酸工業(yè)的一個十分迫切的問題。目前，用來產(chǎn)L-精氨酸的微生物菌株主要是 谷氨酸棒桿菌與鈍齒棒桿菌，為提高精氨酸產(chǎn)量，研究者們利用DNA重組技術(shù)結(jié)合代謝工程 技術(shù)調(diào)控合成精氨酸的代謝途徑，這使得精氨酸的產(chǎn)量大有提高。為進(jìn)一步提高生產(chǎn)量研 究者漸漸開始將研究重點轉(zhuǎn)向L-精氨酸限速酶一一Ν-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)，通過克隆Ν-乙酰谷氨酸激酶基因并導(dǎo)入其它菌株來表達(dá)，以及運(yùn)用定點突變技術(shù)獲得解除精氨酸對其 的反饋抑制，從而來提高發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸的能力。然而，雖然通過克隆Ν-乙酰谷氨酸激酶基 因（argB)并導(dǎo)入其它菌株獲得了NAGK的過量表達(dá)，但是NAGK的比酶活并不高即NAGK的催化 活性較弱，且熱穩(wěn)定性不好即在37°C下NAGK的半衰期為36h，而L-精氨酸的發(fā)酵周期是96h。 因此，在保持N-乙酰谷氨酸激酶過量表達(dá)的基礎(chǔ)上，提高其催化效率與熱穩(wěn)定性成為工業(yè) 生產(chǎn)的迫切需要。
[0005] 因此，本發(fā)明公開了一種催化效率與熱穩(wěn)定都顯著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突變 體，將來源于鈍齒棒桿菌(Corynebacterium crenatum SYPA5-5)的N-乙酰谷氨酸激酶的基 因進(jìn)行定點突變，使其編碼的氨基酸序列在第91位由苯丙氨酸F突變?yōu)榻M氨酸H。本發(fā)明所 述的N-乙酰谷氨酸激酶突變體F91H NAGK的催化效率（108811^^?^1)相對于野生型（513mM 一 bin-〇提高了 2.12倍，并且在37°(：下的半衰期由野生型的3611延長到10011，是突變前的2.78 倍。本發(fā)明所得N-乙酰谷氨酸激酶突變體更有利于精氨酸的生產(chǎn)需求，為高效合成L-精氨 酸奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種催化效率與熱穩(wěn)定性都提高的N-乙酰谷氨酸激 酶突變體。將來源于鈍齒棒桿菌(〇^7116&3(^61'；[11111(^6仙1：111113￥?45-5)的1'|-乙酰谷氨酸激 酶第91位的苯丙氨酸F進(jìn)行定點突變，將含突變后基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli BL21進(jìn) 行表達(dá)，蛋白純化后得到催化效率與熱穩(wěn)定性顯著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突變體。
[0007] 編碼所述突變后N-乙酰谷氨酸激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示所示。
[0008]所述突變是將第91位的苯丙氨酸F位分別突變?yōu)榻M氨酸H。
[0009]獲得所述突變體的方法，是以pET28a-argB質(zhì)粒(一種高產(chǎn)L-精氨酸的鈍齒棒桿菌 SYPA5-5)為模版，設(shè)計引物，通過重疊延伸PCR進(jìn)行定點突變得到含有突變后基因的重組質(zhì) 粒pET28a-argB F91H，將它們分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21進(jìn)行表達(dá)，獲得突變體F91HNAGK。獲得所 述突變體的方法，具體地是：
[0010] (1)突變表達(dá)載體的構(gòu)建
[0011] 通過分析N-乙酰谷氨酸激酶的3D結(jié)構(gòu)與同源序列的比對，確定91位的苯丙氨酸F 為目的突變?yōu)辄c，設(shè)計突變實驗，將該位點苯丙氨酸F突變?yōu)榻M氨酸H。以pET28a-argB質(zhì)粒 為模版，設(shè)計引物，通過重疊延伸PCR進(jìn)行定點突變得到的突變基因 argBF91HW及載體 pET28a分別用EcoRI與Sail核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后于16°C連接;然后將連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn) 化到E. col i JM109菌株，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。
[0012] (2)含突變體的基因工程菌的獲得
[0013] 制備E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-argBF9iH轉(zhuǎn)化到感 受態(tài)E.coli BL21細(xì)胞中，篩選轉(zhuǎn)化子。
[0014] (3)N_乙酰谷氨酸激酶活力測定
[0015] 酶活測定方法:3mL反應(yīng)液中含595mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷 氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP二鈉鹽，149mmol/L NH20H'HCI及適量粗酶液。于37°C 反應(yīng)lh后，加入lmL反應(yīng)終止液（1.0mol/L HCI含5%FeCl3 · 6H20,4%三氯乙酸）終止反應(yīng)。 離心，取上清測定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸收值A(chǔ)54〇。
[0016] 酶活力單位定義為1個國際單位(U)等于每分鐘內(nèi)生成Uimol產(chǎn)物N-乙酰谷氨酸氧 肟酸所需要的酶量。
[0017] (4)野生型和突變體的動力學(xué)參數(shù)與熱穩(wěn)定性的測定
[0018] 將重組E. coli BL21培養(yǎng)后破細(xì)胞，取上清即為粗酶液，將野生型和突變體經(jīng)Ni柱 純化后測定酶活力與蛋白濃度得到比酶活，通過改變底物N-乙酰谷氨酸(NAG)的濃度以及 運(yùn)用雙倒數(shù)法測得Km，Vm與Kcat的值，以及將野生型和突變體放置37°C水浴不同的時間得 到熱穩(wěn)定性曲線。
【具體實施方式】
[0019]實施例1突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及重組E.coli BL21菌株的獲得
[0020] 根據(jù)Corynebacterium crenatum SYPA5-5的argB基因序列，設(shè)計N-乙酰谷氨酸激 酶編碼基因的兩頭引物，再根據(jù)待突變的氨基酸位點來設(shè)計PCR點突變中間引物：
[0021 ]利用重疊延伸PCR體外擴(kuò)增獲得突變基因。
[0022] 用于定點突變的引物為：
[0023] PargB F:5，-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAG-3，（EcoRI)
[0024] PargB R:5，-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG-3，（SalI)
[0025] PargBF9iH Fm:5 '-GTTCAAGGGTGGTCACCGTGTGACCACTCCTG-3 '
[0026] PargBF9iH Fm:5 '-TCACACGGTGACCACCCTTGAACTCGCCCTGG-3 '
[0027] 提取鈍齒棒桿菌桿菌SYPA5-5基因組為模板；
[0028] PCR反應(yīng)條件:95 °C預(yù)變性5min，95 °C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，30個循 環(huán);72°C延伸5min，。將所得突變基因片段與克隆載體pET-28a分別用EcoR I與Sal I核酸內(nèi) 切酶進(jìn)行雙酶切，膠回收后將兩者混合，加入T4連接酶，于16 °C過夜連接，轉(zhuǎn)化至 E.coliJM109,經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行雙酶切驗證，將重組質(zhì) 粒命名為pET28a-argB F91H，并送至上海生物工程公司測序。
[0029] 將測序正確的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組E.coli BL21菌株
[0030]實施例2突變體N-乙酰谷氨酸激酶的表達(dá)及Ni-NTA純化
[0031]取凍管保藏的重組子接種至含卡那霉素（終濃度為50yg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜，按1 %接種量轉(zhuǎn)接，37 °C培養(yǎng)至0D約0.6-0.8，加人IPTG至終濃度為lmmol/L， 16°C過夜誘導(dǎo)表達(dá)。將過夜誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于10000r/min，4°C離心15min，收集菌體，用 Tris-HCI (pH8.0)緩沖液懸浮菌體，超聲波破碎細(xì)胞，然后經(jīng)0.45μπι濾膜過濾，選用表達(dá)載 體pET-28a中含有6Hi s-Tag，過Ni-NTA純化NAGK，將獲得純的NAGK酶蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析， 檢測到一條分子量約為36kDa的特異性條帶，純的NAGK酶用于蛋白濃度與酶活的測定，得到 比酶活。
[0032]實施例3野生型和突變體催化效率的比較
[0033] 將上一步得到的純酶液進(jìn)行酶促反應(yīng)：酶促反應(yīng)總體積為3mL，含595mmol/L Tris-HCI(pH8.0)，20mmol/L N-乙酰谷氨酸，20mmol/L MgCl2,20mmol/L ATP 二鈉鹽， 149mmol/LNH20H · HCI及適量粗酶液;于37°C反應(yīng)lh后，加入lmL反應(yīng)終止液（1.0mol/L HCI 含5%FeCl3 · 6H20,4%三氯乙酸)終止反應(yīng);離心，取上清測定N-乙酰谷氨酸氧肟酸的光吸 收值A(chǔ)54〇。通過改變底物N-乙酰谷氨酸(NAG)的濃度以及運(yùn)用雙倒數(shù)法測得Km，Vm與Kcat的 值。得到的結(jié)果如表1所示:N-乙酰谷氨酸激酶突變體F9 IHnagk的催化效率(Kcat/Km)由野生 型(CgNAGK)的SUnirVirr1提高到lOSSmiTVirT 1，提高了 2.12倍，因此突變體酶的催化效率 得到顯著提高，更利于精氨酸的合成。
[0034]實施例4野生型和突變體的熱穩(wěn)定性比較
[0035] 為了測定野生酶和突變酶對溫度的耐受性，將已經(jīng)純化的酶于37°C水浴不同的時 間后按上述方法測殘余酶活力，考察其熱穩(wěn)定性。將未經(jīng)37°C水浴的酶活設(shè)為100%，得到 酶的熱穩(wěn)定性曲線。結(jié)果如表1所示:N-乙酰谷氨酸激酶突變體F91Hnagk的熱穩(wěn)定性明顯比 野生型（〇8財61〇的好，其在37°(：下的半衰期由野生型的3611延長到10011，是突變前的2.78 倍。因此具有更好熱穩(wěn)定性的突變體酶在發(fā)酵周期較長的精氨酸合成中更有利的。
[0036]本發(fā)明所述的突變體不僅催化效率相比突變之前有了顯著的提高，即提高了 2.12 倍，而且熱穩(wěn)定性也得到顯著提高，即在37°C的半衰期是突變前的2.78倍。結(jié)果表明，在關(guān) 鍵位點突變氨基酸，可以獲得優(yōu)于野生型的突變體，這種策略可以廣泛應(yīng)用于酶學(xué)性質(zhì)的 改進(jìn)。
[0037]表1野生型和突變體的動力學(xué)參數(shù)及其半衰期
【主權(quán)項】
1. 一種催化效率與熱穩(wěn)定性顯著提高的N-乙酰谷氨酸激酶突變體，其特征在于，將鈍 齒棒桿菌來源的的N-乙酰谷氨酸激酶第91位的苯丙氨酸F突變?yōu)榻M氨酸H。2. 權(quán)利要求1所述突變體的編碼基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3. 權(quán)利要求1所述突變體的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求2所述的基因?qū)脞g齒棒桿 菌中，用于改善精氨酸的合成效率;但不限于應(yīng)用于改善精氨酸的合成。
【文檔編號】C12N15/54GK105907735SQ201610286036
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】饒志明, 徐美娟, 張景景, 楊套偉, 張顯, 葛小勛
【申請人】江南大學(xué)