專利名稱：構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，用于構建篩藥模型，屬生物醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
建立篩藥模型，是提高藥物篩查效率的手段，如下述參考文獻
1、儲劍虹.前列腺癌淋巴道轉移相關基因的探索.2005年4月。2、新藥(西藥)臨床前的研究指導原則匯編。3、細胞毒類抗腫瘤藥物非臨床研究技術指導原則(第二稿)2006年1月。4、鐘恩宏，孫祖越等，Bcl-2基因家族在前列腺增生與前列腺癌形成中的作用， 《實用癌癥雜志》2002，17 (5):553-560。5、鐘恩宏，孫祖越，顧正，吳建輝，朱焰，何桂林，劉桂明.依立雄胺前列腺癌細胞 (LNCaP)前列腺特異性抗原和Bcl-2蛋白體外表達抑制作用，《中國藥理學與毒理學雜志》 2003，17(1)29-34。6、鐘恩宏，孫祖越，吳建輝，朱焰.依立雄胺對激素依賴型人前列腺癌細胞的體外抑制作用，《中國新藥與臨床雜志》，2004，23 (8) :485-488。7、儲劍虹，孫祖越，人前列腺癌移植性轉移動物模型的研究進展，《實驗動物與比較醫(yī)學》2005，25 (2) :119-125。8、儲劍虹，吳建輝，朱焰，蔣秀蓉，劉桂明，何桂林，孫祖越，利用PC-3M-1E8細胞亞系建立人前列腺癌淋巴道轉移模型，《中國藥理學與毒理學雜志》2005，19(2) 140-145。9、Jian-hong Chu, Zu-yue Sun, Xue Lian Meng, Jian Hui ffu, Gui Lin He, Gui Ming Liu and Xiu Rong Jiang. Differential metastasis-associated gene analysis of prostate carcinoma cells derived from primary tumor and spontaneous lymphatic metasis in nude mice with orthotopic implantation of PC—3M cells. Cancer Letters 2006，233(1) : 79-8 10、儲劍虹，李志玲，孟雪蓮，吳建輝，劉向云，邱曉燕，朱焰，劉桂明，何桂林，蔣秀蓉，曹霖，孫祖越.利用基因芯片法探索人前列腺癌細胞PC-3M在裸鼠體內淋巴道轉移相關基因·《中國癌癥雜志》2006，16(1) :31-34。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于構建前列腺癌細胞體外浸潤模型。本發(fā)明目的通過下述技術方案實現(xiàn)
一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，取對數(shù)生長期生長良好的腫瘤細胞，采用侵襲小室法構建體外侵襲模型，將無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮多孔濾膜粘附于侵襲小室的上、 下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠于37°C下作用1小時，使膠凝固，前列腺癌細胞離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸，加到侵襲小室的上室中，下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，置37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時，計數(shù)。具體，提供一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型取對數(shù)生長期生長良好，長至 70%密度的前列腺癌細胞，用F12培養(yǎng)液預處理細胞兩天；在無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮 Sum孔徑多孔濾膜的上表面鋪以50ul的濃度為lg/L基質膠于37°C下作用1小時，使膠凝固，再以無血清培養(yǎng)液洗滌兩次后備用；將處理過的多孔濾膜粘附于侵襲小室的上室底部， 并在濾膜下室面做標記；下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液；將粘有多孔濾膜的上室插入下室，并確保上、下室間無氣泡；取生長至對數(shù)期的上述癌細胞，用2. 5g/L胰酶消化離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸，以IO5個細胞加到侵襲小室的上室中；蓋上帽子，置37°C、 5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時；取出濾膜，用棉簽拭去濾膜上表面細胞；用0. 1%的結晶紫染色數(shù)分鐘，于200倍光鏡下計數(shù)多孔濾膜下室面侵襲的細胞數(shù)，計數(shù)中間和四周共5個視野，每組計數(shù)三份樣本，求出平均數(shù)，重復上述過程1次。本發(fā)明提供針對上述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型使用的侵襲小室，其特征在于由有機玻璃或玻璃材質的下室、上室和帽部組成，其中，所述的下室設有一圓底形小孔， 圓底形小孔上方為一延至上表面的擴徑部，在擴徑部與圓底形小孔間形成一平臺；所述的上室外廓為T形，其內設一孔徑與圓底形小孔的孔徑相同的通孔，上室的下部插在擴徑部內，周向與擴徑部匹配，底部與平臺貼合，上室上部的底面與下室的上表面貼合。如上述所述的侵襲小室，至少上室的下部外廓與下室的擴徑部表面為磨砂玻璃狀，增加下室與上室的密配合度，提高氣密性。下室與上室的外廓為圓柱形，上室的上部與下室的外徑相同，當上室的下部插至下室的擴徑部的平臺時，上、下室形成一密配合的圓柱體，帽部蓋在上室的上部平面處，帽部與上室的上部外廓周圍有環(huán)隙。本發(fā)明提供針對上述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的用途，用于構建腫瘤細胞體外浸潤篩藥模型。本發(fā)明的優(yōu)越性在于
提供了一種腫瘤細胞體外浸潤模型，為藥物篩查提供了便利；自制的侵襲小室結構簡單，成本低廉，可重復使用，使實驗成本大大降低，因實驗時每個裝置為獨立的個體，徹底杜絕了交叉污染，提高了實驗的準確率。


圖1 侵襲小室分解結構示意圖。圖2侵襲小室圖片，其中，圖a為粘上多孔濾膜的細胞上室，b為將上室插入下室， c為蓋上帽部的侵襲小室。圖3為培養(yǎng)瓶中生長的PC-3M細胞電鏡照片。圖4PC-3M細胞穿透多孔濾膜結晶紫染色，小孔中紫色顆粒為穿透的PC-3M細胞 400 X。圖 1 中
1一下室，11一圓底形小孔，12—擴徑部， 2—上室，21—通孔，3—帽部。
具體實施例方式一，侵襲小室的制備
如圖1侵襲小室分解結構示意圖所示，侵襲小室由玻璃材制的下室1、上室2和帽部3 組成，其中，下室1設有一直徑為0. 9cm圓底形小孔11，圓底形小孔11上方為一延至上表面的擴徑部12，在擴徑部12與圓底形小孔間形成一平臺；上室2外廓為T形，其內設一孔徑與圓底形小孔11的孔徑相同的直徑為0. 9cm通孔21，上室1的下部插在擴徑部12內，周向與擴徑部12匹配，底部與平臺貼合，上室2上部的底面與下室1的上表面貼合。方便清洗， 且可根據(jù)實驗需要選擇本發(fā)明的個數(shù)，各裝置間因獨立放置，不會有交叉污染情況出現(xiàn)。其中，至少對上室2的下部外廓與下室1的擴徑部12表面進行粗糙處理的磨砂玻璃，增加上室2與下室1接觸面的密封性。本實施例中，下室1與上室2的外廓為圓柱形，上室2的上部與下室1的外徑相同， 當上室的下部外徑為1. 6cm，下室1的擴徑部徑向尺寸亦為1. 6cm,當上室2的下部插至下室1的擴徑部12的平臺時，上、下室形成一密配合的圓柱體，帽部3蓋在上室2的上部平面處，帽部與上室的上部外廓周圍有環(huán)隙，以利于透氣。二，構建前列腺癌細胞體外浸潤模型
一)實驗材料 1、主要試劑
(1)Matrigel (基質膠)北京寶曼科技有限公司，批號BM_1803 ；
(2)胎牛血清(FBS)=HyClone生物化學制品(北京)有限公司，批號NSK0069 ；
(3)F12培養(yǎng)基=HyClone生物化學制品(北京)有限公司，批號NUC0151。2、主要儀器
(1)超凈工作臺=Boxun；
(2)CO2 培養(yǎng)箱=Heraeus ；
(3)倒置相差顯微鏡=Motic公司；
(4)多聚碳酸酯膜上海歡奧科貿(mào)有限公司；
二)細胞資料
1、細胞PC_3M細胞由北京大學醫(yī)學部病理學教研室提供；
2、細胞株培養(yǎng)條件
PC-3M細胞株于含10%胎牛血清，青鏈霉素各100U/ml的F-12培養(yǎng)基，37°C ,5% CO2的飽和濕度下培養(yǎng)，細胞成貼壁生長，用0. 25%的胰酶消化傳代。三)細胞侵襲重建基底膜實驗
1，取對數(shù)生長期生長良好，長至70%密度的癌細胞，用F12培養(yǎng)液預處理細胞兩天； 2，采用侵襲小室法構建體外侵襲模型進行實驗，見圖2，其中，圖a為粘上多孔濾膜的細胞上室，b為將上室插入下室，c為蓋上帽部的侵襲小室。3，在無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮(PVP)多孔濾膜(Sum孔徑)的上表面鋪以50ul的 Matrigel (lg/L)于37°C下作用1小時，使膠凝固，再以無血清培養(yǎng)液洗滌兩次后備用；
4，將濾膜粘附于侵襲小室的上室底部，并在濾膜下室面做標記；
5，下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液；
6，將粘有濾膜的上室插入下室，并確保上、下室間無氣泡；
57，取生長至對數(shù)期的癌細胞，用2. 5g/L胰酶消化離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸， 以IO5個細胞加到侵襲小室的上室中；
8，蓋上帽子，置37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時； 9，取出濾膜，用棉簽拭去濾膜上表面細胞；
10，用0. 1%的結晶紫染色數(shù)分鐘，于200倍光鏡下計數(shù)膜背面侵襲的細胞數(shù)，計數(shù)中間和四周共5個視野，每組計數(shù)三份樣本，求出平均數(shù)，實驗重復1次。方法取對數(shù)生長期生長良好的前列腺癌細胞(PC-3M)，采用侵襲小室法構建體外侵襲模型進行檢測，無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮(PVP)多孔濾膜(Sum孔徑)粘附于侵襲小室的上、下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠(Matrigel) (lg/L)于37°C下作用1小時，使膠凝固。癌細胞離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸，加到侵襲小室的上室中， 下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，置37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時。計數(shù)。結果
如圖3為培養(yǎng)瓶中生長的PC-3M細胞電鏡照片和圖4為PC-3M細胞穿透多孔濾膜結晶紫染色，小孔中紫色顆粒為穿透的PC-3M細胞400X所示，體外侵襲實驗多孔濾膜上細胞計數(shù)PC-3M細胞濾膜穿透率為80個。利用自制侵襲小室模型，可以成功復制體外PC-3M細胞侵襲模型。多孔濾膜經(jīng)結晶紫染色后，可以清楚看到癌細胞穿透濾膜，計數(shù)穿透細胞數(shù)為80個。
權利要求
1.一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，其特征在于取對數(shù)生長期生長良好的腫瘤細胞，采用侵襲小室法構建體外侵襲模型，將無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮多孔濾膜粘附于侵襲小室的上、下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠于37°C下作用1小時，使膠凝固，腫瘤細胞離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸，加到侵襲小室的上室中，下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，置37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時，計數(shù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，其特征在于取對數(shù)生長期生長良好，長至70%密度的前列腺癌細胞，用F12培養(yǎng)液預處理細胞兩天；在無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮8um孔徑多孔濾膜的上表面鋪以50ul的濃度為lg/L基質膠于37°C下作用 1小時，使膠凝固，再以無血清培養(yǎng)液洗滌兩次后備用；將處理過的多孔濾膜粘附于侵襲小室的上室底部，并在濾膜下室面做標記；下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液；將粘有多孔濾膜的上室插入下室，并確保上、下室間無氣泡；取生長至對數(shù)期的上述癌細胞，用2. 5g/L 胰酶消化離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸，以IO5個細胞加到侵襲小室的上室中；蓋上帽子，置37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時；取出濾膜，用棉簽拭去濾膜上表面細胞；用 0. 1%的結晶紫染色數(shù)分鐘，于200倍光鏡下計數(shù)多孔濾膜下室面侵襲的細胞數(shù)，計數(shù)中間和四周共5個視野，每組計數(shù)三份樣本，求出平均數(shù)，重復上述過程1次。
3.針對權利要求1或2所述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型使用的侵襲小室，其特征在于由有機玻璃材制的下室、上室和帽部組成，其中，所述的下室設有一圓底形小孔，圓底形小孔上方為一延至上表面的擴徑部，在擴徑部與圓底形小孔間形成一平臺；所述的上室外廓為T形，其內設一孔徑與圓底形小孔的孔徑相同的通孔，上室的下部插在擴徑部內，周向與擴徑部匹配，底部與平臺貼合，上室上部的底面與下室的上表面貼合。
4.根據(jù)權利要求3所述的侵襲小室，其特征在于，至少上室的下部外廓與下室的擴徑部表面為磨砂玻璃。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的侵襲小室，其特征在于，下室與上室的外廓為圓柱形，上室的上部與下室的外徑相同，當上室的下部插至下室的擴徑部的平臺時，上、下室形成一密配合的圓柱體，帽部蓋在上室的上部平面處，帽部與上室的上部外廓周圍有環(huán)隙。
6.針對權利要求1或2所述構建前列腺癌細胞體外浸潤模型的用途，用于構建前列腺癌細胞體外浸潤篩藥模型。
全文摘要
本發(fā)明涉及構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，用于構建篩藥模型，屬生物醫(yī)藥技術領域。一種構建前列腺癌細胞體外浸潤模型，取對數(shù)生長期生長良好的腫瘤細胞，采用侵襲小室法構建體外侵襲模型，將無聚碳酸酯聚乙烯吡咯烷酮多孔濾膜粘附于侵襲小室的上、下室之間，在濾膜的上表面鋪以50ul的基質膠于37℃下作用1小時，使膠凝固，腫瘤細胞離心后以無血清的F12培養(yǎng)液重懸，加到侵襲小室的上室中，下室加入10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，置37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約10小時，計數(shù)。發(fā)明提供了一種腫瘤細胞體外浸潤模型，為藥物篩查提供了便利；自制的侵襲小室結構簡單，成本低廉，可重復使用，使實驗成本大大降低，因實驗時每個裝置為獨立的個體，徹底杜絕了交叉污染，提高了實驗的準確率。
文檔編號C12Q1/02GK102409024SQ201010290458
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月25日 優(yōu)先權日2010年9月25日
發(fā)明者劉向云, 孫祖越 申請人:上海市計劃生育科學研究所