專利名稱：一株高產(chǎn)漆酶菌株及發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用一株高產(chǎn)漆酶的菌株(Pycnoporus sp. STOC-U)及利用該菌株經(jīng)種子 培養(yǎng)和以豆粕(或硝酸鈉)為氮源，以麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維二糖)等為碳源發(fā)酵 生產(chǎn)漆酶發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，所制備的酶能被應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、工業(yè)和環(huán)境廢 水處理等方面，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶(Laccase，EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅的多酚氧化酶，具有廣泛的底物，不僅 能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質(zhì)素、去除許多有毒酚類物質(zhì)如苯氧基類除草 劑等的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業(yè)廢水的毒性，因此在造紙、環(huán)保、食品、 醫(yī)藥衛(wèi)生、生物檢測、改善草坪土壤結(jié)構(gòu)等領(lǐng)域具有較大的研究和應(yīng)用價值。漆酶廣泛分布于真菌、植物、動物、細菌和昆蟲中。但用于生產(chǎn)漆酶的主要是擔子 菌亞門的白腐真菌?，F(xiàn)有研究表明，漆酶在制漿、織物脫色、生物傳感器、食品工業(yè)、環(huán)保等方面的應(yīng)用 有巨大的潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明篩選并提供了一株高產(chǎn)漆酶的野生菌株(Pycnoporus sp. STOC-U)及利用 該菌株經(jīng)種子培養(yǎng)和以豆粕(或硝酸鈉)為氮源，以麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維二糖) 等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，所制備的漆酶可廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、工業(yè)和環(huán) 境廢水處理等方面，來替代價格昂貴的進口漆酶。本發(fā)明的技術(shù)方案一種高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株，其命名為Pycnoporus sp. SYBC-L3,已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :M2010235，保藏日 期2010年09月15日。用該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和以豆粕(或硝酸鈉)為氮源，以麥芽糖(或葡萄 糖、果糖、纖維二糖)等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)漆酶；工藝為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以質(zhì)量體積濃度計5%葡萄糖，酵母汁，0.5%蛋白胨。接種工 藝取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無菌水沖洗， 并打碎成均勻的孢子懸液.取Iml孢子懸液接入250ml規(guī)格的三角瓶，裝液量為50ml。培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30度，恒溫培養(yǎng)2d，即為發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。⑵產(chǎn)酶培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)基(IL)豆粕(或硝酸鈉)6g，麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維 二糖)12g，五水硫酸銅0. 4g，磷酸二氫鉀lg，磷酸氫二鈉0. 2g，七水硫酸鎂0. 5g，硫酸錳 0. 034g.初始pH:自然。發(fā)酵罐規(guī)格為容量5L.實際發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量為3L
發(fā)酵參數(shù)轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30度·通氣量1. 4L/min. 120h。根據(jù)上述條件，在5L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵液的漆酶活力最高達60000U/L以上。本發(fā)明從廣東省采集的枯木中篩選出一種高產(chǎn)漆酶的野生密孔菌屬菌株，命名為 Pycnoporus sp.SYBC-L3。1、本菌株的篩選1.1平板初篩樣品的處理方法將材料用少量無菌水30°C浸泡Mh，之后采用梯度稀釋法稀釋 至10_8，取ImL均勻涂布在121°C滅菌20min的含有愈創(chuàng)木酚(α-萘酚)0. 04%的PDA(馬 鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2% )平板培養(yǎng)基上30°C恒溫培養(yǎng)3d，挑取周邊有紅色變色圈 的菌落劃線分離。將分離后的能產(chǎn)生變色圈的菌株重新接種至新的平板，并記錄其變色圈 直徑，篩選出產(chǎn)漆酶活力較高的菌株保藏備用。1. 2搖瓶復篩將長滿菌絲的平板用IOmL無菌水沖洗，吸取ImL接入種子培養(yǎng)基(葡萄糖5%， 酵母膏1%，蛋白胨0.5%，pH自然，121°C滅菌20min)，種子培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶 中裝50mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/min搖床恒溫培養(yǎng)48小時，取菌懸液(按接 種量10% )接入液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖1%，酒石酸銨0· 4%,KH2PO4 0. 1%,Na2HPO4 0. 02%, MgSO4 ‘ 7H20 0. 05%, CuSO4 0. 0007%, MnSO4 0. 0034%，121°C滅菌 20min)，液態(tài)發(fā) 酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基裝液量為250mL三角瓶中裝50mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速200r/min，搖 床恒溫培養(yǎng)8天。1. 3經(jīng)上述兩種方法篩選最終篩選到一株漆酶活力相對較高的菌株，平板菌落 (

圖1)，電鏡(圖2.)，16S rDNA序列鑒定(見序列.)并鑒定確定為密孔菌屬，命名為 Pycnoporus SP.SYBC-L3。2、酶活的測定方法3mL 反應(yīng)體系中包括 0. 5mll0mmol/LDMPO，6-二甲氧基酚)，2. 4ml0. lmol/L 磷酸 氫二鈉-檸檬素緩沖液(PH3. 5),0. Iml粗酶液(發(fā)酵液經(jīng)冷凍高速離心機12000g、4°C離 心10分鐘，得到上清液即為粗酶液，視活力稀釋)，以去離子水替代粗酶液溶液作為空白對 照，在469nm處測吸光值每隔IOs讀取一次吸光度值，一般持續(xù)進行Imin后停止測定，以 反應(yīng)的線性范圍計算酶活。酶活力定義1分鐘催化一微摩爾底物所需酶量，酶活性以U Ι—1 表不。本發(fā)明的有益效果首先提供了 一株高產(chǎn)漆酶的菌株及用該菌為出發(fā)菌株采用液體發(fā)酵制備漆酶的 方法。本發(fā)明的菌種和發(fā)酵產(chǎn)酶方法與其它菌種和制備漆酶的方法相比較，具有如下特
點·1、發(fā)酵性能穩(wěn)定，菌體易于培養(yǎng).2、產(chǎn)酶周期短，在第5天即可停止發(fā)酵.3、產(chǎn)酶活力高，最高可達60000U/L以上.4、粗酶液中漆酶含量約占總蛋白含量的80%以上，在胞外成為主導產(chǎn)物，便于分 離純化.
5、粗酶性質(zhì)穩(wěn)定，以DMP為底物時，在酸性環(huán)境下能發(fā)揮最大催化功效，最適溫度 為陽度，較耐熱。6、作用底物廣泛，有廣闊的應(yīng)用前景.因此本發(fā)明的菌株和發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法所生產(chǎn)出來的漆酶可廣泛使用于食品、農(nóng) 業(yè)、畜牧業(yè)、工業(yè)和環(huán)境廢水處理等方面，并可替代價格昂貴的進口漆酶，因此本發(fā)明的菌 種和發(fā)酵產(chǎn)酶方法有廣泛的工業(yè)使用價值和顯著的經(jīng)濟效益前景。附圖表說明圖1和圖2分別為Pycnoporus sp. SYBC-L3菌株平板菌落和掃描電鏡形態(tài)。生物材料樣品保藏Pycnoporus sp. STOC-L3已保存于已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號 為CCTCC NO :M 2010235，保藏日期 2010 年 9 月 15 日.
具體實施例方式實施例1取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無菌水 沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.每Iml孢子懸液接入50ml種子培養(yǎng)基Q50ml規(guī)格的三 角瓶)，準備若干份。培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30度，恒溫培養(yǎng)2d，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。在5L發(fā)酵罐中裝入3L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按10%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng) 條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量1. 4L/hour.培養(yǎng)時間120h，發(fā)酵液酶活力達 60200U/L。 產(chǎn)酶培養(yǎng)基為豆粕18g，麥芽糖36g，五水硫酸銅1. 2g，磷酸二氫鉀3g，磷酸氫二鈉 0. 6g，七水硫酸鎂1. 5g，硫酸錳0. 102g.初始pH 自然。實施例2發(fā)酵產(chǎn)酶種子的培養(yǎng)同例1。在5L發(fā)酵罐中裝入3L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按10%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng) 條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量1. 4L/hour.培養(yǎng)時間120h，發(fā)酵液酶活力達 48200U/L。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為豆粕18g，葡萄糖36g，五水硫酸銅1. 2g，磷酸二氫鉀3g，磷酸氫二鈉 0. 6g，七水硫酸鎂1. 5g，硫酸錳0. 102g.初始pH 自然。實施例3發(fā)酵產(chǎn)酶種子的培養(yǎng)同例1。在5L發(fā)酵罐中裝入3L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按10%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng) 條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量1. 4L/hour.培養(yǎng)時間120h，發(fā)酵液酶活力達 53000U/L。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為豆粕18g，果糖36g，五水硫酸銅1. 2g，磷酸二氫鉀3g，磷酸氫二鈉 0. 6g，七水硫酸鎂1. 5g，硫酸錳0. 102g.初始pH 自然。實施例4發(fā)酵產(chǎn)酶種子的培養(yǎng)同例1。
在5L發(fā)酵罐中裝入3L產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按10%接種量，加入上述發(fā)酵產(chǎn)酶種子，培養(yǎng) 條件為轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30°C .通氣量1. 4L/hour.培養(yǎng)時間120h，發(fā)酵液酶活力達 51800U/L。產(chǎn)酶培養(yǎng)基為硝酸鈉18g，麥芽糖36g，五水硫酸銅1. 2g，磷酸二氫鉀3g，磷酸氫二 鈉0. 6g，七水硫酸鎂1. 5g，硫酸錳0. 102g.初始pH 自然。
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株，命名為Pycnoporus sp. SYBC-L3，已保存于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 2010235，保藏日期2010年09月15日。
2.用權(quán)利要求1所述的菌株發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，其特征在于用該菌為出發(fā)菌種，經(jīng) 種子培養(yǎng)和以豆粕(或硝酸鈉)為氮源，以麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維二糖)等為碳源 發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，工藝為(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以質(zhì)量體積濃度計5%葡萄糖，酵母汁，0.5%蛋白胨。 接種工藝取斜面菌種一環(huán)在PDA平板上點接菌絲，30°C培養(yǎng)7天，取一平板用IOml無 菌水沖洗，并打碎成均勻的孢子懸液.取Iml孢子懸液接入250ml規(guī)格的三角瓶，裝液量為 50ml。培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)速200rpm，溫度30°C，恒溫培養(yǎng)2天，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子。(2)產(chǎn)酶培養(yǎng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基IL培養(yǎng)基計算豆粕(或硝酸鈉)6g，麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維 二糖)12g，五水硫酸銅0. 4g，磷酸二氫鉀lg，磷酸氫二鈉0. 2g，七水硫酸鎂0. 5g，硫酸錳 0. 034g.初始pH:自然。發(fā)酵罐規(guī)格為5L容量.實際發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝液量為3L。發(fā)酵參數(shù)接種量10%，轉(zhuǎn)速200r/min.溫度30度.通氣量1. 4L/min.培養(yǎng)時間5_8天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株(Pycnoporus sp.SYBC-L3)，已保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 2010235，保藏日期2010年9月15日。同時還發(fā)明了以該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)種子培養(yǎng)和以豆粕(或硝酸鈉)為氮源、以麥芽糖(或葡萄糖、果糖、纖維二糖)等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法，發(fā)酵液最高酶活可達60000U/L以上。所產(chǎn)漆酶可廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)廢水處理等領(lǐng)域，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/645GK102080046SQ20101028989
公開日2011年6月1日 申請日期2010年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月25日
發(fā)明者劉家揚, 廖祥儒, 張峰, 蔡宇杰 申請人:江南大學