專利名稱：一種快速鑒定棉花中轉基因成分的檢測方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種快速鑒定棉花中轉基因成分的檢測方法 及其應用。
背景技術：
棉花不僅可作為纖維原料應用在紡織品上，也是動物飼料和各種加工食品組分原 材料的重要來源。目前有許多國家包括印度、美國、中國、阿根廷、南非等均種植有轉基因棉 花。轉基因棉花種植發(fā)展迅速，截止到2009年美國、印度和中國的轉基因棉花種植面積分 別為320萬公頃、840萬公頃、大于370萬公頃，約占本國棉花種植面積的88%、89%、大于 60%。隨著轉基因棉花越來越廣泛的種植，出于對轉基因作物安全性的考慮，日本、歐盟等 許多國家相繼建立了轉基因食品標識制度。我國于2002年3月20日起施行《農(nóng)業(yè)轉基因 生物標識管理辦法》，要求對5類轉基因生物所涉及的17種轉基因產(chǎn)品進行標識，其中也包 括了轉基因棉花種子。因此建立一套方便、快捷的轉基因產(chǎn)品檢測技術是貫徹標識制度的 重要前提。近年來國內外關于轉基因植物檢測的報道多涉及轉基因大豆、玉米及其加工產(chǎn) 品，檢測方法中以多重PCR技術較為常見。而對于轉基因棉花的檢測研究則報道較少，目前 有關轉基因棉花檢測技術包括SSR(simple sequences r印eat，簡單重復序列)PCR技術和 ELISA方法等。但是，現(xiàn)有的檢測技術操作復雜，檢測耗時長，且無法同時檢測轉基因棉花中 多個外源基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的是克服現(xiàn)有技術的缺點與不足之處，提供一種快速鑒定棉花中 轉基因成分的檢測方法。本發(fā)明的另一目的在于提供所述檢測方法的應用。本發(fā)明是采用以下方案實現(xiàn)的一種快速鑒定棉花中轉基因成分的檢測方法，包 含以下步驟(1)設計多重PCR的6對引物，分別為sadl-F 5' -CCACGAGACAGCCTATACCAAAAT-3，；sadl-R 5' -CCCTAACCAAAGCCACGCA—3’ ；GUS-F :5’ -CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’ ；GUS-R :5’ -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3‘；CrylAb/Ac-F 5' -GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAA-3，；CrylAb/Ac-R 5' -TTCCAATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3，；NPTII-F :5’ -CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3’ ；NPTII-R :5，-CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3，；NOS-F :5，-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3，；NOS-R :5’ -AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3’ ；
CaMV35S-F 5' -ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3，；CaMV35S-R 5' -CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3，；(2)檢測以棉花基因組DNA為模板，在PCR反應中加入步驟⑴設計的所有引物， 進行PCR、電泳，從而得知所檢測的棉花是否為轉基因棉花。所述棉花基因組DNA優(yōu)選通過以下步驟提取得到將棉花籽進行脫絨，用水浸泡 脫絨后的棉花籽5 9h，接著研碎，再提取棉花籽基因組DNA ；所述棉花基因組DNA更優(yōu)選通過以下步驟提取得到將一粒棉花籽進行脫絨，用 水浸泡脫絨后的棉花籽5 9h，接著研碎，于40 70°C放置30 50min，再提取棉花籽基 因組DNA ；所述的脫絨優(yōu)選通過濃硫酸進行脫絨；所述的濃硫酸指的是濃度至少為體積百分比98%的硫酸；所述的提取優(yōu)選通過基因組DNA提取試劑盒進行提??；更優(yōu)選為按照基因組DNA 提取試劑盒的說明書進行提取，其中的改進之處在于(1)裂解水浴時間延長；(2)離心時 間延長；所述PCR的反應體系優(yōu)選為其中所用的引物終濃度分別是引物sadl-F和引物 sad 1-R分別為0. 1 μ mo 1 /L、引物⑶S-F和引物⑶S-R分別為0. 4 μ mo 1 /L、引物Cry lAb/Ac-F 和引物 CrylAb/Ac-R 分別為 0. 1 μ mol/L、引物 NPTII-F 和引物 NPTII-R 分別為 0. Iymol/ L、引物NOS-F和引物NOS-R分別為0. 4 μ mol/L、引物CaMV35S_F和引物CaMV35S_R分別為 0.4 μ mol/L ；所述PCR的反應體系更優(yōu)選為使用PCR反應試劑盒，每50 μ L反應體系中含有 Mix 1 溶液(含 Buffer、dNTP、MgCl2)25yL、Mix 2 (含 Taq DNA 聚合酶)0. 25 μ L，引物終 濃度分別為0. 1,0.4,0. 1,0. 1、0.4、0.41111101/1(依照上述引物順序)，模板0嫩為150叫， 用雙蒸水將體積調整為50 μ L0所述的PCR反應試劑盒優(yōu)選為Takara寶生物公司的Multiplex PCR AssayKit(DRR060A)；所述PCR的反應條件為94°C Imin -MV 30s, 60. 4°C 90s，72°C 90s，35 個循環(huán)； 72°C, IOmin ；所述電泳的條件優(yōu)選為質量體積比2. 5%的瓊脂糖凝膠，80V電泳；上述的檢測方法還可應用于大米、菜籽粕或大豆中的轉基因成分的鑒定。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明為轉基因棉花的檢測提供了較為可靠和簡便的檢測方法，所建立的體 系可重復性高，經(jīng)多次試驗穩(wěn)定性好。其檢測結果與其他檢測技術相比，具有更大的可靠性 和適應性，簡化了檢測步驟，提高了檢測效率，從而為轉基因棉花的檢測提供更有為效的檢 測手段。本發(fā)明中的內標準基因sad 1相當于陽性對照，這樣可以保證抽提得到的棉花基 因組DNA是可以進行PCR的，PCR的反應條件和反應體系是成功的。(2)本發(fā)明能成功的從一顆棉花籽中提取到DNA、并將其用于PCR檢測，本發(fā)明能 從棉花籽中一次測出6種基因，步驟少，效率高，結果準確可靠。因此本發(fā)明可應用于較少 數(shù)量的樣品抽樣檢測的場合。


圖1是實施例1的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中泳道M為DL2000的核酸分子量標準；泳道1為轉基因棉花籽；泳道2為未含轉基 因成分的棉花籽。圖2是實施例2的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中泳道M為DL2000的核酸分子量標準；泳道1為質粒PTF102 ；泳道2為轉基因大米； 泳道3為轉基因菜籽柏；泳道4為轉基因大豆。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。實施例1取棉花籽1粒(已知為轉基因棉花籽SGK321品系轉Bt棉花標準樣品，由石家莊 市農(nóng)業(yè)科學研究院提供)，用體積百分比為98%的濃硫酸脫絨處理(參考文獻張存信《棉 花種子硫酸脫絨技術》，北京農(nóng)業(yè))，將脫絨后的棉花籽用水浸泡6h，然后取出放入塑料袋研 碎，接著放入65°C烘箱稍微烘干(30min)，使用基因組DNA提取試劑盒(Promega的wizard genomic DNA purification kit)，按照說明書進行提取，其中的改進之處在于(1)裂解水 浴時間延長，從說明書的20min延長至40min ； (2)離心時間延長，從說明書的5min延長至 8min。提取后棉花籽基因組經(jīng)紫外分光光度計測定濃度為276ng/ μ L，純度為0D260/280為 1. 76，將提取后棉花籽DNA稀釋成濃度為50ng/ μ L。再取棉花籽一粒(為未含有轉基因成分的棉花籽，孟山都農(nóng)業(yè)公司)，重復以上步 驟，最后將提取后棉花籽DNA稀釋成濃度為50ng/ μ L。取2支200yLPCR管，加入PCR反應試劑盒(Multiplex PCR Assay Kit，DRR060A， Takara)中 Mix 1 (含 Buffer, dNTP、MgCl2) 25 μ L，Mix 2 (含 Taq DNA 聚合酶)0· 25 μ L,體 系中多重PCR引物的終濃度依次分別為0. 1,0.4,0. 1,0. 1、0. 4、0. 4ymol/L(依照sadl GUS :CrylAb/Ac =NPTII =NOS :CaMV35S順序)，2支管中分別加入2種樣品的模板DNA各 3 μ L (50ng/ μ L)，ddH20將體積調整為50 μ L。將PCR反應管放入PCR儀中，以94°C，Imin ； 940C，30s, 60. 4°C，90s, 72°C，90s, 35 個循環(huán)；72°C，IOmin 條件擴增，分別取反應液 8 μ L 進 行DNA瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度為2.5%)，在凝膠成像儀中成像(如圖1所示)。泳道1有 5條清晰條帶，從大到小依次為sadl基因、CrylAb/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S 基因，證明此棉籽中含有CrylAb/Ac、NPTII、N0S、CaMV35S共4種外源基因。泳道2所示只 有1條清晰條帶，是內源sad 1基因，證明此棉花籽中不含⑶S基因、Cry lAb/Ac基因、NPTII 基因、NOS基因和CaMV35S基因。實施例2用基因組DNA試劑盒分別提取大米、菜籽粕和大豆的基因組DNA。提取后三種樣品 基因組DNA稀釋成濃度為50ng/ μ L。取質粒PTF102(購自Promega公司)(50ng/μ L)作為對照。取4支200 μ LPCR管， 加入 PCR 反應試劑盒(Multiplex PCR Assay Kit, DRR060A, Takara)中 Mix 1 (含 Buffer、 dNTP、MgCl2) 25 μ L，Mix 2 (含Taq DNA聚合酶)0. 25 μ L，體系中引物終濃度分別為0. 1、
50. 4,0. 1,0. 1、0· 4、0. 4ymol/L (依照 sadl :GUS :CrylAb/Ac =NPTII :N0S :CaMV35S 順序)。4 支管中分別加入4種樣品的模板DNA各3 μ L (50ng/ μ L)，ddH20將體積調整為50 μ L。將PCR 反應管放入 PCR 儀中，以 94°C, Imin ；94°C，30s，60. 4°C，90s，72°C，90s，35 個循環(huán)；72°C, IOmin條件擴增，分別取反應液8 μ L進行DNA瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度為2.5%)，在凝膠成 像儀中成像(如圖2所示)。泳道1有三條清晰條帶，證明此質粒PTF102中含有⑶S、N0S、 CaMV35S共3種外源基因；泳道2有4條清晰條帶，證明此大米中含有CrylAb/Ac、NPTII, NOS、CaMV35S共4種外源基因；泳道3有3條清晰條帶，證明此菜籽粕中含有NPTII、N0S、 CaMV35S共3種外源基因；泳道4有2條清晰條帶，證明此大豆樣品中含有N0S、CaMV35S共 2種外源基因。綜合以上結果，本研究所建立的六重PCR體系能有效的檢測出棉花籽、PTF102質 粒、大米、菜籽柏、大豆中的轉基因成分，由此證明以上建立的六重PCR體系用來檢測棉花 中轉基因成分是可行的，檢測方法效率高、簡便、準確。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
一種快速鑒定棉花中轉基因成分的檢測方法，其特征在于包含以下步驟(1)設計多重PCR的6對引物，分別為sad1 F5’ CCACGAGACAGCCTATACCAAAAT 3’；sad1 R5’ CCCTAACCAAAGCCACGCA 3’；GUS F5’ CTGCGACGCTCACACCGATACC 3’；GUS R5’ TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG 3’；Cry1Ab/Ac F5’ GAAGGATTGAGCAATCTCTACCAA 3’；Cry1Ab/Ac R5’ TTCCAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3’；NPTII F5’ CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA 3’；NPTII R5’ CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG 3’；NOS F5’ TGAATCCTGTTGCCGGTCTT 3’；NOS R5’ AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC 3’；CaMV35S F5’ ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT 3’；CaMV35S R5’ CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT 3’；(2)檢測以棉花基因組DNA為模板，在PCR反應中加入步驟(1)設計的所有引物，進行PCR、電泳，從而得知所檢測的棉花是否為轉基因棉花。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的棉花基因組DNA通過以下步 驟提取得到將棉花籽進行脫絨，用水浸泡脫絨后的棉花籽5 9h，接著研碎，再提取棉花 籽基因組DNA。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述棉花基因組DNA通過以下步驟 提取得到將一粒棉花籽進行脫絨，用水浸泡脫絨后的棉花籽5 9h，接著研碎，于40 70°C放置30 50min，再提取棉花籽基因組DNA。
4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述的脫絨通過濃硫酸進行脫絨；所 述的濃硫酸指的是濃度至少為體積百分比98%的硫酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的檢測方法，其特征在于所述的提取通過基因組DNA提取試 劑盒進行提取。
6.根據(jù)權利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述提取為按照所述基因組DNA提取 試劑盒的說明書進行提取，其中的改進之處在于(1)裂解水浴時間延長；(2)離心時間延長。
7.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述PCR的反應體系為其中所用 的引物終濃度分別是引物sadl-F和引物sadl-R分別為0. 1 μ mol/L、引物⑶S-F和引物 GUS-R 分別為 0. 4μ mol/L、引物 CrylAb/Ac-F和引物 CrylAb/Ac-R 分別為 0. 1 μ mol/L、引物 NPTII-F 和引物 NPTII-R 分別為 0. 1 μ mo 1 /L、引物 NOS-F 和引物 NOS-R 分別為 0. 4 μ mo 1 /L、 引物 CaMV35S-F 和引物 CaMV35S_R 分別為 0. 4 μ mol/L。
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述PCR的反應條件為94°CImin ； 940C 30s, 60. 4°C 90s, 72°C 90s，35 個循環(huán)；72°C，lOmin。
9.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述電泳的條件為質量體積比2.5% 的瓊脂糖凝膠，80V電泳。
10.權利要求1 9任 項所述的檢測方法應用于大米、菜籽粕或大豆中的轉基因成分 的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速鑒定棉花中轉基因成分的檢測方法及其應用。本發(fā)明提供了sad1基因、GUS基因、Cry1Ab/Ac基因、NPTII基因、NOS基因和CaMV35S基因的引物，總共6對，將其應用于同一個PCR反應體系中，能從棉花籽中一次測出6種基因，步驟少，效率高，結果準確可靠。本發(fā)明為轉基因棉花的檢測提供了較為可靠和簡便的檢測方法，所建立的體系可重復性高，經(jīng)多次試驗穩(wěn)定性好。其檢測結果與其他檢測技術相比，具有更大的可靠性和適應性，簡化了檢測步驟，提高了檢測效率，從而為轉基因棉花的檢測提供更有為效的檢測手段。
文檔編號C12Q1/68GK101956011SQ20101029004
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月20日 優(yōu)先權日2010年9月20日
發(fā)明者吳希陽, 蘆春斌, 陳貞 申請人:暨南大學