專利名稱：體外培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的生產(chǎn)方法，尤其是一種生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)出率高的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(Anti-bacterial peptides，簡(jiǎn)稱ABP)是經(jīng)誘導(dǎo)，由動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的可對(duì)抗外源性病原體的防御性肽類活性物質(zhì)，分子量小、活性強(qiáng)，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲作用，甚至對(duì)癌細(xì)胞也具有殺傷作用，應(yīng)用十分廣泛。目前的制備方法是以新鮮豬小腸為原料，去脂、漿膜和內(nèi)容物，稱重后冷凍剪碎，搗碎成漿。勻漿后隔水煮沸15分鐘，按照1∶1的比例加入5％乙酸，并在4℃溫度條件下攪拌過夜，次日將混合物在4℃溫度條件下以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，取上清，保存在4℃溫度環(huán)境中。將沉淀物用等體積5％乙酸混合，再置于4℃攪拌浸提過夜，重復(fù)上述離心過程，取上清，合并兩次上清液，調(diào)整pH值，再次離心，棄沉淀，上清液冷凍干燥品即為抗菌肽。
轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor，TF)是具有免疫活性淋巴細(xì)胞釋放的一種低分子量多核苷酸肽，它能將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地傳遞給受體。目前的制備方法是將新鮮或冷凍的脾臟及淋巴結(jié)在25℃左右去脂肪及結(jié)締組織，然后用純化水洗凈；將洗凈的組織切成小塊，加入適量水，用組織搗碎機(jī)破碎細(xì)胞，制成勻漿，加適量純化水，混勻，置-20℃反復(fù)凍融5～8次，融化溫度不得超過37℃；將凍融的勻漿離心(離心溫度4℃)，去沉淀，留上清液備用；上清液裝透析袋，透析24-48小時(shí)；半成品過濾除菌；成品的配置與檢驗(yàn)。
現(xiàn)有制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法存在著如下缺點(diǎn)1.生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)出率低，所提取的抗菌肽需要進(jìn)一步純化才能獲得純度較高的產(chǎn)品，產(chǎn)品成本高；2.必需以新鮮豬小腸、脾臟及淋巴結(jié)為原料，若要獲得大量的抗菌肽、轉(zhuǎn)移因子，只能宰殺大量的生豬；3.產(chǎn)品中有潛在攜帶外源病毒及其他病原微生物的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的產(chǎn)品生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)出率低、成本高以及生產(chǎn)原料來(lái)源較少、產(chǎn)品中有潛在攜帶外源病毒及其他病原微生物的危險(xiǎn)等技術(shù)問題，提供一種生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)出率高、成本低，原料用量少、可避免產(chǎn)品攜帶外源病毒及其他病原微生物的體外培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法，并可多次傳代培養(yǎng)生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種體外培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法，其特征在于包括如下步驟a.用脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層；b.對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；c.當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)。
本發(fā)明以較少的脾臟或外周血為原料，制成淋巴細(xì)胞單層，在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞單層即可生產(chǎn)出大量抗菌肽與轉(zhuǎn)移因子的混合體。具有如下優(yōu)點(diǎn)1.無(wú)需進(jìn)一步提純，可經(jīng)超聲波及凍融簡(jiǎn)單處理后直接將混合體用在動(dòng)物身上，即可起到抗菌、抗病毒的作用，同時(shí)還可提高受體的免疫功能；2.生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，原料用量少，無(wú)需宰殺大量的生豬，即可生產(chǎn)出大量的產(chǎn)品(抗菌肽與轉(zhuǎn)移因子)，產(chǎn)出率高且成本低，可節(jié)省大量的人力、物力；3.可避免產(chǎn)品攜帶外源病毒及其他病原微生物。
4.能多次傳代培養(yǎng)生產(chǎn)抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.以新鮮豬脾臟為原料，按常規(guī)方法制備淋巴細(xì)胞單層。
具體操作方法可以按以下步驟進(jìn)行a.處理新鮮豬脾臟取新鮮豬脾臟，立即放入無(wú)菌燒杯中，加入平衡鹽液浸泡半小時(shí)或浸于1％新潔爾滅溶液中，取出以碘酒酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用平衡鹽液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成1mm3小塊，再用平衡鹽液洗滌2～3次，以去除血細(xì)胞、色素物質(zhì)及剪碎過程中機(jī)械損傷的細(xì)胞；b.消化及分散組織塊將上步清洗過的平衡鹽液吸掉、將剪碎的組織塊移入三角燒角燒瓶中，按組織塊體積的5倍量加入0.25％胰蛋白酶液(PH7.6～7.8)，置37℃水浴中消化20～40分鐘左右。每隔10分鐘搖動(dòng)一次三角燒瓶，以便組織塊散開，以利繼續(xù)消化，直到組織變成松散、表面發(fā)毛時(shí)為止，這時(shí)從水浴中取出三角燒瓶吸去胰蛋白酶液，再用平衡鹽液洗滌2～3次，用0.5％水解乳蛋白—Hanks液洗一次。加入少許0.5％水解乳蛋—Hanks液，用口徑稍大的細(xì)管吹打數(shù)次，用四層紗布濾過、計(jì)數(shù)。
c.細(xì)胞計(jì)數(shù)采用標(biāo)有0.1mm字樣的血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法與白細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。
d.細(xì)胞懸液的分裝和培養(yǎng)按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞懸液用營(yíng)養(yǎng)液調(diào)整至50萬(wàn)/毫升細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液分裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶(100ml)和細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，分裝量為該瓶容量的1/10，蓋上蓋，做好標(biāo)識(shí)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶和轉(zhuǎn)瓶分別放在二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)。
e.觀察置于37℃培養(yǎng)的細(xì)胞，需逐日進(jìn)行觀察，主要觀察(1)培養(yǎng)物是否污染，如培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且混濁，表示該瓶已污染。
(2)細(xì)胞形態(tài)特征及生長(zhǎng)階段的觀察待細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，即可進(jìn)行觀察。若細(xì)胞已生長(zhǎng)，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長(zhǎng)階段(游離期、吸附期、繁殖期、維持期和衰退期)，直至形成淋巴細(xì)胞單層。
2.對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；在作傳代細(xì)胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細(xì)胞已長(zhǎng)成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
3.當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)。
當(dāng)脾淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，更換維持液同時(shí)加入刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)將細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)超聲破碎后取樣檢測(cè)轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的濃度。
轉(zhuǎn)移因子濃度的測(cè)定對(duì)轉(zhuǎn)移因子的定量多以多肽含量定量用Folin—酚法或分光光度法測(cè)定多肽含量，以多肽含量1mg為一個(gè)轉(zhuǎn)移因子單位。此工藝生產(chǎn)的轉(zhuǎn)移因子含量是常規(guī)生產(chǎn)方法的4～5倍。
抗菌肽濃度測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，所生產(chǎn)的抗菌肽的濃度是常規(guī)提取量的10倍。
抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)大量的抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，所生產(chǎn)的抗菌肽微克分子濃度能殺死85％以上的革蘭氏陽(yáng)性、陰性細(xì)菌和真菌。它的抗菌譜廣，能抑制大腸桿菌、葡萄球菌、產(chǎn)氣單胞菌、鏈球菌、巴氏桿菌、放線菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、分枝桿菌等十余種近500株分離株，且實(shí)驗(yàn)中抑菌圈直徑在15mm以上的細(xì)菌在85％以上。
半成品和成品的檢驗(yàn)半成品檢定半成品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素、無(wú)菌檢查、pH值等項(xiàng)檢測(cè)。
成品檢定成品分別作轉(zhuǎn)移因子和抗菌肽的鑒別試驗(yàn)、外觀檢測(cè)、pH值、多肽含量、特異活性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)反應(yīng)、無(wú)菌檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性等項(xiàng)檢驗(yàn)。
實(shí)施例21.以動(dòng)物外周血為原料，按常規(guī)方法制備淋巴細(xì)胞單層。
具體方法是無(wú)菌靜脈采取動(dòng)物全血20毫升，加1％肝素溶液0.2ml抗凝，靜置60分鐘左右，用帶膠球吸管吸取紅細(xì)胞層以上的所有血漿，特別是緊接紅細(xì)胞層上的白細(xì)胞層要盡量吸取，分裝于消毒離心管內(nèi)，用平衡鹽液反復(fù)洗滌2～3次，離心速度800～1200轉(zhuǎn)/分，然后用含30％犢牛血清水解乳蛋白40毫升進(jìn)行白細(xì)胞培養(yǎng)，均勻混合后分裝于容量100毫升培養(yǎng)方瓶或磚瓶中，塞緊瓶塞，置37℃恒溫箱中或磚瓶機(jī)中培養(yǎng)，經(jīng)2～3天，白細(xì)胞均勻貼壁，即制成淋巴細(xì)胞單層。
2.對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；在作傳代細(xì)胞培養(yǎng)前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，以確定細(xì)胞已長(zhǎng)成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。
3.當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)。
當(dāng)脾淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，更換維持液同時(shí)加入刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)移因子濃度的測(cè)定、抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)及結(jié)果、半成品和成品的檢驗(yàn)項(xiàng)目均同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種體外培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法，其特征在于包括如下步驟a.用脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層；b.對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；c.當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種體外培養(yǎng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞制備抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子的方法，包括如下步驟用脾臟或外周血制備淋巴細(xì)胞單層；對(duì)淋巴細(xì)胞單層進(jìn)行傳代培養(yǎng)；當(dāng)淋巴傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用刀豆蛋白A誘導(dǎo)培養(yǎng)即可生產(chǎn)出抗菌肽及轉(zhuǎn)移因子。無(wú)需提純，只需超聲波及凍融簡(jiǎn)單處理，可直接將產(chǎn)品(抗菌肽與轉(zhuǎn)移因子混合體)用在動(dòng)物身上，起到抗菌、抗病毒的作用，同時(shí)還可提高受體的免疫功能；生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，原料用量少，無(wú)需宰殺大量的生豬，通過傳代培養(yǎng)可生產(chǎn)出大量的產(chǎn)品(抗菌肽與轉(zhuǎn)移因子)，產(chǎn)出率高且成本低，可節(jié)省大量的人力、物力；可避免產(chǎn)品攜帶外源病毒及其他病原微生物。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1766093SQ20051004720
公開日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
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