專(zhuān)利名稱(chēng)：新轉(zhuǎn)移因子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尤其與轉(zhuǎn)移和/或遷移、葡萄糖代謝和氨基酸代謝有關(guān)的新因子，還涉及生產(chǎn)藥物和診斷劑的方法及其應(yīng)用。
現(xiàn)代藥物開(kāi)發(fā)不再依賴(lài)于或多或少試探的方法，而典型地包含闡明構(gòu)成疾病或癥狀基礎(chǔ)的分子機(jī)制，鑒定候選靶分子和評(píng)估所述靶分子。顯然候選靶分子的鑒定對(duì)于該方法是基本的。隨著人類(lèi)基因組的測(cè)序和各種序列數(shù)據(jù)的公布，原則上，可以得到人的所有編碼核酸。然而，對(duì)該數(shù)據(jù)的一個(gè)嚴(yán)重限制是通常沒(méi)有給出對(duì)所述序列的功能的注解。此外，僅了解編碼核酸序列不足以預(yù)測(cè)多肽的體內(nèi)功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員從研究沒(méi)有任何適當(dāng)被證實(shí)的注解的數(shù)據(jù)庫(kù)登記不能得到關(guān)于怎樣使用該核酸數(shù)據(jù)的任何技術(shù)教導(dǎo)。計(jì)算機(jī)(In silico)方法容許第一次可能的注解，然而，該注解容易出錯(cuò)并且不一定反映各自核苷酸序列所編碼的多肽的真實(shí)功能。將所述多肽放在適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)和原位背景中并且闡明其在那里的功能，仍然是一種要求高的任務(wù)，其得到了令人驚奇的發(fā)現(xiàn)。
一旦可以得到被證實(shí)的靶分子(其在此后也稱(chēng)為靶標(biāo)或靶分子)，就可以篩選或開(kāi)發(fā)和隨后檢驗(yàn)針對(duì)該靶分子的候選藥物。在許多情況中，這些候選藥物是化合物文庫(kù)的成員，該化合物文庫(kù)可以由合成的或天然化合物組成。此外使用組合文庫(kù)也是常見(jiàn)的。這些化合物文庫(kù)在此處也被稱(chēng)為候選化合物文庫(kù)。盡管在過(guò)去該方法已被證明是成功的，但是其仍然是費(fèi)時(shí)和費(fèi)錢(qián)的。
仍然有許多腫瘤和癌是人類(lèi)健康的大威脅。為了產(chǎn)生更安全和更有效的具有更小副作用的藥物，必須了解經(jīng)適當(dāng)化合物處理后可特異性地或選擇性地影響它們的活性或存在的靶分子。因?yàn)榭梢允菨撛诨蚝蜻x藥物的化合物與靶之間的優(yōu)選地選擇性和特異性相互作用，靶在疾病或疾病癥狀如例如癌、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的功能可能被影響，因此疾病被治療或預(yù)防和疾病癥狀被改善。除了基于新鑒定的和已證實(shí)的靶標(biāo)分子的治療方法，診斷方法也是重要的。這種診斷方法適于在治療之前或之中或治療后監(jiān)視所要治療的病癥或疾病，以允許決策者如醫(yī)生決定是否繼續(xù)治療或者根據(jù)個(gè)別患者的要求作出調(diào)整。
因此構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題是提供分別對(duì)癌和腫瘤特異的靶標(biāo)。構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的另一問(wèn)題是提供更具體地涉及腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的靶。最后，本發(fā)明的一個(gè)問(wèn)題是提供與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)的診斷標(biāo)記。
在第一方面，通過(guò)編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，該過(guò)程是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失(deprivation)過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、缺氧、凋亡(apoptosis)、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，該因子是含有根據(jù)SEQ ID.NO.1的氨基酸序列的多肽或者具有根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 9506687或NP_061931，優(yōu)選NP_061931.1的序列的多肽。
在第二方面，通過(guò)編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，該過(guò)程是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、缺氧、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該核酸含有根據(jù)SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的核酸序列或者根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 9506686或NM_019058，優(yōu)選NM_019058.1的核酸序列。
在第三方面，通過(guò)編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，該過(guò)程是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、缺氧、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中如果不是遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，該核酸將與本發(fā)明的核酸雜交，更具體地與根據(jù)本發(fā)明的第二方面的核酸雜交。
第四方面，通過(guò)編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，其中該過(guò)程是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、缺氧、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該核酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本發(fā)明的核酸雜交，更具體地與根據(jù)本發(fā)明的第二方面的核酸雜交。
在涉及核酸的本發(fā)明的任何方面，該核酸可以以DNA或RNA存在。還在本發(fā)明內(nèi)的是該核酸可以作為單鏈的、部分雙鏈的或雙鏈核酸存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸以單鏈RNA存在。這種單鏈RNA被優(yōu)選用作表達(dá)系統(tǒng)中的mRNA，其中表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)選為如此處描述的表達(dá)系統(tǒng)。在根據(jù)本發(fā)明的核酸的一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸是單鏈的并且如果不是遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，將和與編碼根據(jù)本發(fā)明的因子的核酸基本互補(bǔ)的核酸雜交。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的單鏈核酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下和與根據(jù)本發(fā)明的第二方面的核酸基本互補(bǔ)的核酸雜交。
在第五方面，通過(guò)含有根據(jù)本發(fā)明的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。用于這種目的的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
在第六方面，通過(guò)含有根據(jù)本發(fā)明的載體的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在第七方面，通過(guò)與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，其中該過(guò)程是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、缺氧、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該因子是含有根據(jù)SEQ ID.NO.1的氨基酸序列的多肽或者具有根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 9506687或NP_061931，優(yōu)選NP_061931.1的序列的多肽。
在第八方面，通過(guò)與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，其中該過(guò)程是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、缺氧、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該因子被根據(jù)本發(fā)明的核酸編碼。
在根據(jù)本發(fā)明的因子的一個(gè)實(shí)施方案中，該因子是所述過(guò)程的一種標(biāo)記物。
在根據(jù)本發(fā)明的因子的另一個(gè)實(shí)施方案中，該因子是轉(zhuǎn)化細(xì)胞，優(yōu)選侵入性細(xì)胞的一種標(biāo)記物。
在第九方面，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的因子或其片段或衍生物作為PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的下游靶標(biāo)或者下游標(biāo)記物，優(yōu)選作為PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的下游藥靶解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在第十方面，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的因子或其片段或衍生物生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于疾病診斷的診斷劑，其中該疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在第十一方面，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其片段或衍生物治療和/或預(yù)防疾病和/或生產(chǎn)用于疾病診斷的診斷劑，其中該疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在根據(jù)本發(fā)明的各方面的應(yīng)用的實(shí)施方案中，疾病的特征是與所述疾病有關(guān)的細(xì)胞缺乏PTEN活性，和/或表現(xiàn)出增加的侵入性行為，和/或表現(xiàn)出PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的超活化，和/或是腫瘤細(xì)胞，優(yōu)選晚期腫瘤細(xì)胞。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。
在根據(jù)本發(fā)明的各方面的應(yīng)用的尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，疾病是晚期腫瘤。
在根據(jù)本發(fā)明的各方面的應(yīng)用的另一尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，疾病是與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的分支有關(guān)的疾病，該分支與葡萄糖代謝有關(guān)，優(yōu)選該疾病是糖尿病。
在根據(jù)本發(fā)明的各方面的應(yīng)用的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，疾病是與PI3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的分支有關(guān)的疾病，該分支與腫瘤生長(zhǎng)和/或轉(zhuǎn)移有關(guān)。
在第十二方面，通過(guò)篩選用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑的方法，其中該疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題，該方法包括e)提供候選化合物，f)提供根據(jù)本發(fā)明的因子的表達(dá)系統(tǒng)和/或一種系統(tǒng)，優(yōu)選檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的因子的活性的活性系統(tǒng)；g)將候選化合物與根據(jù)本發(fā)明的因子的表達(dá)系統(tǒng)和/或該系統(tǒng)，優(yōu)選檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的因子的活性的活性系統(tǒng)接觸；h)確定在候選化合物的影響下根據(jù)本發(fā)明的因子的表達(dá)和/或活性是否變化。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，候選化合物包含在化合物文庫(kù)中。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，候選化合物選自包含肽，蛋白質(zhì)，抗體，抗促成素(anticaline)，功能核酸，天然化合物和小分子的各類(lèi)化合物的組。
在根據(jù)本發(fā)明的方法的尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能核酸選自包含適體(aptamer)，適配酶(aptazyme)，核酶，spiegelmer，反義寡核苷酸和siRNA的組。
在第十三方面，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的因子或者該因子的部分或衍生物和/或根據(jù)本發(fā)明的核酸或者該核酸的部分或衍生物作為靶標(biāo)分子以開(kāi)發(fā)和/或設(shè)計(jì)和/或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑，其中該疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在根據(jù)本發(fā)明的第十三方面的應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物和/或診斷劑含有一種試劑，其選自包含抗體、肽、抗促成素、小分子、反義分子、適體、spiegelmer和RNAi分子的組。
在根據(jù)本發(fā)明的第十三方面的應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用。
在根據(jù)本發(fā)明的第十三方面的應(yīng)用的一個(gè)備選實(shí)施方案中，試劑與根據(jù)本發(fā)明的核酸或者其部分或衍生物，尤其與根據(jù)本發(fā)明的因子的mRNA、基因組核酸或cDNA相互作用。
在第十四方面，通過(guò)使用與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用的多肽，開(kāi)發(fā)或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)診斷疾病的診斷劑，其中該疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在根據(jù)本發(fā)明的第十四方面的應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽選自包含針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的抗體、和結(jié)合根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或者其部分或衍生物的多肽的組。
在第十五方面，通過(guò)與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用的核酸，開(kāi)發(fā)或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)診斷疾病的診斷劑，其中該疾病選自癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在根據(jù)本發(fā)明的第十五方面的應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，核酸選自包含適體和spiegelmer的組。
在第十六方面，通過(guò)使用與編碼根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸，開(kāi)發(fā)或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)診斷疾病的診斷劑，其中該疾病選自癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在根據(jù)本發(fā)明的第十六方面的應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，相互作用的核酸是反義寡核苷酸、核酶和/或siRNA。
在根據(jù)本發(fā)明的第十六方面的應(yīng)用的另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸是cDNA、mRNA或hnRNA。
在第十七方面，通過(guò)含有選自包含根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物、與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物或者與編碼根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子、對(duì)根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物特異的抗體、與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用的多肽、根據(jù)本發(fā)明的核酸、編碼根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的核酸、與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用的核酸和與編碼根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組的至少一種試劑和至少一種藥用載體，優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物組合物，其中該疾病優(yōu)選選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在第十八方面中，通過(guò)表征選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、任何缺氧相關(guān)的疾病和與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組的疾病或病癥的試劑盒，該試劑盒含有選自包含根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物、對(duì)根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物特異的抗體、與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用的多肽、與根據(jù)本發(fā)明的核酸和/或與編碼根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽、與根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物相互作用的核酸、與根據(jù)本發(fā)明的核酸或者與編碼根據(jù)本發(fā)明的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組的至少一種試劑和任選至少一種其他化合物，解決了構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的問(wèn)題。
在本發(fā)明的任何方面，腫瘤優(yōu)選為晚期腫瘤。
本發(fā)明人還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)與許多生物學(xué)過(guò)程如癌細(xì)胞的代謝偏移(shift)(Warburg效應(yīng))、葡萄糖代謝、氨基酸代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、傷口愈合、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、缺氧、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的一種新的多肽因子。這些過(guò)程處于PI 3-激酶途徑的控制下。該新因子在此處被稱(chēng)為PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)因子1或PRF1。
PRF1的基因組序列位于10號(hào)染色體上，更具體地該基因座是10pter-q26.12。該基因含有如當(dāng)前定義的共1,760個(gè)核苷酸。代表該cDNA的各自數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)被稱(chēng)為NM_019058，更優(yōu)選地NM_019058.1，和gi 9506686。編碼PRF1的cDNA在此處被稱(chēng)為SEQ ID NO.2并且其編碼序列被稱(chēng)為SEQ ID NO.3。在本發(fā)明內(nèi)的是編碼PRF1的核酸可以具有一些變異，如在321位C被G代替，在991位A被T代替，在1247位C被T代替，在1297互補(bǔ)位C被T代替，在1958位C被T代替，在1666互補(bǔ)位A被G代替，在1743位A被C代替。所有上面提到的位置指cDNA，該cDNA在此處也被稱(chēng)為SEQ ID NO.2?？勺x框在198位開(kāi)始，在896位結(jié)束。
PRF1的氨基酸序列在此處也被稱(chēng)為SEQ ID NO.1。代表該氨基酸序列的各自數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)是NP_061931、更具體地NP_061931.1，和gi9506687。
根據(jù)本發(fā)明的多肽也可以含有變異如例如，在氨基酸39位R被G代替。
根據(jù)本發(fā)明的多肽最近在文獻(xiàn)中被稱(chēng)為REDD1，并且如此被Ellisen，L.W.，Molecular Cell，卷10，995-1005，11月，2002描述。
還應(yīng)該理解在任何所述序列中可以有一些測(cè)序錯(cuò)誤，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該承認(rèn)基本序列是上面指定的序列，其可以被進(jìn)一步改進(jìn)，并且可以從上面的記錄號(hào)分別得到修改序列，該修改序列也應(yīng)該包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的范圍還包括實(shí)施方案，其中包含或?qū)崿F(xiàn)了一個(gè)或多個(gè)上面的變異。
在本發(fā)明內(nèi)的是，根據(jù)本發(fā)明也可使用PRF1的衍生物或截?cái)嘈问交蛘呔幋a該衍生物或截?cái)嘈问降暮怂?，只要可以?shí)現(xiàn)所希望的效果。所希望的效果尤其可以是仍然可以篩選或設(shè)計(jì)特定化合物，如功能核酸、抗體、多肽和小分子的效果。在這個(gè)范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)PRF1也包括這種衍生物或截?cái)嗟男问?。其中，PRF1的優(yōu)選衍生物是磷酸化形式或者其糖基化形式。從而，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)分析可以確定衍生化和截?cái)嗟某潭取．?dāng)提到核酸序列時(shí)，那些核酸序列也被術(shù)語(yǔ)編碼PRF1的核酸序列所包括，該編碼PRF1的核酸序列與由上述記錄號(hào)指定的核酸或者可以從上述核酸序列衍生的任何核酸序列雜交。這種雜交及其實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這種雜交的細(xì)節(jié)可以，例如，也可以來(lái)自Ausubel等人，(1996)CurrentProtocols in Molecular Biology.J.Wiley and Sons，紐約。如此處所用的嚴(yán)謹(jǐn)雜交指，例如，0.1xSSC；0.1％SDS，65℃，15分鐘。此外，術(shù)語(yǔ)編碼PRF1的核酸還包括與上述提到的核酸序列之一同源的核酸序列，其中同源性程度優(yōu)選75、80、85、90或95％，包括70％到99％之間的任何百分?jǐn)?shù)。
在文獻(xiàn)中描述的編碼PRF1的基因，但是沒(méi)有對(duì)其功能的注釋。據(jù)聲稱(chēng)該基因是缺氧-可誘導(dǎo)的并且應(yīng)答缺氧可誘導(dǎo)的因子1(Shoshani T.，等人，Molecular and cellular biology，2002年4月，2283-2293頁(yè))。
在所述論文中據(jù)說(shuō)PRF1被缺氧調(diào)節(jié)。然而，其中沒(méi)有公開(kāi)PRF1是涉及并參與缺氧應(yīng)答的一種存活因子。本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)PRF1以PI 3-激酶和/或HIF1α依賴(lài)的方式被調(diào)節(jié)。PRF1的敲除適于抑制如此處實(shí)施例中描述的matrigel測(cè)定法中細(xì)胞的生長(zhǎng)。與之相聯(lián)系，值得注意的是PRF1的敲除也可以在蛋白質(zhì)水平上表現(xiàn)并且功能的喪失表現(xiàn)出類(lèi)似于LY294002的效果的抑制表型，證實(shí)了本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)PRF1是特定靶標(biāo)，更具體地癌靶標(biāo)，其在HIF1α和Akt的下游。這更加相關(guān)，因?yàn)榭傻玫皆S多數(shù)據(jù)證明HIF在腫瘤治療中高度相關(guān)。而且，PRF1的敲除導(dǎo)致腫瘤的抑制，如使用PC-3細(xì)胞作為腫瘤模型所闡明的。從這一點(diǎn)可以得到PRF1和更具體地抑制PRF1的化合物的各種應(yīng)用。因此，PRF1如此可以在細(xì)胞系統(tǒng)中被過(guò)表達(dá)以容許細(xì)胞在缺氧條件下幸存。這些條件在例如，中風(fēng)、心力衰竭中實(shí)現(xiàn)，從而PRF1的過(guò)表達(dá)或激活可能是這類(lèi)疾病的治療或預(yù)防的適宜方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將公認(rèn)與PRF1的增加的表達(dá)或活性有關(guān)的任何化合物或機(jī)理從而也可以是這類(lèi)疾病的治療和/或預(yù)防的適宜方法。
此外，在本發(fā)明內(nèi)的是PRF1的表達(dá)或者如此處以同義方式使用的，活性的降低適于將各自細(xì)胞系統(tǒng)置于相應(yīng)于低氧條件的條件中。在這些條件下可以開(kāi)始其他細(xì)胞過(guò)程如，例如，凋亡。通過(guò)抑制PRF1可以實(shí)現(xiàn)低氧條件，其反過(guò)來(lái)適于治療其中不希望細(xì)胞被提供足夠氧的那些疾病。通過(guò)將細(xì)胞置于其中所述細(xì)胞經(jīng)歷或暴露于或者將經(jīng)歷缺氧的條件中可以治療一些公知的疾病。這種疾病之一是如此處描述的腫瘤和癌癥。目前，適于在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平降低PRF1表達(dá)和/或活性的任何化合物，尤其此處描述的那些化合物可以適于這類(lèi)疾病的預(yù)防和/或治療。這些疾病在此處也稱(chēng)為缺氧相關(guān)的疾病。這些化合物或方法可以有效治療尤其是腫瘤，其基于腫瘤血管發(fā)生的抑制。
本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)PRF1是與癌和腫瘤和其他生物學(xué)過(guò)程如轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中的細(xì)胞生長(zhǎng)和基于上面的或者與這些過(guò)程之一有關(guān)的任何疾病或病癥有關(guān)的一種有價(jià)值的靶標(biāo)。更具體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRF1是PI-3激酶/PTEN途徑和/或HIF1α途徑的下游靶標(biāo)。甚至更令人驚奇地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PRF1與本文

圖1中描述的PI 3-激酶途徑的幾個(gè)分支有關(guān)。此外，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)PRF1通過(guò)HIF1α途徑被高度調(diào)節(jié)，HIF1α途徑與也在圖7中描述的Akt途徑平行。關(guān)于PRF1，涉及葡萄糖運(yùn)輸、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移和遷移的分支最相關(guān)。這些過(guò)程中PRF1的重要性在抑制劑功能，更具體地PTEN腫瘤抑制劑功能的喪失中表現(xiàn)出來(lái)。如將在實(shí)施例中表明的，在PTEN——PI-3激酶途徑的一種抑制劑——無(wú)活性的條件下，PRF1將被上調(diào)。
PRF1是一種有價(jià)值的診斷標(biāo)記，其表達(dá)在PTEN負(fù)(minus)細(xì)胞中增加，PTEN負(fù)細(xì)胞是許多晚期腫瘤和病癥所特有的(Cantley，L.C.和Neel，B.G.(1999).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，4240-4245；Ali，I.U.(2000).I.Natl.Cancer Inst.92，861-863)。此外，PTEN的喪失與各種腫瘤細(xì)胞的增加的侵入性和侵入行為相關(guān)。因此，PRF1是與其有關(guān)的一種有價(jià)值的診斷劑。另一方面，這些結(jié)果還表明PRF1是PI 3-激酶/PTEN途徑和/或HIF1α途徑的有價(jià)值的下游藥物靶標(biāo)，因此通過(guò)如也將在本文中公開(kāi)的不同治療方法和各種試劑可以處理這些途徑。這意味著PRF1的抑制劑是控制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性和遷移行為的適宜方法并且這是治療腫瘤和癌癥，更具體地轉(zhuǎn)移性并且其細(xì)胞表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移和/或遷移行為的腫瘤和癌癥的適宜方法，這些腫瘤和癌癥通常在此處被稱(chēng)為“如此處描述的疾病”或“如此處描述的病癥”。如此處描述的疾病以及如此處描述的病癥也包括腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但是不限于這些。其他疾病和病癥分別通常是涉及與PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑，更具體地圖1和圖12中描述的那些不同過(guò)程有關(guān)的任何疾病或病理學(xué)癥狀。涉及PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的這些疾病之一特別是糖尿病。這尤其適用于如此處描述的那些疾病和如此處描述的那些病癥，其中與這些疾病或病癥有關(guān)的細(xì)胞是PTEN陰性的，這意味著腫瘤抑制劑PTEN無(wú)活性或者具有降低的活性水平，或者其中涉及PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的疾病或病癥。此外轉(zhuǎn)移性腫瘤，糖尿病分別屬于這種類(lèi)型的疾病和病癥。因此，細(xì)胞，尤其是與此處描述的疾病或病癥有關(guān)并且是PTEN陰性的那些細(xì)胞易于被作用模式為例如降低或消除有關(guān)各自細(xì)胞中PRF1活性的藥物治療。因此，可以使用所述藥物有利地治療其腫瘤為PTEN陰性或者有PTEN陰性細(xì)胞，尤其如果這些細(xì)胞與如此處描述的疾病或者如此處描述的病癥有關(guān)的患者。對(duì)于各種診斷劑或藥物同樣適用。
用所述藥物可以有利地治療的另一組患者是患有具有PTEN功能喪失發(fā)生率高的癌癥，特別是晚期腫瘤的那些患者(Cantley，L.C.和Neel，B.G.(1999).腫瘤抑制的新的理解PTEN通過(guò)抑制磷酸肌醇3-激酶/AKT途徑和/或HIF1α途徑抑制腫瘤形成.Proc Natl Acad Sci USA 96，4240-4245；Ali，I.U.(2000).子宮內(nèi)膜的看門(mén)人PTEN腫瘤抑制基因.J Natl Cancer Inst 92，861-863)。PTEN的喪失與各種腫瘤細(xì)胞的增強(qiáng)的侵略性和侵入性行為相關(guān)。因?yàn)樵撛?，在?yōu)選實(shí)施方案中，如果上述前提條件——即PTEN與增加的侵略性和侵入性行為相關(guān)——被滿足，那么針對(duì)PRF1的那些診斷劑和治療劑可用于任何腫瘤。
根據(jù)此處所給的公開(kāi)，即PRF1是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的下游靶標(biāo)，而且涉及增殖控制、轉(zhuǎn)移和遷移，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開(kāi)發(fā)分別針對(duì)此處描述的疾病和此處描述的病癥的治療劑和診斷劑。關(guān)于一旦靶標(biāo)被證實(shí)可以怎樣篩選藥物的代表性描述由例如Prendergast，NatureBiotechnology，2001年10月，卷19，919-921頁(yè)或Torrance C.J.等人，Nature Biotechnology，2001年11月，卷19，940-945頁(yè)描述。
由于PRF1與上面概述的機(jī)理有關(guān)，其或者編碼其的核酸也可用作標(biāo)記物以診斷細(xì)胞或者在其體內(nèi)有這種細(xì)胞的患者，是否將經(jīng)歷轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生或者此處描述的任何其他過(guò)程或者其是否遭受氧、葡萄糖和/或葡萄糖耗盡，這又預(yù)示腫瘤細(xì)胞，尤其快速生長(zhǎng)的癌細(xì)胞。這種方法可行并且可應(yīng)用于該目的的一個(gè)實(shí)例是例如，ICAM-1。ICAM-1用于經(jīng)歷轉(zhuǎn)移的胃癌的預(yù)后(Maruo Y，Gochi A，Kaihara A，Shimamura H，Yamada T，TanakaN，OritaK.Int J Cancer.2002年8月1日；100(4)486-490)，其中發(fā)現(xiàn)在肝臟轉(zhuǎn)移患者中s-ICAM-1升高了。在另一實(shí)例中，骨橋蛋白被用作乳腺癌的預(yù)后標(biāo)記物(Rudland PS，Platt-Higgins A，E1-Tanani M，De Silva RudlandS，Barraclough R，Winstanley JH，Howitt R，West CR.Cancer Res.2002年6月15日；62(12)3417-3427)。在這個(gè)范圍內(nèi)，PRF1的存在或者存在水平(蛋白質(zhì)或mRNA)或者活性水平可用作標(biāo)記物并且或多或少與PRF1特異相互作用的任何化合物將因此是適宜的診斷劑和/或適宜的分析工具或方法。
下面將公開(kāi)在任何情況下與PRF1特異和/或選擇性相互作用的藥物和診斷劑的方法和設(shè)計(jì)原理。
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)證明PRF1是適宜的下游藥物靶標(biāo)，其容許僅一些方面的選擇性調(diào)節(jié)，這些方面通常涉及PI-3激酶途徑，如轉(zhuǎn)移和遷移以及缺氧應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)、傷口愈合、翻譯控制和葡萄糖運(yùn)輸和選擇性和特異性診斷方法，即和通常與PI 3-激酶途徑相關(guān)的過(guò)程，更具體地轉(zhuǎn)移和遷移以及生長(zhǎng)翻譯和葡萄糖運(yùn)輸?shù)臋z測(cè)。
PI 3-激酶途徑其特征在于經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)后的PI 3-激酶活性和平行的信號(hào)途徑。細(xì)胞的生長(zhǎng)因子刺激導(dǎo)致細(xì)胞膜上它們相關(guān)受體的激活，其又與胞內(nèi)信號(hào)分子如PI 3-激酶相關(guān)并將PI 3-激酶激活。PI 3-激酶(由調(diào)節(jié)p85和催化p110亞基組成)的激活通過(guò)磷酸化導(dǎo)致Akt的激活和/或HIF1α的激活，由此支持細(xì)胞應(yīng)答如增殖，存活或向下游遷移。PTEN因此是涉及磷脂酰肌醇(PI)3-激酶途徑的腫瘤抑制劑，過(guò)去已經(jīng)廣泛研究其在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化中的作用(關(guān)于綜述參見(jiàn)Stein，R.C.和Waterfield，M.D.(2000).PI3-kinase inhibitiona target for drug development？Mol MedToday 6，347-357；Vazquez，F(xiàn).和Sellers，W.R.(2000).The PTEN tumorsuppressor proteinan antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling.Biochim Biophys Acta 1470，M21-35；Roymans，D.和Slegers，H.(2001).Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression.Eur J Biochem 268，487-498)。腫瘤抑制劑PTEN通過(guò)逆轉(zhuǎn)PI 3-激酶-催化反應(yīng)起PI 3-激酶負(fù)調(diào)節(jié)物的作用和由此確保途徑的激活以瞬時(shí)和可控方式發(fā)生。PTEN的功能失活導(dǎo)致PI 3-激酶和/或HIF1α途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的慢性超活化。通過(guò)加入小分子抑制劑LY294002可以阻斷PI 3-激酶活性和/或HIF1α活性。以平行途徑作用的信號(hào)激酶MEK的活性和下游響應(yīng)可以例如被小分子抑制劑PD98059抑制。
PI 3-激酶途徑和/或HIF1α活性通過(guò)PTEN功能喪失的慢性激活是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要貢獻(xiàn)者，顯示該腫瘤抑制劑代表控制細(xì)胞增殖的重要關(guān)卡。PTEN剔除(knock out)細(xì)胞顯示與其中PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑已經(jīng)通過(guò)PI 3-激酶的激活形式被慢性誘導(dǎo)的細(xì)胞類(lèi)似的特性(DiCristofano，A.，Pesce，B.，Cordon-Cardo，C.和Pandolfi，P.P.(1998).PTEN isessential for embryonic development and tumour suppression.Nat Genet 19，348-355.Klippel，A.，Escobedo，M.A.，Wachowicz，M.S.，Apell，G.，Brown，T.W.，Giedlin，M.A.，Kavanaugh，W.M.和Williams，L.T.(1998).Activation ofphosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotescellular changes characteristic of oncogenic transformation.Mol Cell Biol 18，5699-5711.Kobayashi，M.，Nagata，S.，Iwasaki，T.，Yanagihara，K.，Saitoh，I.，Karouji，Y.，Ihara，S.和Fukui，Y.(1999).Dedifferentiation ofadenocarcinomas by activation of phosphatidylinositol 3-kinase.Proc NatlAcad Sci USA 96，4874-4879)。
通過(guò)PI 3-激酶途徑和/或活化，優(yōu)選HIF1α途徑的超活化也可以表征如此處描述的各種疾病。該活化或超活化類(lèi)似于缺少PTEN活性的細(xì)胞的情形。如此處所用的PI 3-激酶途徑的超活化和/或HIF1α途徑的活化具體指與正常觀察到的所述途徑的活性——即特定種類(lèi)的細(xì)胞的PI 3-激酶途徑，其中該細(xì)胞不是該疾病或病癥的部分或者與其相關(guān)——相比PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的增加的活性。
PTEN涉及也稱(chēng)為PTEN相關(guān)途徑的幾個(gè)途徑如PI3K/PTEN途徑，Akt途徑，EGF-相關(guān)自分泌回路(loop)和mTOR途徑和，如被本發(fā)明人記載的，HIF1α途徑。PI 3-激酶途徑實(shí)際上是直接或間接涉及PI 3-激酶的任何途徑。PI 3-激酶在該途徑中可以用作抑制劑或激活劑，或者它可以被途徑的其它元件調(diào)節(jié)。
存在豐富的現(xiàn)有技術(shù)描述涉及PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的疾病和癥狀。這些癥狀和疾病中的任何一種可以因此通過(guò)本文教導(dǎo)設(shè)計(jì)、篩選或制備的本發(fā)明方法和藥物和診斷劑處理。為了不限制性地舉例說(shuō)明的原因，它是指下列各項(xiàng)子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，子宮內(nèi)膜癌，腺癌，子宮內(nèi)膜增生，考登綜合征，遺傳性非息肉病結(jié)腸直腸癌，Li-Fraumene’s綜合征，乳腺-卵巢癌，前列腺癌(Ali，I.U.，Journal of theNational Cancer Institute，Vol.92，no.11，June 07，2000，第861-863頁(yè))，班-佐綜合征，LDD(Lhermitte-Duklos’綜合征)(Macleod，K.，上文)錯(cuò)構(gòu)瘤-巨頭病，包括Cow病(CD)和Bannayan-Ruvalcaba-Rily綜合征(BRR)，粘膜皮膚損傷(例如毛膜瘤(trichilemmonmas))，巨頭，智力低下，胃腸harmatomas，脂瘤，甲狀腺腺瘤，乳腺纖維囊性病，小腦發(fā)育不良性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤和乳腺和甲狀腺惡性腫瘤(Vazquez，F(xiàn).，Sellers，W.R.，上文)。
鑒于此，PRF1是PI 3-激酶途徑和/或HIF1α途徑的有價(jià)值的下游藥物靶標(biāo)，其可以被藥物靶定，該藥物將比針對(duì)PRF1的上游靶標(biāo)的其他藥物具有更小的副作用。在本發(fā)明范圍內(nèi)提供了適于比本領(lǐng)域中公知的藥學(xué)活性化合物，如，例如，LY 294002更具選擇性的藥學(xué)活性化合物的設(shè)計(jì)、篩選、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的藥物靶標(biāo)。通過(guò)控制效應(yīng)分子，即PRF1和參與該途徑的其他下游分子的該特定部分，僅極有限量的其平行分支或信號(hào)級(jí)聯(lián)放大中另外的上游靶可能導(dǎo)致不期望的作用。因此，涉及細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯的PI-3激酶/PTEN途徑和/或HIF1α途徑的其他活性將不受影響。
如此處描述的PRF1除了是與上述指定的疾病和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)的有價(jià)值的靶標(biāo)分子以外，在核酸水平和蛋白質(zhì)水平上，還是與組合治療的開(kāi)發(fā)或應(yīng)用和用于這種組合治療的藥物有關(guān)的尤其有價(jià)值的靶標(biāo)。換句話說(shuō)，PRF1，即編碼其的核酸以及蛋白質(zhì)，可用于篩選、產(chǎn)生、生產(chǎn)或設(shè)計(jì)可用于細(xì)胞、組織、器官或患者的敏化的化合物，該敏化使得該細(xì)胞、組織、器官或患者對(duì)治療，優(yōu)選使用在核酸水平上或蛋白質(zhì)水平上與針對(duì)PRF1的化合物和藥物分別不同的化合物或藥物的治療敏感。在本發(fā)明范圍中，所述化合物還用于生產(chǎn)分別治療任何如此處描述的病癥和疾病之一的藥物，該藥物被單獨(dú)使用或者分別與針對(duì)PRF1的化合物或藥物一起使用。
不希望被任何理論束縛，似乎通過(guò)PI 3-激酶途徑的HIF1α分支以及AKT分支調(diào)節(jié)PRF1。由于在缺氧條件下HIF1α被上調(diào)和在脅迫條件下Akt被上調(diào)以引發(fā)阻礙細(xì)胞的凋亡反應(yīng)的生存應(yīng)答，所以針對(duì)如此處描述的PRF1并且可用作藥物或者PRF1的相互作用配偶體的化合物，在核酸水平和/或蛋白質(zhì)水平上，可以將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一種情形，在該情形中其他化合物尤其有效。因此在本發(fā)明范圍內(nèi)使用所述針對(duì)PRF1的化合物篩選可用于治療任何此處描述的疾病(包括但不限于腫瘤疾病)，和用于治療所述疾病的化合物。因此，可以，例如，在缺氧條件下和/或?qū)⒚{迫應(yīng)用于細(xì)胞，如應(yīng)用細(xì)胞抑制劑，例如，順鉑、放射，優(yōu)選與腫瘤的治療和高熱聯(lián)合使用實(shí)施篩選。優(yōu)選地，在用于此處公開(kāi)的疾病之一的治療和/或治療該疾病的藥物的開(kāi)發(fā)的化合物和藥物的篩選、產(chǎn)生、生產(chǎn)和/或設(shè)計(jì)過(guò)程方法中包括兩個(gè)靶標(biāo)，其中所述靶標(biāo)之一優(yōu)選不同于PRF1。
針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子如HIF1α的篩選可以成功地進(jìn)行，可以從Welsh，S.J.等人，Molecular Cancer Therapeutics卷2，235-243，2003年3月得到。
此外，不誘導(dǎo)胰島素信號(hào)，這意味著實(shí)際上避免了與LY294002的使用相關(guān)的觀察到的糖尿病響應(yīng)或其它副作用。LY294002(2-(4-嗎啉基)8-苯基色酮)是Lilly研究實(shí)驗(yàn)室(Indianapolis)開(kāi)發(fā)的作為PI-3K抑制劑的幾種色酮衍生物小分子抑制劑之一(Vlahos等，1994，JBC，269，5241-5248)。它靶向PI-3K分子它們的催化亞基，p110并且通過(guò)與ADP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合催化中心來(lái)發(fā)揮作用。然而，LY294002不能辨別不同的p110同工型(α，β，γ，δ)，這些同工型提示具有不同細(xì)胞功能。
PRF1也是雷帕霉素處理的mTOR的另一下游。mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶)，也稱(chēng)為Raft或FRAP，作用于PI 3-激酶的下游來(lái)調(diào)節(jié)諸如pp70 S6激酶依賴(lài)性進(jìn)入細(xì)胞周期的過(guò)程。mTOR用作生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)可用性的傳感物以通過(guò)激活pp70 S6激酶和起始因子4E來(lái)控制翻譯。mTOR的功能受細(xì)菌大環(huán)內(nèi)酯雷帕霉素抑制，雷帕霉素抑制T-細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)(Kuruvilla和Schreiber 1999，Chemistry & Biology 6，R129-R136)。
雷帕霉素及其衍生物是當(dāng)前用于臨床的適當(dāng)藥物的事實(shí)證明藥靶更有益和具有更小副作用，更具體地它是關(guān)于例如Yu等(Yu，K.等(2001)Endrocrine-RelatCanc 8，249)證明的特定分子機(jī)制。因?yàn)槔着撩顾赜糜谌祟?lèi)中免疫抑制，干擾PRF1的藥物可能對(duì)于該適應(yīng)癥更特異。
由于上面概述的PRF1的特異性以及其作為潛在的藥物靶標(biāo)的應(yīng)用，其還可以作為診斷標(biāo)記物并且優(yōu)選允許PRF1的選擇性和特異檢測(cè)的分別設(shè)計(jì)的試劑將用作診斷劑。再次，標(biāo)記物對(duì)特定生物學(xué)現(xiàn)象或者信號(hào)途徑越接近和越特異，其對(duì)于最后觀察的結(jié)果越接近，關(guān)于最終過(guò)程(在本情況中分別是轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生)是否可能發(fā)生所作出的聲明就越可靠。因此，分別基于PRF1和檢測(cè)PRF1的診斷劑是允許分別對(duì)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，或者此處描述的其他疾病和此處描述的病癥之一的可能性的更可靠評(píng)估的診斷劑。這些預(yù)測(cè)尤其涉及此處描述的那些疾病和此處描述的病癥。在基于如此處公開(kāi)的PRF1的治療劑的設(shè)計(jì)、篩選和/或生產(chǎn)中，PRF1可用作可用作藥物或候選藥物或者作為診斷劑的化合物所針對(duì)的化合物。這些化合物屬于不同的化合物類(lèi)別如抗體、肽、抗促成素、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸和siRNA以及小分子。使用PRF1自身作為物理或化學(xué)實(shí)體或者與PRF1相關(guān)的信息設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或生產(chǎn)該化合物。在所述類(lèi)別的化合物的設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或生產(chǎn)中，PRF1也將稱(chēng)為用于該過(guò)程而不是各種化合物對(duì)需要該化合物的患者的最終應(yīng)用中的靶標(biāo)。在提供各種類(lèi)別的化合物的過(guò)程中，可以使用PRF1或者編碼PRF1的核酸，包括具有或者含有上述變異之一的一種實(shí)施方案。如此處所用的術(shù)語(yǔ)PRF1包括PRF1的任何片段或衍生物，其允許設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或生產(chǎn)各類(lèi)化合物的所述類(lèi)別的化合物，該化合物被應(yīng)用時(shí)反過(guò)來(lái)可作為藥物或具有同樣活性的診斷劑。如此處所用的術(shù)語(yǔ)編碼PRF1的核酸將包括含有編碼如上面定義的PRF1的核酸的核酸，或者其一部分。編碼PRF1的核酸的一部分被同樣考慮，只要其仍然適于所述類(lèi)別的化合物的設(shè)計(jì)、選擇、篩選、產(chǎn)生和/或生產(chǎn)，該化合物被應(yīng)用時(shí)反過(guò)來(lái)可作為藥物或具有同樣活性的診斷劑。編碼PRF1的核酸可以是基因組核酸、hnRNA、mRNA、cDNA或者它們每一種的一部分。
在本發(fā)明內(nèi)，如上述的化合物，即，但不限于，抗體、肽、抗促成素、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸和siRNA可以為了如關(guān)于PRF1所描述的同樣的目的使用。
如上面概述的，在本發(fā)明內(nèi)，除了PRF1或者其一部分或者衍生物或者相應(yīng)的核酸序列，如此處描述，還可以使用其他方法或化合物以產(chǎn)生或者抑制PRF1或者編碼PRF1的核酸引起的效果?？梢栽诤Y選方法中確定或者選擇這些方法。在該篩選方法中，第一步是提供一種或幾種所謂的候選化合物。如此處所用的候選化合物是如下化合物，將在試驗(yàn)系統(tǒng)中試驗(yàn)候選化合物治療或減輕如此處描述的各種疾病和如此處描述的病癥的適宜性，或者候選化合物將用作這種疾病和病癥的診斷方法或試劑。如果候選化合物在試驗(yàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)出相應(yīng)效果，那么所述候選化合物是所述疾病和病癥的適宜方法或適宜試劑和，原則上，也是所述疾病和病癥的適宜的診斷劑。在第二步中，將候選化合物與PRF1表達(dá)系統(tǒng)或者PRF1活性系統(tǒng)接觸。PRF1活性系統(tǒng)在此處也被稱(chēng)為檢測(cè)PRF1活性的系統(tǒng)。
PRF1表達(dá)系統(tǒng)基本上是表現(xiàn)或顯示出PRF1的表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)，從而表達(dá)程度或水平基本上可被改變。PRF1活性系統(tǒng)基本上是一種表達(dá)系統(tǒng)，其中測(cè)量PRF1的活性或者活性情況而不是PRF1的表達(dá)。更具體地，試驗(yàn)了在候選化合物的影響下，PRF1或者編碼PRF1的核酸的活性是否不同于沒(méi)有候選化合物的情形。不管具體系統(tǒng)是表達(dá)系統(tǒng)還是活性系統(tǒng)，在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以發(fā)生并測(cè)量活性和表達(dá)各自的增加或減少。通常，該表達(dá)系統(tǒng)和/或活性系統(tǒng)是一種體外反應(yīng)系統(tǒng)，如細(xì)胞提取物或者該細(xì)胞提取物的級(jí)分如細(xì)胞核提取物。如此處所用的PRF1表達(dá)系統(tǒng)或活性系統(tǒng)也可以是細(xì)胞、組織或器官，優(yōu)選與如此處描述的疾病或如此處描述的病癥有關(guān)的細(xì)胞或組織或器官的細(xì)胞。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，還可以實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的試劑的篩選方法，從而步驟d)后，該方法的內(nèi)在順序步驟1的第一輪中得到或者鑒定的候選化合物被置于步驟c)，從而表達(dá)系統(tǒng)或者活性系統(tǒng)不同于在表征候選化合物的第一輪中所用的各自表達(dá)系統(tǒng)或活性系統(tǒng)。因此，在第一輪中，表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)分別可以是與此處描述的疾病有關(guān)的系統(tǒng)，其中在第二輪中細(xì)胞可以是與所述疾病無(wú)關(guān)的細(xì)胞。在備選實(shí)施方案中，使用兩種細(xì)胞類(lèi)型的順序被顛倒。
可以在每個(gè)表達(dá)水平確定活性系統(tǒng)或表達(dá)系統(tǒng)中是否有增加或者降低，這可以例如通過(guò)測(cè)量在候選化合物的影響下編碼PRF1的核酸，更具體地mRNA的量的增加或減少，或者所表達(dá)的PRF1的增加或減少來(lái)確定。這種改變，如對(duì)于mRNA或者蛋白質(zhì)的測(cè)量，更具體地定量測(cè)量所需要的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還公知的是例如用適宜的抗體確定PRF1的量或含量的方法。可以如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和例如Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)所描述的產(chǎn)生抗體。
對(duì)于PRF1表達(dá)系統(tǒng)，可以優(yōu)選在功能測(cè)定法中確定PRF1的活性的增加或減小。
通常通過(guò)將候選化合物的水性溶液加到各自反應(yīng)系統(tǒng)(其在此處通常也被稱(chēng)為試驗(yàn)系統(tǒng))實(shí)施候選化合物分別與表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)的接觸。除了水性溶液還可以使用有機(jī)溶劑中的候選化合物的懸浮液或溶液。水溶液優(yōu)選為緩沖液。
優(yōu)選地，在每輪分別使用表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)中，僅使用單一候選化合物。然而，還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是幾個(gè)該類(lèi)測(cè)試在高通量系統(tǒng)中平行進(jìn)行。
按照本發(fā)明的方法的另一步驟在于測(cè)定在候選化合物的影響下，表達(dá)系統(tǒng)和活性系統(tǒng)的表達(dá)或活性是否分別相對(duì)于PRF1或編碼其的核酸變化。典型地，這通過(guò)將加入候選化合物后的系統(tǒng)反應(yīng)與未加入候選化合物的系統(tǒng)反應(yīng)比較完成。優(yōu)選地，候選化合物是化合物文庫(kù)的成員?；旧先魏位衔镂膸?kù)適合于本發(fā)明目的，而與化合物類(lèi)別無(wú)關(guān)。適當(dāng)?shù)幕衔镂膸?kù)尤其有由小分子組成的文庫(kù)，由肽、蛋白質(zhì)、抗體、抗促成素和功能核酸組成的文庫(kù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知可以產(chǎn)生后者化合物并在本文中概述。
PRF1的特異性抗體或編碼PRF1的核酸的制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，并且例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。優(yōu)選地，單克隆抗體可以與本發(fā)明結(jié)合使用，其可以按照Cesar和Milstein的方案和基于其的進(jìn)一步發(fā)展來(lái)制備。本文所用抗體包括但不限于，完全抗體，抗體片段或衍生物如Fab片段，F(xiàn)c片段和單鏈抗體，只要它們適合于和能夠與蛋白激酶Nβ結(jié)合。除了單克隆抗體以外，還可以使用和/或產(chǎn)生多克隆抗體。多克隆抗體的產(chǎn)生也為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring HarborLaboratory，Cold Srping Harbor，NY，(1988)中描述。優(yōu)選地，用于治療目的的抗體是以上定義的人源化的或人的抗體。
按照本發(fā)明可以使用的抗體可以具有一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)記或標(biāo)簽。這些標(biāo)記或標(biāo)簽可以在其診斷應(yīng)用或其治療應(yīng)用中用于檢測(cè)抗體。優(yōu)選地，標(biāo)記和標(biāo)簽選自包含抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素、金和熒光素的組，并例如在ELISA方法中使用。這些和另外的標(biāo)記在例如Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。
還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是，標(biāo)簽或標(biāo)記顯示除了檢測(cè)以外的額外功能，如與其它分子相互作用。該相互作用可以例如是與其它化合物的特異相互作用。這些其它化合物可以是其中使用抗體的系統(tǒng)如人或動(dòng)物體固有的那些或通過(guò)使用各自抗體分析的樣品。適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可以例如是生物素或熒光素，其特異相互作用的配偶體如抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白等存在于各種化合物或結(jié)構(gòu)上以與如此標(biāo)記或帶標(biāo)簽的抗體相互作用。
使用PRF1蛋白質(zhì)或編碼PRF1的核酸可以產(chǎn)生的另一類(lèi)藥物以及診斷劑是與其結(jié)合的肽。這些肽可以通過(guò)使用按照現(xiàn)有技術(shù)的方法如噬菌體展示產(chǎn)生?；旧?，產(chǎn)生諸如噬菌體形式的肽文庫(kù)，這種文庫(kù)與靶分子接觸，在本情形中靶分子是例如PRF1。隨后從各自反應(yīng)中優(yōu)選作為與靶分子的復(fù)合體去除與靶分子結(jié)合的那些肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知結(jié)合特性至少在一定程度上依賴(lài)于具體實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)定如鹽濃度等。在從未結(jié)合的文庫(kù)成員中分離以較高親和力或較大力與靶分子結(jié)合的那些肽以后，和任選地還在從靶分子和肽的復(fù)合體中去除靶分子以后，可以隨后表征各個(gè)肽。在表征前，任選地如例如通過(guò)增殖編碼肽的噬菌體來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增步驟。表征優(yōu)選包含將靶結(jié)合肽測(cè)序。基本上，肽不受它們的長(zhǎng)度限制，然而在各種方法中優(yōu)選獲得優(yōu)選長(zhǎng)度約為8-20個(gè)氨基酸的肽。文庫(kù)的大小可以為約102至1018，優(yōu)選108至1015種不同的肽，然而不限于此。
一種具體形式的靶結(jié)合多肽是所謂的“抗促成素”，其尤其在德國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)DE 197 42 706中描述。
按照本發(fā)明，PRF1以及編碼PRF1的核酸可以在篩選方法中用作制備或開(kāi)發(fā)治療本文所述疾病和本文所述疾病癥狀的藥物的靶，以及制備和/或開(kāi)發(fā)用于診斷所述疾病和所述癥狀的工具，其中在篩選方法中使用小分子或小分子文庫(kù)。該篩選包含同時(shí)或順序?qū)蟹肿优c優(yōu)選來(lái)自上面指定文庫(kù)的那些的單個(gè)小分子或多種小分子接觸的步驟，和鑒定與靶分子結(jié)合的那些小分子或文庫(kù)成員，其如果連同其它小分子篩選，可以從未結(jié)合或未相互作用的小分子中分離。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到結(jié)合和未結(jié)合可強(qiáng)烈受具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)定影響。在改變反應(yīng)參數(shù)的嚴(yán)謹(jǐn)度方面可以改變結(jié)合和未結(jié)合的程度，這允許微調(diào)該篩選方法。優(yōu)選地，在鑒定一種或幾種與靶分子特異相互作用的小分子以后，可以進(jìn)一步表征該小分子。這種進(jìn)一步表征可以例如在于鑒定小分子和確定其分子結(jié)構(gòu)和另外的物理、化學(xué)、生物和/或醫(yī)學(xué)特性。優(yōu)選地，天然化合物具有約100-1000Da的分子量。還優(yōu)選地，小分子是遵守本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Lepinsky五項(xiàng)法則的那些。備選地，與優(yōu)選非合成的天22物相反，還可以限定小分子以使它們是優(yōu)選產(chǎn)生于組合化學(xué)的合成小分子。然而，應(yīng)當(dāng)注意這些定義是僅幫助對(duì)本領(lǐng)域各個(gè)術(shù)語(yǔ)的一般理解。
還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是將PRF1和/或編碼PRF1的核酸用作制備或選擇適體和spiegelmer的靶分子，其然后可以直接或間接用作藥物或診斷劑。
適體是單鏈或雙鏈的并且與靶分子特異性相互作用的D-核酸。適體的制備或選擇例如在歐洲專(zhuān)利EP 0 533 838中描述?；旧蠈?shí)現(xiàn)下列步驟。首先，提供核酸即潛在適體的混合物，其中每個(gè)核酸典型地包含幾個(gè)、優(yōu)選至少8個(gè)順序隨機(jī)化的核苷酸的片段。該混合物隨后與靶分子接觸，其中如基于與候選混合物相比，對(duì)靶增加的親和力或與其的更大力，核酸與靶分子結(jié)合。結(jié)合核酸隨后從混合物的剩余部分中分離。任選地，使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增如此獲得的核酸。這些步驟可以重復(fù)數(shù)次最終提供與靶特異性結(jié)合的核酸比率提高的混合物，然后從中任選地選擇最終結(jié)合核酸。這些特異性結(jié)合的核酸稱(chēng)為適體。明顯的是在產(chǎn)生或鑒定適體的方法的任何階段，可以取單個(gè)核酸混合物樣品來(lái)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定其序列。在本發(fā)明范圍內(nèi)的是可以例如通過(guò)引入產(chǎn)生適體的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的限定化學(xué)基團(tuán)來(lái)穩(wěn)定適體。該修飾可以例如在于在核苷酸糖部分的2’-位引入氨基。適體當(dāng)前用作治療劑。然而，還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是如此選擇或產(chǎn)生的適體可以用于靶驗(yàn)證和/或作為先導(dǎo)物質(zhì)用于開(kāi)發(fā)藥物，優(yōu)選基于小分子的藥物。這實(shí)際上通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定完成，其中靶分子和適體之間的特異相互作用受候選藥物的抑制，候選藥物從靶和適體的復(fù)合體中替代適體，可以假定各個(gè)候選藥物允許特異性抑制靶和適體之間的相互作用，和如果相互作用是特異性的，所述候選藥物至少在原則上將適合于阻斷靶和因此在各種包含該靶的系統(tǒng)中降低其生物有效性或活性。如此獲得的小分子可以然后進(jìn)行進(jìn)一步的衍生化和修飾以優(yōu)化其物理、化學(xué)、生物和/或醫(yī)學(xué)特性如毒性、特異性、生物可降解性和生物利用度。
基于類(lèi)似原理產(chǎn)生或制備spiegelmer，其可以按照使用PRF1或編碼PRF1的核酸的本發(fā)明使用或產(chǎn)生。Spiegelmer的制備在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/08856中描述。Spiegelmer是L-核酸，這意味著它們由L-核苷酸組成，不同于如適體由D-核苷酸組成的適體。Spiegelmer其特征在于它們?cè)谏锵到y(tǒng)中具有極高穩(wěn)定性和與適體相比與它們針對(duì)的靶分子特異性相互作用的事實(shí)。為了產(chǎn)生spiegelmer，產(chǎn)生D-核酸異質(zhì)群體并將該群體與靶分子的旋光對(duì)映體接觸，在本情形中例如與天然存在的PRF1的L-對(duì)映異構(gòu)體的D-對(duì)映異構(gòu)體接觸。隨后，分離不與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些D-核酸。然而，分離與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的那些D-核酸，任選地測(cè)定和/或測(cè)序和隨后基于獲自D-核酸的核酸序列信息合成相應(yīng)的L-核酸。序列和與靶分子的旋光對(duì)映體相互作用的上述D-核酸相同的這些L-核酸，將特異性地與天然存在的靶分子而不是與其旋光對(duì)映體相互作用。類(lèi)似于產(chǎn)生適體的方法，還可以重復(fù)各個(gè)步驟數(shù)次和由此富集與靶分子的旋光對(duì)映體特異性相互作用的那些核酸。
基于本文公開(kāi)的作為靶分子的PRF1或編碼PRF1的核酸可以制備或產(chǎn)生的另一類(lèi)化合物是核酶，反義寡核苷酸和siRNA。由于PRF1的功能和作用模式，優(yōu)選基于本發(fā)明的公開(kāi)，更優(yōu)選基于此處公開(kāi)和描述的核酸序列產(chǎn)生和/或生成這些種類(lèi)的分子，這些分子也被稱(chēng)為和用作基于核酸的藥物。
所有上述核酸的共同特征是它們不與靶分子在翻譯產(chǎn)物水平上(在本情形中PRF1)相互作用，而是與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即編碼PRF1的核酸如基因組核酸或其衍生的任何核酸如分別地相應(yīng)的hnRNA，cDNA和mRNA)相互作用。因此，上述類(lèi)別的化合物的靶分子優(yōu)選為PRF1的mRNA。
核酶是有催化活性的核酸，優(yōu)選由基本上包含兩部分的RNA組成。第一部分顯示催化活性而第二部分負(fù)責(zé)與靶核酸(在本情形中編碼PRF1的核酸)的特異相互作用。當(dāng)靶核酸和核酶的第二部分之間典型地通過(guò)兩條雜交鏈上基本上互補(bǔ)的堿基序列雜交和沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用時(shí)，催化活性部分可變得有活性，這意味著它在分子內(nèi)或分子間催化靶核酸，假定核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。隨后，可以進(jìn)一步降解靶核酸，由于缺乏新合成的PRF1和在先存在的PRF1的更新，最終導(dǎo)致靶核酸以及衍生于所述靶核酸的蛋白質(zhì)(在本情形中為PRF1)的降解。核酶，它們的應(yīng)用和設(shè)計(jì)原理為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，例如在Doherty和Doudna(Ribozym structures and mechanism.Annu ref.Biophys.Biomolstruct.2001；30457-75)和Lewin & Hauswirth(Ribozyme Gene TherapyApplicationsfor molecular medicine.2001 7221-8)中描述。
反義寡核苷酸分別在制備藥物和作為診斷劑中的應(yīng)用是基于類(lèi)似的作用方式?；旧希趬A基互補(bǔ)性反義寡核苷酸與靶RNA、優(yōu)選與mRNA雜交，由此激活RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶聯(lián)的DNA激活。然而，除了硫代磷酸酯偶聯(lián)的DNA以外，磷酸二酯偶聯(lián)的DNA被細(xì)胞核酸酶迅速降解。這些抗性的非天然存在的DNA衍生物與RNA雜交后不抑制RNase H。換句話說(shuō)，反義多核苷酸僅作為DNA RNA雜交復(fù)合體有效。這類(lèi)反義寡核苷酸的實(shí)例尤其在美國(guó)專(zhuān)利US 5,849,902和US5,989,912中描述。換句話說(shuō)，基于靶分子(在本情形中為編碼PRF1的核酸)的核酸序列，其來(lái)自從中原則上可以推斷各自核酸序列的靶蛋白質(zhì)，或通過(guò)知道如特別是mRNA的核酸序列，基于堿基互補(bǔ)的原理可以設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)姆戳x寡核苷酸。
特別優(yōu)選的是含有短序列的硫代磷酸酯DNA(3-9個(gè)堿基)的反義-寡核苷酸。激活細(xì)菌RNase H需要最少3個(gè)DNA堿基，哺乳動(dòng)物RNase H激活需要至少5個(gè)堿基。在這些嵌合寡核苷酸中，存在形成RNase H的底物的中央?yún)^(qū)域，側(cè)鄰由不形成RNase H的底物的修飾核苷酸組成的雜交“臂”。例如通過(guò)2’-O-甲基或2’-氟可以修飾嵌合寡核苷酸的雜交臂。備選方法在所述臂中使用膦酸甲酯或氨基磷酸酯鍵。用于實(shí)施本發(fā)明的反義寡核苷酸的另外實(shí)施方案是對(duì)甲氧基寡核苷酸，部分對(duì)甲氧基寡脫氧核糖核苷酸或?qū)籽趸押塑账帷?br> 對(duì)于本發(fā)明特別相關(guān)和有用的是在上述兩個(gè)US專(zhuān)利中更具體描述的那些反義寡核苷酸。這些寡核苷酸不含有天然存在的5′→3′-連接的核苷酸。然而寡核苷酸具有兩類(lèi)核苷酸激活RNase H的2’-脫氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2’-修飾核苷酸。2’-修飾核苷酸之間的鍵可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或?qū)σ已趸姿岫?。通過(guò)連續(xù)的RNase H-激活區(qū)域完成RNase H的激活，該區(qū)域在3和5之間含有激活細(xì)菌RNase H的2’-脫氧硫代磷酸酯核苷酸和在5和10之間含有激活真核的、特別是哺乳動(dòng)物RNase H的2’-脫氧硫代磷酸酯核苷酸。防止降解的保護(hù)是通過(guò)使5’和3’末端堿基高度抗核酸酶和任選地通過(guò)放置3’末端保護(hù)基團(tuán)來(lái)完成。
更具體地，反義寡核苷酸包含5’末端和3’末端；11-59 5′→3′-連接的核苷酸獨(dú)立地選自由2’-修飾磷酸二酯核苷酸和2’-修飾的對(duì)烷氧基磷酸三酯核苷酸組成的組；和其中5’-末端核苷酸與3個(gè)和10個(gè)連續(xù)硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸之間的RNase H激活區(qū)域連接，和其中所述寡核苷酸的3’-末端選自由反向脫氧核糖核苷酸、1-3個(gè)硫代磷酸酯2’-修飾核糖核苷酸的連續(xù)序列、生物素基團(tuán)和對(duì)烷氧基磷酸三酯核苷酸組成的組。
還可以使用反義寡核苷酸，其中不是5’末端核苷酸而是上述3’末端核苷酸與RNase H-激活區(qū)域連接。而且，5’末端選自特定組而不是所述寡核苷酸的3’末端。
適當(dāng)?shù)暮陀杏玫姆戳x寡核苷酸還有以下那些包含5’末端RNase H激活區(qū)域和在5個(gè)和10個(gè)連續(xù)脫氧硫代磷酸酯核苷酸之間；在11-59個(gè)連續(xù)5′→3′-連接的2’-甲氧基核糖核苷酸之間含有RNase H激活區(qū)域；和核酸外切酶封閉基存在于寡核苷酸的3’末端，其來(lái)源于由非-5′-3′-磷酸二酯-連接的核苷酸，1-3個(gè)連續(xù)的5′-3′-連接的修飾核苷酸和非核苷酸化學(xué)封閉基組成的組。
如下可以表征兩類(lèi)特別優(yōu)選的反義寡核苷酸第一類(lèi)反義寡核苷酸，在本文中也稱(chēng)為第二代反義寡核苷酸，包含總共23個(gè)核苷酸，其包含5′→3′方向的7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的一段序列，9個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸的一段序列，6個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的一段序列和3’-末端2’-脫氧核糖核苷酸。從7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的第1個(gè)基團(tuán)開(kāi)始，首先4個(gè)是硫代磷酸酯連接，而隨后4個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸是磷酸二酯連接。此外，在最后一個(gè)即2’-O-甲基核糖核苷酸的最3’-末端和由9個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸組成的序列的第一個(gè)核苷酸之間存在磷酸二酯鍵。所有2’-脫氧核糖核苷酸是硫代磷酸酯連接。硫代磷酸酯還存在最后一個(gè)即最3’-末端的2’-脫氧核苷酸和隨后由6個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸組成的序列的第一個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸之間。從6個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的該基團(tuán)開(kāi)始，它們中的首先4個(gè)，再次以5′→3′方向，是磷酸二酯鍵連接的，而它們中的最后3個(gè)，對(duì)應(yīng)于位置20-22，是硫代磷酸酯連接的。最后一個(gè)，即末端3’-末端2’-脫氧核苷酸通過(guò)硫代磷酸酯鍵與最后一個(gè)即最3’-末端2’-O-甲基核糖核苷酸連接。
該第一類(lèi)也可以通過(guò)參考下列示意性結(jié)構(gòu)描述RRRnnnnNNNNNNNNNnnnRRRN。因此，R表示硫代磷酸酯連接的2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；n表示2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸(A，G，T，C)。
第二類(lèi)特別優(yōu)選的反義寡核苷酸，在本文中也稱(chēng)為第三代反義寡核苷酸或GeneBlocs，也包含具有下列堿基結(jié)構(gòu)(5′→3′方向)的總共17-23個(gè)核苷酸。
在5’-末端存在反向無(wú)堿基核苷酸，其是適合于賦予對(duì)外切核酸酶活性的抗性的結(jié)構(gòu)和例如在WO 99/54459中描述。該反向無(wú)堿基與磷酸二酯連接的5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的序列連接。在該5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的序列之后有7-9個(gè)2’-脫氧核糖核苷酸的序列，其全部都是硫代磷酸酯連接的。最后一個(gè)即最3’-末端的2’-O-甲基核糖核苷酸和包含2’-脫氧核苷酸的序列的第一個(gè)2’-脫氧核苷酸之間的連接是通過(guò)磷酸二酯鍵發(fā)生。與7-9個(gè)2’-脫氧核苷酸的序列鄰近，連接由5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸組成的序列。最后一個(gè)2’-脫氧核苷酸與稍后提及的由5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸組成的序列的第一個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的連接是通過(guò)硫代磷酸酯鍵發(fā)生。5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸的序列是磷酸二酯連接的。在第二個(gè)5-7個(gè)2’-O-甲基核糖核苷酸序列的3’-末端連接另一個(gè)反向無(wú)堿基。
該第二類(lèi)還可以通過(guò)參考下列示意性結(jié)構(gòu)描述(GeneBlocs代表第三代反義寡核苷酸，也具有下列示意性結(jié)構(gòu))帽-(np)x(Ns)y(np)z-帽或帽-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-帽。因此，帽代表兩個(gè)末端處的反向脫氧無(wú)堿基或類(lèi)似修飾；n代表2’-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸(A，G，T，C)；x表示5-7的整數(shù)；y表示7-9的整數(shù)；和z表示5-7的整數(shù)。
應(yīng)當(dāng)注意整數(shù)x，y和z可以彼此獨(dú)立地選擇，盡管優(yōu)選x和z在給定反義寡核苷酸中相同。因此，下列第三代反義寡核苷酸的堿基設(shè)計(jì)或結(jié)構(gòu)可以如下帽-(np)5(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)7np)7-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)7帽，帽-(np)5(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)7-帽和帽-(np)7(Ns)9(np)7-帽。
基于本文提供的技術(shù)教導(dǎo)可以產(chǎn)生的和可以用作藥物和/或診斷劑的另一類(lèi)化合物是針對(duì)編碼PRF1的核酸、優(yōu)選mRNA的小干擾RNA(siRNA)。siRNA是典型長(zhǎng)度為約21至約23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA。兩條RNA鏈之一的序列對(duì)應(yīng)于待降解的靶核酸如編碼PRF1的核酸的序列。換句話說(shuō)，知道靶分子(在本情形中PRF1)的核酸序列，優(yōu)選mRNA序列，可以設(shè)計(jì)雙鏈RNA，兩條鏈之一與所述例如PRF1的mRNa互補(bǔ)，當(dāng)將所述siRNA應(yīng)用于含有編碼PRF1的基因、基因組DNA、hnRNA或mRNA的系統(tǒng)時(shí)，各自的靶核酸將被降解和因此降低各個(gè)蛋白質(zhì)的水平。設(shè)計(jì)、構(gòu)建和使用所述siRNA分別作為藥物和診斷劑的基本原理尤其在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 00/44895和WO 01/75164中描述。
基于上述類(lèi)別的化合物如抗體、肽、抗促成素、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸以及siRNA的作用方式，因此還屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的是使用分別靶向PRF1和編碼其的核酸的這些化合物中任何一種，以制備針對(duì)本文所述任何疾病和本文所述任何疾病癥狀的藥物或診斷劑。另外，這些試劑可以用于分別監(jiān)視所述疾病和疾病癥狀的進(jìn)展和施用的任何治療的成功。
按照本發(fā)明設(shè)計(jì)的各類(lèi)化合物如抗體、肽、抗促成素、小分子、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸和siRNA也可以包含在藥物組合物中。優(yōu)選該藥物組合物用于治療本文所述疾病或本文所述疾病癥狀。在一個(gè)實(shí)施方案中藥物組合物還可以包含一種或幾種上述類(lèi)別的化合物和/或單一類(lèi)別的一個(gè)或多個(gè)成員，和任選地另外的藥物活性化合物，和藥用載體。該載體可以是液體或固體，例如溶液，緩沖液，醇溶液等。適當(dāng)?shù)墓腆w載體尤其是淀粉等。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是提供按照上述類(lèi)別的化合物的不同化合物的各種制劑，以便實(shí)現(xiàn)特定給藥途徑如口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等。
上述不同類(lèi)別的化合物的各種化合物也可以單獨(dú)或組合附屬于或包含在試劑盒中。除了各種化合物以外該試劑盒另外包含一種或多種附加成分(element)或化合物，其中該成分選自包含緩沖液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和各種化合物的使用說(shuō)明的組。優(yōu)選地，各種化合物以干燥或液體形式存在，優(yōu)選作為每次單一給藥的單位劑量存在。試劑盒可以特別用于治療、診斷或監(jiān)視疾病或?qū)Ρ疚乃黾膊『图膊“Y狀施加的治療的進(jìn)展。
在另一方面，PRF1和編碼其的核酸和優(yōu)選地氨基酸序列和PRF1多肽或蛋白質(zhì)可用于開(kāi)發(fā)和/或產(chǎn)生和/或設(shè)計(jì)用于此處描述的疾病和病癥中任何一種的治療和/或預(yù)防和/或診斷的化合物。為此，在第一步中，確定并篩選PRF1，優(yōu)選PRF1蛋白的相互作用配偶體。更優(yōu)選地，這種相互作用配偶體是天然存在的相互作用配偶體，更優(yōu)選這種相互作用配偶體是天然相互作用配偶體。確定或篩選這種相互作用配偶體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。一種熟知的技術(shù)是所謂的雙-雜交系統(tǒng)，其在例如，Ausubel(如前)，unit 13.14”Interaction Trap/Two-Hybrid System to Identify InteractingProteins”或Fields S.，Song，O.，Nature.1989 Jul 20；340(6230)245-6中描述。其備選方案是從細(xì)胞提取物或細(xì)胞裂解物沉淀PRF1蛋白或其片段并確定哪一種其他因子附著PRF1或者與PRF1共沉淀?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如質(zhì)譜進(jìn)行這種分析。在具體實(shí)施方案中，該沉淀是免疫沉淀。在另一實(shí)施方案中，用放射-標(biāo)記的細(xì)胞，優(yōu)選35S標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行沉淀。除了該相互作用配偶體，還可以使用層析方法和表征所得級(jí)分(例如洗脫的級(jí)分)來(lái)確定天然存在的相互作用配偶體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中這種層析方法也可以是親和層析，從而PRF1蛋白被固定在分離介質(zhì)上。由于RPF1蛋白和可能的相互作用配偶體之間的特異相互作用，該相互作用配偶體將作為層析方法中的配體并從而可被純化和進(jìn)一步鑒定。
在第二步所鑒定的相互作用配偶體可用于關(guān)于PRF1的如此處描述的篩選方法。附加或備選地，編碼相互作用配偶體的核酸，如果其是基于多肽或核酸的相互作用配偶體，那么可以用于設(shè)計(jì)和/或生成和/或產(chǎn)生此處定義的化合物種類(lèi)如，但不限于，抗體、肽、抗促成素、小分子、適體、spiegelmer、核酶、反義分子(在此處也稱(chēng)為反義寡核苷酸)，和siRNA。關(guān)于術(shù)語(yǔ)siRNA，可以包括其任何形式，包括但不限于如WO 03/070918中描述的siRNA。
應(yīng)該理解上述第一步本身可以是一種方法，第二步僅僅被任選實(shí)施。
通過(guò)下面的附圖和實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些附圖和實(shí)施例不打算限制保護(hù)范圍而是僅用于例證的原因。從所述附圖、實(shí)施例可以得到本發(fā)明另外的特征、實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)，其中圖1顯示生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PI 3-激酶途徑激活的圖示；圖2顯示同位PC-3小鼠模型中在用雷帕霉素(Rapamune)處理后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的測(cè)量；圖3顯示鑒定PRF1為PI 3-激酶途徑下游藥靶的實(shí)驗(yàn)方法；圖4顯示對(duì)PC-3細(xì)胞的初級(jí)GeneBloc篩選；圖5顯示了matrigel上用PRF1特異的GeneBlocs轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，圖5A顯示了在這些條件下mRNA的剔除，圖5B顯示了從生長(zhǎng)在matrigel上的各自細(xì)胞得到的照片。
圖6顯示了PRF1特異RNA干涉對(duì)前列腺腫瘤生長(zhǎng)抑制的程度(圖6C)和使用相同PRF1特異RNA干涉時(shí)總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度(圖6D)，圖6A顯示了用于siRNA的表達(dá)的基本載體設(shè)計(jì)，圖6B是所用的siRNA序列。
圖7顯示了差異表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中監(jiān)視生長(zhǎng)在各種生長(zhǎng)表面上的不同細(xì)胞系的PRF1的表達(dá)，細(xì)胞被不同化合物處理，從而針對(duì)PI 3-激酶途徑的不同成分。
圖8A顯示了用于表征針對(duì)PRF1的多克隆抗體的特異性的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果；圖8B顯示了用圖8A中表征的多克隆抗體并使用預(yù)免疫血清染色的前列腺癌組織的兩張照片。
圖9A顯示了在24h、48h、72h和96h用LY294002(LY)或DMSO處理的細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果。
圖9B顯示了用對(duì)p110β特異的反義分子(GB)處理的PC-3細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果。
圖10A顯示了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)中，用Akt特異的反義分子(GB)處理PC-3細(xì)胞。
圖10B顯示了在缺氧條件下生長(zhǎng)并用對(duì)HIF1α特異的反義分子處理的PC-3細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果；圖11A顯示了在胞外基質(zhì)上用各種反義分子(GB)處理的PC-3細(xì)胞的照片；圖11B顯示了在根據(jù)圖5A的照片中顯示了PC-3細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析；和圖12顯示了PI 3-激酶途徑的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的激活的示意性表示，該途徑現(xiàn)在還含有作為該途徑的下游成分的HIF1α，其與其中稱(chēng)為REDD1的會(huì)聚于RPF1的Akt平行。
圖1顯示生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的PI 3-激酶途徑激活的圖示。生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞膜上它們相關(guān)受體的激活，其又與胞內(nèi)信號(hào)分子如PI 3-激酶相關(guān)并將其激活。腫瘤抑制劑PTEN干擾PI 3-激酶介導(dǎo)的下游應(yīng)答和確保途徑的激活以瞬時(shí)方式發(fā)生。LY294002是PI 3-激酶的小分子抑制劑。PI 3-K的一個(gè)已知下游基因是mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶)，其可以通過(guò)臨床批準(zhǔn)的藥物雷帕霉素(Rapamune)抑制。PI 3-K涉及細(xì)胞周期和DNA修復(fù)、凋亡的調(diào)節(jié)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、生長(zhǎng)翻譯、轉(zhuǎn)化和遷移。X指潛在的下游藥物靶標(biāo)，認(rèn)為該靶標(biāo)參與促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為并且可被認(rèn)為由于更小的副作用而是比更“上游”的靶標(biāo)如mTOR更好的藥物靶標(biāo)。
圖12顯示了類(lèi)似于圖1的表示的PI 3-激酶途徑的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的激活的示意性表示。然而，由于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，PI 3-K途徑已經(jīng)被進(jìn)一步闡明從而HIF1α已經(jīng)被鑒定為對(duì)于PRF1的PI 3-K途徑的分支，該分支與Akt介導(dǎo)的途徑平行。
將在下面的實(shí)施例中給出其他圖的更詳細(xì)描述。
實(shí)施例1材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心(ATCC)。細(xì)胞在F12K營(yíng)養(yǎng)混合物(Kaighn’s改進(jìn))中培養(yǎng)，該營(yíng)養(yǎng)混合物含有10％胎小牛血清(CS)，慶大霉素(50μg/ml)，和兩性霉素(50ng/ml)。按照制造商的使用說(shuō)明，通過(guò)使用各種陽(yáng)離子型脂質(zhì)如Oligofectamine、Lipofectamine(LifeTechnologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals，Inc.，Boulder，CO)或FuGene 6(Roche)，在96孔或10-cm板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染(30％-50％匯合)。通過(guò)將預(yù)形成的無(wú)血清培養(yǎng)基中的5x濃縮的GeneBloc和脂質(zhì)復(fù)合物加入完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)染GeneBlocs。對(duì)于平鋪在96孔中的細(xì)胞總轉(zhuǎn)染體積為100μl，對(duì)于10cm平板中的細(xì)胞為10ml。取決于細(xì)胞密度，最終脂質(zhì)濃度為0.8-1.2μg/ml；GeneBloc濃度在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中顯示。
將培養(yǎng)的細(xì)胞胰蛋白酶消化，在通過(guò)培養(yǎng)基終止胰蛋白酶作用后收獲。加入洗滌步驟(PBS；離心5分鐘/1000rpm)，最后，考慮接種的細(xì)胞數(shù)和體積重懸浮沉淀。
通過(guò)Taqman分析測(cè)定RNA水平的相對(duì)量使用Invisorb RNA HTS 96試劑盒(In Vitek GmbH，Berlin)分離和純化在96-孔中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的RNA。使用300nM PRF1 5’引物，300nM PRF1 3’引物和100nM標(biāo)記的PRF1 Taqman探針Fam-Tamra，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR(Taqman)分析檢測(cè)PRF1 mRNA表達(dá)的抑制。按照制造商的使用說(shuō)明在下列條件下在50μl中進(jìn)行反應(yīng)并在ABI PRISM 7700測(cè)序儀(AppliedBiosystems)上分析48℃30分鐘，95℃10分鐘，接著95℃15秒和60℃1分鐘40個(gè)循環(huán)。
在matrigel基質(zhì)上的體外生長(zhǎng)當(dāng)接種在Matrigel上時(shí)用10μM LY294002或DMSO處理PC3細(xì)胞。如果在接種前轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用GeneBloc轉(zhuǎn)染細(xì)胞和在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)胰蛋白酶消化。在培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞，接種到用250μl matrigel基底膜基質(zhì)(BectonDickinson)預(yù)包被的雙份24-孔(每孔100.000個(gè)細(xì)胞)中。在溫育24-72小時(shí)后用與Axiovert S100顯微鏡(Zeiss)連接的Axiocam照相機(jī)以5x放大率照相。
Affymetrix根據(jù)制造商的方案，使用總RNA試劑盒(AMBION)制備來(lái)自Matrigel上生長(zhǎng)的細(xì)胞的總RNA。在最后步驟中將沉淀的總RNA重懸浮在Invisorb裂解緩沖液中并使用Invisorb spin細(xì)胞-RNA試劑盒(INVITEK)純化。根據(jù)Affymetrix的方案制備生物素標(biāo)記的cRNA，將15μg cRNA雜交到Affymetrix GeneChip組HG-U95上。
數(shù)據(jù)分析使用Affymetrix GeneChip軟件Microarray Suite v4.0分析原始數(shù)據(jù)。作為一組對(duì)應(yīng)于一個(gè)轉(zhuǎn)錄物的16-20個(gè)探針對(duì)的平均的與錯(cuò)配寡核苷酸相比完全匹配寡核苷酸的雜交信號(hào)的差異，計(jì)算每個(gè)探針組的強(qiáng)度。探針組的平均差異與轉(zhuǎn)錄物的豐度成比例。在比較前將不同測(cè)定的總信號(hào)強(qiáng)度換算成相同值。通過(guò)成對(duì)比較來(lái)自實(shí)驗(yàn)和基線測(cè)定的相應(yīng)探針對(duì)的強(qiáng)度，使用Affymetrix軟件計(jì)算倍數(shù)變化。使用Affymetrix描述的抉擇矩陣，軟件還產(chǎn)生絕對(duì)調(diào)用(call)(在實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄物缺乏，臨界或存在)和差異調(diào)用(與另一個(gè)實(shí)驗(yàn)相比一個(gè)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄物的豐度增加，臨界增加，無(wú)變化，臨界降低，降低)。結(jié)果輸出到Microsoft Excel(絕對(duì)調(diào)用，差異調(diào)用，倍數(shù)變化)中并過(guò)濾。丟棄具有缺少調(diào)用或無(wú)變化調(diào)用的所有探針組并通過(guò)倍數(shù)變化將表分類(lèi)。
動(dòng)物研究按照食品與藥物管理局的非臨床實(shí)驗(yàn)室研究的良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范(GLP條例)和根據(jù)作為立法基礎(chǔ)的德國(guó)動(dòng)物保護(hù)法進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
雄性ShoeNMRI-nu/nu小鼠(Tierzucht Schnwalde GmbH)，在SPF條件下保養(yǎng)(層流氣流設(shè)備，Scantainer，Scanbur)，用作人前列腺癌細(xì)胞的受體。將2×106/0,03ml腫瘤細(xì)胞接種到年齡為6-8周和重28-30g的動(dòng)物的前列腺的左背側(cè)葉(iprost；同位的)或肝臟的左側(cè)葉的頂部(ihep；異位的)。為此，小鼠接受全身麻醉，使用Ketanest(Parke-Davis GmbH)和Rompun(Bayer Vital GmbH)80∶1的混合物，劑量分別為100mg/kg和5mg/kg。在腹部身體表面徹底消毒后，通過(guò)腹部皮膚和腹膜壁進(jìn)行切割，從包皮腺邊緣附近開(kāi)始和測(cè)量約1cm。借助一對(duì)鑷子和棉拭，顯現(xiàn)前列腺。同位細(xì)胞攻擊，接著借助放大鏡和通過(guò)使用攜帶30G 0,30×13的微型手術(shù)針(Becton Dickinson)的1ml注射器(Henke Sass Wolf GmbH)。施用是成功的，在接種位點(diǎn)觀察到顯著皰疹。關(guān)于腹膜壁和腹部皮膚的Michel鉗11×2mm(Heiland)，通過(guò)縫合材料(PGA Resorba，F(xiàn)ranz Hiltner GmbH)閉合傷口。傷口噴霧(Hansaplast Sprühpflaster，Beiersdorf AG)覆蓋損傷。在手術(shù)后階段期間將動(dòng)物保養(yǎng)在溫暖環(huán)境中直至完全醒來(lái)。按照每組由5-10只動(dòng)物組成的治療組的數(shù)量隨機(jī)化動(dòng)物。依次檢查它們，包括記錄發(fā)現(xiàn)。施用Ssniff NM-Z，10mm，可高壓滅菌(ssniff Spezialditen GmbH)，作為強(qiáng)化食物和通過(guò)HCl酸化飲用水，兩者都任意。
評(píng)估為了收到實(shí)際劑量水平，在治療日登記體重。同時(shí)，從體重發(fā)展可以獲得以認(rèn)識(shí)治療方式對(duì)整個(gè)生物體的影響。
在第0(基線)；14；28；和35天(處死)進(jìn)行血穿刺。從短期麻醉的動(dòng)物(二乙醚，Otto Fischar GmbH)的眼眶靜脈中吸血。為治療的相容性和副作用提供數(shù)據(jù)的評(píng)估參數(shù)如下白細(xì)胞數(shù)；血小板數(shù)；酶。另外的血載參數(shù)是膽紅素；肌酸酐；蛋白質(zhì)；脲；尿酸。
將所有處死的動(dòng)物完全解剖并照相記錄。通過(guò)一對(duì)測(cè)徑器二維測(cè)量腫瘤(前列腺)和轉(zhuǎn)移瘤(尾部，腰部，腎淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤)。按照V(mm3)＝ab2/2計(jì)算體積，b＜a。通常，實(shí)施治療方法的細(xì)胞數(shù)導(dǎo)致關(guān)于前列腺100％的腫瘤吸收。登記一些器官(肝臟；脾；腎)的重量以便發(fā)現(xiàn)另外的關(guān)于了解次級(jí)副作用的數(shù)據(jù)。
對(duì)于組織學(xué)分析，將腫瘤組織，即前列腺腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的樣品固定在5％甲醛中并包埋石蠟。常規(guī)地，將切片HE染色，如果需要制備特異染色(Azan，PAS)。
為了檢測(cè)腫瘤和轉(zhuǎn)移細(xì)胞的人源，將充分的組織樣品冷凍在液氮中。當(dāng)使用PCR和用huHPRT特異擴(kuò)增子的Taqman分析時(shí)，我們可以在5mg組織中檢測(cè)到50個(gè)人細(xì)胞。
通過(guò)Mann和Whitney u-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)證實(shí)治療結(jié)果。
實(shí)施例2對(duì)下游藥靶適合性概念的實(shí)驗(yàn)證據(jù)如在結(jié)合于此作為參考的本說(shuō)明書(shū)介紹部分中概述，與信號(hào)途徑下游連接的靶對(duì)于設(shè)計(jì)或開(kāi)發(fā)藥物和診斷劑都有價(jià)值。明顯的是，如果特定靶與其它不同途徑連接或者由于它在信號(hào)途徑中的位置與許多生物學(xué)現(xiàn)象連接如轉(zhuǎn)移和遷移、生長(zhǎng)翻譯、調(diào)亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)等，如在PI-3激酶的情形中，處理該靶的任何化合物可能具有多種副作用，其可能對(duì)系統(tǒng)有害和從醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看是不希望有的。因此，進(jìn)一步作用下游的靶應(yīng)當(dāng)是治療干預(yù)的第一選擇。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在PI 3-激酶途徑的控制下涉及除了mTOR以外的另外可能的藥靶，其特異性用于控制轉(zhuǎn)移和遷移的現(xiàn)象和因此腫瘤發(fā)生。在制藥工業(yè)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以Rapamune的商品名出售的雷帕霉素適合于抑制轉(zhuǎn)移和遷移以及免疫抑制(例如用于器官移植)。這證實(shí)了處理下游藥靶的策略的適合性。
如從圖2中可以知道，雷帕霉素適于減小淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤的體積和因此其效果比得上公知的PI 3-激酶抑制劑LY294002，然而，LY294002和許多副作用相關(guān)，從而得到下面的結(jié)果并不令人奇怪PI 3-激酶和mTOR與許多生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)。如在圖2A中描述，使用腫瘤獲得模型，在第1天開(kāi)始使用雷帕霉素的處理。使用的兩個(gè)濃度，即0.4mg/kg/劑量-2mg/kg/劑量導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度的巨大降低，表示為與磷酸鹽緩沖鹽水陰性對(duì)照相比測(cè)量的轉(zhuǎn)移瘤體積(mm3)。
在從第28天開(kāi)始處理的Rapamune處理確立(established)腫瘤模型的情形中也基本上獲得相同結(jié)果(圖2B)。
測(cè)量在用雷帕霉素(Rapamune)處理以后在同位PC-3小鼠模型中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在圖2(A)中顯示(A)腫瘤獲得模型的結(jié)果。用0.03ml前列腺內(nèi)2×106PC3細(xì)胞注射裸shoeNMRI-nu/nu小鼠(每組8只)，每日腹膜內(nèi)使用Rapamune進(jìn)行處理，共28天，劑量為2mg/kg和0.4mg/kg。
PBS用作對(duì)照。
為了處理確立的腫瘤(B)，允許細(xì)胞ipros生長(zhǎng)28天，在移植后第29天至第50天口服使用Rapamune進(jìn)行處理。如A中概述選擇劑量。分別在第29天和第51天犧牲動(dòng)物，測(cè)定總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例3鑒定PRF1作為PI 3-激酶途徑中的下游藥靶基本實(shí)驗(yàn)方法在圖3中顯示。用DMSO或PI 3-K抑制劑LY294002處理在Matrigel上培養(yǎng)的PC3細(xì)胞，從每個(gè)樣品中分離總RNA。進(jìn)行差異Affymetrix基因表達(dá)作圖，使用實(shí)時(shí)RT-PCR Taqman測(cè)定證實(shí)表達(dá)。將p110α用作無(wú)差異的標(biāo)準(zhǔn)。
PC3細(xì)胞是PTEN -/-的，這意味著腫瘤抑制劑PTEN確實(shí)在這些細(xì)胞中缺乏，以致PI 3-激酶途徑被永久激活，導(dǎo)致細(xì)胞增加的轉(zhuǎn)移活性或行為，其表現(xiàn)為它們?cè)趍atrigel測(cè)定中的生長(zhǎng)模式。具有侵入生長(zhǎng)潛力的細(xì)胞在基底膜如matrigel基質(zhì)上顯示增強(qiáng)生長(zhǎng)。(Petersen，O.W.，Ronnov-Jessen，L.，Howlett，A.R.和Bissell，M.J.(1992)Interaction with basement membraneserves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal andmalignant human breast epithelial cells.Proc Natl Acad Sci USA，89，9064-9068.(AuchSternberger et al.，2002 Antisense & Nucleic acid drugdevelopment 12131-143)。
與其相關(guān)應(yīng)當(dāng)注意PC3細(xì)胞在matrigel上生長(zhǎng)并將這當(dāng)作接近體內(nèi)環(huán)境的模型系統(tǒng)，從中分離的RNA假定比獲自生長(zhǎng)在非-matrigel環(huán)境如常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞的任何制劑更接近原位情形或結(jié)果。
除了PC-3細(xì)胞，培養(yǎng)和試驗(yàn)其他細(xì)胞如PNT-1A、MCF-10A和HELA。使用各種生長(zhǎng)表面并且用認(rèn)為或者知道將影響PI 3-激酶途徑的化合物處理細(xì)胞。結(jié)果在圖7中的表中顯示。如從最上面兩個(gè)右欄中表達(dá)為“改變”的讀出可以得到的，在Affymetrix基因表達(dá)圖譜中得到的信號(hào)增加了但是除了施用于細(xì)胞的下面的化合物組合之外，即對(duì)于PC-3細(xì)胞，針對(duì)PI 3-激酶p110a和p110b的催化亞單位的錯(cuò)配GB和關(guān)于LY(為L(zhǎng)Y294002)的相同錯(cuò)配，對(duì)于PNT-1A細(xì)胞，被稱(chēng)為PTEN17和各自錯(cuò)配的反義分子，和對(duì)于HELA細(xì)胞，分別47h和72加96h后Tam和DMSO的組合。已經(jīng)描述了表達(dá)組成性活性PI 3—激酶——Mp110*ER——的可誘導(dǎo)形式的穩(wěn)定細(xì)胞系(Klippel等人，1998；Sternberger等人，2002)。用如前面描述的DMSO中的200nM誘導(dǎo)劑4-OH他莫西芬(Tam)刺激生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞庫(kù)。
實(shí)施例4篩選針對(duì)PRF1的最優(yōu)反義寡核苷酸為了篩選針對(duì)PRF1的最優(yōu)反義寡核苷酸，在PRF1的總mRNA序列內(nèi)選擇8種GeneBlocs。
如所述用不同的GeneBloc濃度轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，使用Taqman測(cè)定在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)測(cè)定mRNA水平，利用300nM NM_019058特異正向和反向引物和100nM探針和40nM正向和反向引物和100nM人β-肌動(dòng)蛋白探針確定mRNA水平。
在圖4中描繪了該方法的結(jié)果，該方法在此處也稱(chēng)為初級(jí)GeneBlock篩選。從所得結(jié)果選擇GeneBlocs 70034和70044用于進(jìn)一步的研究。
關(guān)于在各種實(shí)施例中本文使用的GeneBloc，應(yīng)當(dāng)注意它們都是本文指定的第三代反義寡核苷酸，這意味著，從表1中也是明顯的，大寫(xiě)字母代表脫氧核苷核苷酸，其通過(guò)硫代磷酸酯而不是磷酸二酯鍵連接。
表1所用各種GeneBlocs、它們的別名、相對(duì)于靶核酸的錯(cuò)配和它們的序列和結(jié)構(gòu)特性的綜述
另外應(yīng)當(dāng)注意，考慮到以上反義寡核苷酸是GeneBlocs即第三代反義寡核苷酸的事實(shí)，以上的任何“t”實(shí)際上是“u”。
用于本發(fā)明的各種實(shí)例和實(shí)施方案中的其他反義分子可以從指出其名字，即反義分子的內(nèi)部參考、它們的序列和該序列的特征的表2得到。這些反義分子是GeneBlocs，即第三代反義寡核苷酸。下劃線表示相對(duì)于靶序列的錯(cuò)配。
表2所用的其他GeneBlocs概述PTEN48guccuuuCCCAGCTTTacagugaPTEN52cuggaucAGAGTCAGTggugucaPTEN53ucuccuuTTGTTTCTGcuaacgaPTEN57ugccacuGGTCTGTAAuccaggtmmPTEN52 cuggaugAGACTGAGTgcugucammPTEN53 ucucauuTTCTTTGTGcucacgap110α79 acuccaaAGCCTCTTGcucaguup110α82 uaccacaCTGCTGAACcagucaap110β88 caaauucCAGTGGTTCauuccaap110β93 ggcuaacTTCATCTTCcuucccammp110α79acugcaaACCCTGTTGcucacuummp110β93ggcuaagTTCTTCATCcuugccaPTEN17cccuuuCCAGCTTTAcagugammPTEN17 ccguuuGCACCTTTAgagugaHIF1α66 gguaguGGTGGCATTagcagummHIF1α66gguagaGGTGCCAATugcaguHIF1α67 ugacucCTTTTCCTGcucugummHIF1α67ugacucCTTTTCCTGcucuguAKT1-GB gucuugATGTACTCCccucgumm-AKT1 guguugATCTAGTCCccuccuAKT2-GB uccuugTACCCAATGaaggagmm-AKT2 ucguugTAGCCAATCaacgag
實(shí)施例5選擇性剔除PRF1為了證明PRF1是PI 3-激酶途徑適合的下游藥靶，將獲自實(shí)施例4的兩個(gè)特別有利的GeneBlocs即70044和70043，用于基于matrigel的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。將Matrigel生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)當(dāng)作顯示各個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和遷移行為的替代模型。將更匯合的細(xì)胞生長(zhǎng)當(dāng)作它們的轉(zhuǎn)移和遷移行為增加的指示，這允許細(xì)胞擴(kuò)展到matrigel提供的三維結(jié)構(gòu)上。該實(shí)施例的結(jié)果在圖5中描繪。
如所述轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞并接種在matrigel上，監(jiān)視生長(zhǎng)。從接種在matrigel上的等份細(xì)胞中分離mRNA，并使用Taqman測(cè)定分析(左圖)。將PRF1(NM_019058)特異的mRNA對(duì)內(nèi)源p110αmRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。將PTEN特異的GeneBloc用作PTEN-/-PC-3細(xì)胞中的陰性對(duì)照，將P110β特異的GeneBloc用作胞外基質(zhì)中生長(zhǎng)的陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)分別比較PRF1特異的GeneBlocs 70043和70044和它們對(duì)應(yīng)的錯(cuò)配寡核苷酸70168和70169處理的細(xì)胞的生長(zhǎng)，顯示特異的生長(zhǎng)抑制。
從圖5A和圖5B可以看出兩種優(yōu)選的GeneBlocs，即70043和70044導(dǎo)致PRF1的mRNA的顯著剔除，其中該結(jié)果對(duì)應(yīng)于從matrigel生長(zhǎng)測(cè)定法中得到的結(jié)果。y軸代表按照Applied Biosystems的使用說(shuō)明通過(guò)DCt方法確定的mRNA的量。
實(shí)施例6針對(duì)PRF1的多克隆抗體的產(chǎn)生和特異性使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生了針對(duì)PRF1的多克隆抗體。試驗(yàn)了這樣得到的多克隆抗體對(duì)PRF1的特異性。為此，生產(chǎn)了用PRF1特異反義分子，更具體地基因封閉物，或者其錯(cuò)配處理的PC-3細(xì)胞的細(xì)胞裂解物和用重組HA-標(biāo)記的PRF1的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡使用多克隆抗體分析裂解物，結(jié)果在圖8A中描繪。
從圖8A可以得到用對(duì)此處公開(kāi)的核酸序列特異的基因封閉物號(hào)70043(GB43，見(jiàn)表1)處理的PC-3細(xì)胞表現(xiàn)出所表達(dá)的PRF1-蛋白質(zhì)的明顯減少，其中PI 3-激酶仍然被廣泛表達(dá)，如通過(guò)p110α和p85特異抗體所證明的。另一種反義分子即GB44，其也是針對(duì)PRF1設(shè)計(jì)的，該反義分子也導(dǎo)致PRF1蛋白的表達(dá)的顯著下降。再次，對(duì)于如GB43、MM43的錯(cuò)配的錯(cuò)配分子，在細(xì)胞中PRF1蛋白被顯著表達(dá)。用重組HA-標(biāo)記的PRF1的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解物顯示出兩條帶，一條是HA-標(biāo)記的PRF1，另一條是內(nèi)源性PRF1。
這些結(jié)果證實(shí)該多克隆抗體表現(xiàn)出對(duì)PRF1的特異性，從而分別是監(jiān)控PRF1的存在和不存在的有價(jià)值的工具。
實(shí)施例7對(duì)前列腺腫瘤組織中的PRF1的免疫染色將在實(shí)施例6中描述了其產(chǎn)生和表征的抗體用于人前列腺腫瘤組織的染色。使用多克隆血清1∶1000稀釋液，可以清楚地顯色蛋白質(zhì)水平上PRF1的表達(dá)，如圖8B所描繪，其中左邊的照片描繪了使用實(shí)施例6中描述的多克隆抗體的染色，而右邊的照片描繪了使用預(yù)免疫血清的前列腺腫瘤染色的切片。
實(shí)施例8PRF1蛋白質(zhì)表達(dá)依賴(lài)于PI 3-激酶途徑的各種成員為了闡明PRF1是PI 3-激酶途徑和HIF1α途徑的下游靶標(biāo)，實(shí)施了各種實(shí)驗(yàn)，其中已知所用的化合物對(duì)各自途徑的各種成分特異并研究了RPF1蛋白質(zhì)水平對(duì)這些化合物的影響。
a)PI 3-激酶活性對(duì)PRF1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響為了研究PI 3-激酶活性對(duì)PRF1蛋白質(zhì)表達(dá)是否有影響，將PC-3細(xì)胞用LY294002或者作為對(duì)照的DMSO處理。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析用多克隆抗體作為PRF1蛋白的檢測(cè)方法進(jìn)行分析。除了PRF1蛋白質(zhì)，還使用各自特異抗體監(jiān)視Akt和磷酸化Akt(P*Akt)的表達(dá)。此外，監(jiān)視p110α和p85的表達(dá)。
結(jié)果在圖9A中描繪。
分別72和96小時(shí)后，在DMSO處理的細(xì)胞中僅可以檢測(cè)到PRF1-蛋白。在LY294002的影響下，分別由Akt和磷酸化Akt組成的級(jí)聯(lián)，和PRF1蛋白被下調(diào)。
使用相同的標(biāo)記物，用反義分子，即特異抑制PI 3-激酶且被稱(chēng)為p110β-GB 88的GeneBloc(GB)處理細(xì)胞。
結(jié)果在圖9B中顯示。
從第三和第五個(gè)泳道可以得到，針對(duì)催化活性亞單位p110β的GeneBloc具有類(lèi)似于公知的PI 3-K抑制劑LY294002的效果，這證明PRF1是下游靶標(biāo)，其蛋白質(zhì)表達(dá)受PI 3-激酶的影響。針對(duì)p110α的反義分子或者錯(cuò)配反義分子或者DMSO對(duì)于蛋白質(zhì)水平上PRF1的表達(dá)沒(méi)有任何影響。
b)Akt和HIF1α對(duì)PRF1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響為了研究PRF1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)是否也依賴(lài)于Akt(PKB)活性和HIF1α活性，將PC-3細(xì)胞用Akt特異反義分子處理。更具體地，使用兩種反義分子——稱(chēng)為Akt1-GB和Akt2-分子——得到的讀出和關(guān)于圖9中所討論的相同，其中，附加地，使用通過(guò)商業(yè)途徑可得到的蛋白質(zhì)G-純化的多克隆抗體(R&DSystems，批號(hào)IUGO13071)監(jiān)視HIF1α蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果在圖10A中顯示。從圖10A可看出，用該反義分子處理72小時(shí)后，用Akt2 GeneBloc處理的細(xì)胞和用Akt1 GeneBloc與Akt2 GeneBloc一起處理的那些細(xì)胞表現(xiàn)出在PRF1蛋白質(zhì)水平上的降低，這表明Akt1和Akt2分別表現(xiàn)出對(duì)PRF1蛋白質(zhì)表達(dá)水平上的一定抑制作用。
使用用于監(jiān)視的相同標(biāo)記物實(shí)施相同的實(shí)驗(yàn)，除了使用生長(zhǎng)在缺氧條件的細(xì)胞(通過(guò)用CoCl2處理細(xì)胞實(shí)現(xiàn))進(jìn)行Akt和P*-Akt以外。使用反義分子的兩種不同形式，即HIF1α-GB66和HIF1α-GB67，它們各自的錯(cuò)配用作對(duì)照。該GeneBlocs顯著降低HIF1α在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，其反過(guò)來(lái)降低了PRF1蛋白質(zhì)的表達(dá)。用GeneBlocs處理72小時(shí)和用CoCl2處理24小時(shí)后得到該結(jié)果。
從該結(jié)果可以得到PRF1的蛋白質(zhì)水平依賴(lài)于Akt和HIF1α的活性，盡管HIF1α對(duì)PRF1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)的影響似乎比Akt的更顯著。
這些結(jié)果證明PRF1是PI 3-激酶和HIF1α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)物。關(guān)于途徑缺失所給出的數(shù)據(jù)表明PRF1依賴(lài)于缺氧生長(zhǎng)條件下的HIF1α活性。此外，似乎PRF1表達(dá)還依賴(lài)于Akt但是不依賴(lài)于HIF1α。該調(diào)節(jié)關(guān)系在圖12中闡述。
實(shí)施例9HIF1α蛋白和PRF1蛋白被抑制的細(xì)胞的表型分析本實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)的目的是研究分別研究表現(xiàn)出HIF1α和PRF1在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)抑制的細(xì)胞的表型變化。
細(xì)胞生長(zhǎng)于matrigel表面并用反義分子(geneblocs)和各種對(duì)照，在上面實(shí)驗(yàn)中描述的條件下處理。
結(jié)果在圖11A和圖11B中描繪，其中每一行由圖11A和圖11B的一部分組成，圖11A和圖11B將一起被討論。
圖11A顯示了生長(zhǎng)在matrigel表面并用各自反義分子處理的細(xì)胞的一系列照片，而圖11B顯示了對(duì)從matrigel表面得到的細(xì)胞實(shí)施的蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果。Blot的一個(gè)泳道代表相應(yīng)照片中所示細(xì)胞的細(xì)胞裂解物。作為讀出，p110α和p85作為上樣對(duì)照顯示，所研究的PI-3K途徑的組分，即AKT，作為P*AKT，HIF1α和PRF1被監(jiān)視。
未處理的細(xì)胞在matrigel測(cè)定法中表現(xiàn)出正常腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)模式。當(dāng)使用針對(duì)p110β的反義分子的錯(cuò)配時(shí)，觀察到類(lèi)似表型。使用針對(duì)PTEN(其反過(guò)來(lái)抑制PI-3K)的反義分子，表現(xiàn)出不被該腫瘤抑制劑影響的細(xì)胞系的表型(圖11A，第一行)。如所預(yù)期的，在這些條件下P*-AKT被顯著減少并且表示功能p110β剔除的讀出(圖11B，第一行)。當(dāng)使用針對(duì)HIF1α的反義分子時(shí)，觀察到與使用p110β的剔除類(lèi)似的由于功能喪失導(dǎo)致的表型，錯(cuò)配不導(dǎo)致表型變化(圖11A，第二行)。蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了該結(jié)果并且表明兩種HIF1α特異反義分子都導(dǎo)致HIF1α蛋白質(zhì)水平降低(圖11B，第二行)。最后，使用PRF1特異的反義分子再次觀察到功能表型的同樣喪失(圖11A的第三行的圖1和3)，同時(shí)在蛋白質(zhì)印跡分析中PRF1蛋白質(zhì)表達(dá)也減少(圖11B，第三行)。
總之，這些結(jié)果證明PRF1也是PI 3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)水平上的一種下游效應(yīng)物。而且，PRF1依賴(lài)于缺氧生長(zhǎng)條件下HIF1α活性。此外，似乎PRF1表達(dá)還依賴(lài)于AKT而不依賴(lài)于HIF1α。
實(shí)施例10通過(guò)特異RNA干涉抑制前列腺腫瘤生長(zhǎng)該實(shí)驗(yàn)是小干涉RNA(siRNA)的成功設(shè)計(jì)的一個(gè)實(shí)例，這些小干涉RNA使得下游藥物靶標(biāo)PRF1被特異處理。通過(guò)啟動(dòng)子(u6+2)驅(qū)動(dòng)的靶標(biāo)特異序列的表達(dá)產(chǎn)生siRNA分子。
siRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)PCR，使用合成的寡核苷酸，產(chǎn)生pol III啟動(dòng)子盒U6+2并將其克隆到pUC-衍生的載體的EcoRI/XhoI限制位點(diǎn)。使用非回文限制酶(具有5’突出端TTTT和3’突出端GGCA的BsmBI)克隆特異siRNA插入片段。通過(guò)將兩種合成的寡核苷酸與5’CCGT和3’AAAA突出端退火產(chǎn)生插入片段。對(duì)于PRF1特異的siRNA，含有啟動(dòng)子、將要表達(dá)的siRNA和終止子序列的表達(dá)盒如下5‘gaattcctatttcccatgattccttcatatttgcatatttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatata tcttgggaaaggacgaaacacc gggagactagaggcaggagcaaaaaaaaaaa ctcctgcctctagtctccac tttttctcgag 3‘(SEQ ID NO.17)。
U6+2合成啟動(dòng)子和PRF1特異siRNA為粗體(EcoRI；XhoI)。
該表達(dá)盒可以，在理論上，被克隆到任何表達(dá)載體。
SiRNA表達(dá)構(gòu)建體的基本設(shè)計(jì)也在圖6A中描繪，從圖6A可以得到，如此設(shè)計(jì)siRNAs是為了形成細(xì)胞內(nèi)環(huán)，其通過(guò)多聚-A-片段產(chǎn)生。圖6B顯示了用于本實(shí)施例中的各種siRNA構(gòu)建體，即用于p110β(SEQ ID NO.14)、p110α(SEQ ID NO.15)和PRF1的mRNA的構(gòu)建體。
各種siRNA構(gòu)建體如針對(duì)p110α、p110β和PTEN的siRNA構(gòu)建體和PRF1特異siRNA被克隆到同一載體構(gòu)建體中。使用EffecteneTM(Qiagen，Hilden，德國(guó))，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明，用6μg各自siRNA表達(dá)載體或EGFP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞(1×106個(gè)細(xì)胞)。p110α、p110β、或PRF1的表達(dá)siRNA或者作為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)對(duì)照的表達(dá)全長(zhǎng)EGFP被轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并稀釋和再次接種于含有500μg/ml Geneticin的150mm皿中。每天用500μg/ml Geneticin替換培養(yǎng)基并且轉(zhuǎn)染后7天用含有600μg/ml Geneticin的培養(yǎng)基替換。將合并的抗性細(xì)胞擴(kuò)大并收獲，確定細(xì)胞數(shù)并準(zhǔn)備用于如所描述的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果在圖6中顯示，其中更具體地在圖6C中顯示了接種后56天原代前列腺腫瘤的體積(mm3)，在圖6D中顯示了接種后56天總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的體積(mm3)。
從所述圖中可以得出，通過(guò)使用PRF1特異的siRNA可以顯著抑制前列腺腫瘤的生長(zhǎng)。抑制程度類(lèi)似于針對(duì)p110β的siRNA構(gòu)建體。然而，將p110β和PRF1的位置分別置于PI 3-激酶途徑，應(yīng)該理解對(duì)PRF1特異的siRNA允許更特異的處理，從而與處理p110β相比，PI 3-激酶途徑和與其相關(guān)的過(guò)程的一部分或分支的調(diào)節(jié)?？紤]到總淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也得到相同結(jié)果，從而那里的效果較不明顯。
在本說(shuō)明書(shū)、序列表和權(quán)利要求書(shū)和/或附圖中公開(kāi)的本發(fā)明的特征可以單獨(dú)和以任何組合作為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的各種形式的材料。
序列表<110>atugen AG<120>新轉(zhuǎn)移因子及其應(yīng)用<130>A 19011 PCT<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>232<212>PRT<213>人類(lèi)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>NMF的氨基酸序列<400>1Met Pro Ser Leu Trp Asp Arg Phe Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser1 5 10 15Pro Ser Ser Leu Pro Arg Thr Pro Thr Pro Asp Arg Pro Pro Arg Ser20 25 30Ala Trp Gly Ser Ala Thr Arg Glu Glu Gly Phe Asp Arg Ser Thr Ser35 40 45Leu Glu Ser Ser Asp Cys Glu Ser Leu Asp Ser Ser Asn Ser Gly Phe50 55 60Gly Pro Glu Glu Asp Thr Ala Tyr Leu Asp Gly Val Ser Leu Pro Asp65 70 75 80Phe Glu Leu Leu Ser Asp Pro Glu Asp Glu His Leu Cys Ala Asn Leu85 90 95Met Gln Leu Leu Gln Glu Ser Leu Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ser Arg100 105 110Arg Pro Ala Arg Leu Leu Met Pro Ser Gln Leu Val Ser Gln Val Gly115 120 125Lys Glu Leu Leu Arg Leu Ala Tyr Ser Glu Pro Cys Gly Leu Arg Gly130 135 140Ala Leu Leu Asp Val Cys Val Glu Gln Gly Lys Ser Cys His Ser Val145 150 155 160
Gly Gln Leu Ala Leu Asp Pro Ser Leu Val Pro Thr Phe Gln Leu Thr165 170 175Leu Val Leu Arg Leu Asp Ser Arg Leu Trp Pro Lys Ile Gln Gly Leu180 185 190Phe Ser Ser Ala Asn Ser Pro Phe Leu Pro Gly Phe Ser Gln Ser Leu195 200 205Thr Leu Ser Thr Gly Phe Arg Val Ile Lys Lys Lys Leu Tyr Ser Ser210 215 220Glu Gln Leu Leu Ile Glu Glu Cys225 230<210>2<211>1760<212>DNA<213>人類(lèi)<400>2gcagcaggcc aagggggagg tgcgagcgtg gacctgggac gggtctgggc ggctctcggt 60ggttggcacg ggttcgcaca cccattcaag cggcaggacg cacttgtctt agcagttctc120gctgaccgcg ctagctgcgg cttctacgct ccggcactct gagttcatca gcaaacgccc180tggcgtctgt cctcaccatg cctagccttt gggaccgctt ctcgtcgtcg tccacctcct240cttcgccctc gtccttgccc cgaactccca ccccagatcg gccgccgcgc tcagcctggg300ggtcggcgac ccgggaggag gggtttgacc gctccacgag cctggagagc tcggactgcg360agtccctgga cagcagcaac agtggcttcg ggccggagga agacacggct tacctggatg420gggtgtcgtt gcccgacttc gagctgctca gtgaccctga ggatgaacac ttgtgtgcca480acctgatgca gctgctgcag gagagcctgg cccaggcgcg gctgggctct cgacgccctg540cgcgcctgct gatgcctagc cagttggtaa gccaggtggg caaagaacta ctgcgcctgg600cctacagcga gccgtgcggc ctgcgggggg cgctgctgga cgtctgcgtg gagcagggca660agagctgcca cagcgtgggc cagctggcac tcgaccccag cctggtgccc accttccagc720tgaccctcgt gctgcgcctg gactcacgac tctggcccaa gatccagggg ctgtttagct780ccgccaactc tcccttcctc cctggcttca gccagtccct gacgctgagc actggcttcc840gagtcatcaa gaagaagctg tacagctcgg aacagctgct cattgaggag tgttgaactt900caacctgagg gggccgacag tgccctccaa gacagagacg actgaacttt tggggtggag960actagaggca ggagctgagg gactgattcc agtggttgga aaactgaggc agccacctaa 1020
ggtggaggtg ggggaatagt gtttcccagg aagctcattg agttgtgtgc gggtggctgt1080gcattgggga cacatacccc tcagtactgt agcatggaac aaaggcttag gggccaacaa1140ggcttccagc tggatgtgtg tgtagcatgt accttattat ttttgttact gacagttaac1200agtggtgtga catccagaga gcagctgggc tgctcccgcc ccagcctggc ccagggtgaa1260ggaagaggca cgtgctcctc agagcagccg gagggagggg ggaggtcgga ggtcgtggag1320gtggtttgtg tatcttactg gtctgaaggg accaagtgtg tttgttgttt gttttgtatc1380ttgtttttct gatcggagca tcactactga cctgttgtag gcagctatct tacagacgca1440tgaatgtaag agtaggaagg ggtgggtgtc agggatcact tgggatcttt gacacttgaa1500aaattacacc tggcagctgc gtttaagcct tcccccatcg tgtactgcag agttgagctg1560gcaggggagg ggctgagagg gtgggggctg gaacccctcc ccgggaggag tgccatctgg1620gtcttccatc tagaactgtt tacatgaaga taagatactc actgttcatg aatacacttg1680atgttcaagt attaa9acct atgcaatatt ttttactttt ctaataaaca tgtttgttaa1740aacaaaaaaa aaaaaaaaaa1760<210>3<211>699<212>DNA<213>人類(lèi)<400>3atgcctagcc tttgggaccg cttctcgtcg tcgtccacct cctcttcgcc ctcgtccttg 60ccccgaactc ccaccccaga tcggccgccg cgctcagcct gggggtcggc gacccgggag 120gaggggtttg accgctccac gagcctggag agctcggact gcgagtccct ggaca9cagc 180aacagtggct tcgggccgga ggaagacacg gcttacctgg atg9ggtgtc gttgcccgac 240ttcgagctgc tcagtgaccc tgaggatgaa cacttgtgtg ccaacctgat gcagctgctg 300ca9gagagcc tggcccaggc gcggctgggc tctcgacgcc ctgcgcgcct gctgatgcct 360agccagttgg taagccaggt gggcaaa9aa ctactgcgcc tggcctacag cgagccgtgc 420ggcctgcggg gggcgctgct ggacgtctgc gtggagcagg gcaagagctg ccacagcgtg 480ggccagctgg cactcgaccc cagcctggtg cccaccttcc agctgaccct cgtgctgcgc 540ctggactcac gactctggcc caagatccag gggctgttta gctccgccaa ctctcccttc 600ctccctggct tcagccagtc cctgacgctg agcactggct tccgagtcat caa9aagaag 660ctgtacagct cggaacagct gctcattgag gagtgttga699<210>4<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>4gcucaactct gcagtacacg a 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
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<223>反義寡核苷酸<220>
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<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>7cccaaaagtt cagtcgucuc u 21<210>8<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
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<223>反義寡核苷酸<220>
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<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
<221>misc_feature<222>(7)..(15)<223>通過(guò)硫代磷酸酯鍵連接的DNA<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>12ccgaaaagaa cagtgcucuc u 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6)<223>RNA<220>
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<221>misc_feature<222>(16)..(21)<223>RNA<400>13gcucguccct gtagtgucca c 21<210>14<211>54
<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA<400>14gggaaugaac cacuggaaua gcaaaaaaaa aaaagcuucc agugguucau uccc 54<210>15<211>54<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA<400>15acugagcaag aggcuuugga gaaaaaaaaa aaacuccaaa gccucuugcu cagu 54<210>16<211>54<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>siRNA<400>16guggagacta gaggcaggag caaaaaaaaa aaagcuccug ccucuagucu ccac 54<210>17<211>187<212>DNA<213>人工<400>17gaattcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatattt ttaaaatgga ctatcatatg 60cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttggg aaaggacgaa120acaccgggag actagaggca ggagcaaaaa aaaaaactcc tgcctctagt ctccactttt180tctcgag 18權(quán)利要求
1.編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸，其中所述過(guò)程是PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，該因子是含有根據(jù)SEQ ID.NO.1的氨基酸序列的多肽或者具有根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi9506687或NP_061931，優(yōu)選NP_061931.1的序列的多肽。
2.編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸，其中所述過(guò)程是PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該核酸含有根據(jù)SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的核酸序列或者根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi9506686或NM_019058，優(yōu)選NM_019058.1的核酸序列。
3.編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸，其中所述過(guò)程是PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中如果不是遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，該核酸將和與按照權(quán)利要求2的核酸或其一部分基本上互補(bǔ)的核酸雜交。
4.編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸，其中所述過(guò)程是PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該核酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下和與按照權(quán)利要求2的核酸或其一部分基本上互補(bǔ)的核酸雜交。
5.含有根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。
6.含有根據(jù)權(quán)利要求5的載體的細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
7.與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子，其中所述過(guò)程是PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該因子是含有根據(jù)SEQ ID.NO.1的氨基酸序列的多肽或者具有根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 9506687或NP_061931，優(yōu)選NP_061931.1的序列的多肽。
8.與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子，其中所述過(guò)程是PI 3-激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包含葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，其中該因子被根據(jù)權(quán)利要求1到4中任何一項(xiàng)的核酸編碼。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的因子，其中所述因子是所述過(guò)程的標(biāo)記物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)的因子，其中所述因子是轉(zhuǎn)化細(xì)胞、尤其是侵入性細(xì)胞的標(biāo)記物。
11.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或者其片段或衍生物作為PI 3-激酶途徑的下游靶標(biāo)或者下游標(biāo)記物、優(yōu)選作為PI 3-激酶途徑的下游藥物靶標(biāo)的應(yīng)用。
12.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或者其片段或衍生物的應(yīng)用，用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于疾病診斷的診斷劑，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸或者其片段或衍生物的應(yīng)用，用于治療和/或預(yù)防疾病和/或生產(chǎn)用于疾病診斷的診斷劑，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13之一的應(yīng)用，其中所述疾病其特征在于與所述疾病有關(guān)的細(xì)胞缺乏PTEN活性，或表現(xiàn)出PI 3-激酶途徑的超活化，或表現(xiàn)出增加的侵入性行為，或是腫瘤細(xì)胞，優(yōu)選晚期腫瘤細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病是晚期腫瘤。
16.根據(jù)權(quán)利要求11至15任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述疾病是與PI 3-激酶途徑的分支有關(guān)的疾病，該分支與葡萄糖代謝有關(guān)，優(yōu)選所述疾病是糖尿病。
17.一種篩選用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑的方法，其中該疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組，該方法包括以下步驟a)提供候選化合物，b)提供根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子的表達(dá)系統(tǒng)和/或一種系統(tǒng)，優(yōu)選檢測(cè)根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子的活性的活性系統(tǒng)；c)將候選化合物與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子的表達(dá)系統(tǒng)和/或該系統(tǒng)，優(yōu)選檢測(cè)根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子的活性的活性系統(tǒng)接觸；d)確定在候選化合物的影響下根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子的表達(dá)和/或活性是否變化。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其特征在于候選化合物包含在化合物文庫(kù)中。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其特征在于所述候選化合物選自包含肽，蛋白質(zhì)，抗體，抗促成素，功能核酸，天然化合物和小分子的各類(lèi)化合物的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于所述功能核酸選自包含適體，適配酶，核酶，spiegelmer，反義寡核苷酸和siRNA的組。
21.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或者該因子的部分或衍生物和/或根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸或者該核酸的部分或衍生物的應(yīng)用，其用作靶標(biāo)分子以開(kāi)發(fā)和/或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的應(yīng)用，其特征在于所述藥物和/或診斷劑含有一種試劑，其選自包含抗體、肽、抗促成素、小分子、反義分子、適體、spiegelmer和RNAi分子的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，其特征在于所述試劑與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物相互作用。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，其特征在于所述試劑與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸或其部分或衍生物，尤其與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子的mRNA、基因組核酸或cDNA相互作用。
25.與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物相互作用的多肽的應(yīng)用，用于開(kāi)發(fā)或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的應(yīng)用，其特征在于所述多肽選自包含針對(duì)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的抗體、和結(jié)合根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或者其部分或衍生物的多肽的組。
27.與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或者該因子的部分或衍生物相互作用的核酸的應(yīng)用，用于開(kāi)發(fā)或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的應(yīng)用，其特征在于所述核酸選自包含適體和spiegelmer的組。
29.與編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的應(yīng)用，用于開(kāi)發(fā)或生產(chǎn)用于治療和/或預(yù)防疾病的藥物和/或生產(chǎn)用于診斷疾病的診斷劑，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的應(yīng)用，其特征在于所述相互作用的核酸是反義寡核苷酸、核酶和/或siRNA。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的應(yīng)用，其特征在于編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸是cDNA、mRNA或hnRNA。
32.藥物組合物，含有至少一種試劑和至少一種藥用載體，所述試劑選自根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物、與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物或者與編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子、對(duì)根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物特異的抗體、與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物相互作用的多肽、根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的核酸、編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸、與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物相互作用的核酸和與編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸，所述組合物優(yōu)選用于預(yù)防和/或治療疾病，其中所述疾病選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組。
33.用于表征選自包含癌、轉(zhuǎn)移癌、糖尿病、傷口愈合、和與PI 3-激酶途徑有關(guān)的任何病理學(xué)病癥的組的疾病或病癥的試劑盒，該試劑盒含有至少一種試劑和任選至少一種其他化合物，所述試劑選自根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物、對(duì)根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物特異的抗體、與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物相互作用的多肽、與根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的核酸和/或與編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽、與根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物相互作用的核酸、與根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的核酸和/或與編碼根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的因子或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼與一種生物過(guò)程有關(guān)的因子的核酸，其中該過(guò)程是PI 3－激酶途徑調(diào)節(jié)的過(guò)程，優(yōu)選選自包括葡萄糖代謝、氨基酸和葡萄糖缺失過(guò)程、糖尿病、傷口愈合、脅迫應(yīng)答、凋亡、轉(zhuǎn)移、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞遷移、胞外基質(zhì)中細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和胞外基質(zhì)中細(xì)胞生長(zhǎng)的組的過(guò)程，該因子是含有根據(jù)SEQ ID.NO.1的氨基酸序列的多肽或者具有根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)gi 9506687或NP_061931、優(yōu)選NP_061931.1的序列的多肽。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1705746SQ200380101645
公開(kāi)日2005年12月7日 申請(qǐng)日期2003年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者A·克利佩爾-吉澤, J·考夫曼, R·施瓦策爾 申請(qǐng)人:阿圖根股份公司