專利名稱：修飾過(guò)的因子vii的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的治療方法和修飾形式的因子Ⅶ的新用途，修飾過(guò)的因子Ⅶ抑制血栓形成，維持或改善血管開放度，改善局部心肌血流和調(diào)節(jié)在缺血后再灌注過(guò)程中的心肌損傷。
背景技術(shù)：
血液凝固是包含一系列不同血液成分或因子的復(fù)雜反應(yīng)，最終產(chǎn)生血纖蛋白塊。一般，血液中參與稱為凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的成分是酶原，一種能通過(guò)一種激活物(自身為活化的凝血因子)作用轉(zhuǎn)變成蛋白水解酶的酶學(xué)無(wú)活性的蛋白質(zhì)。已經(jīng)歷這種轉(zhuǎn)變的凝血因子一般稱為“活性因子”，并添加一個(gè)小寫“a”命名(如，因子Ⅶa)。
需要活化的因子Ⅹ(“Ⅹ a”)以轉(zhuǎn)變凝血酶原為凝血酶，其再將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，作為形成纖維蛋白塊的最后階段。有兩個(gè)系統(tǒng)或途徑促進(jìn)因子Ⅹ的激活?！皟?nèi)源性途徑”指通過(guò)利用僅在血漿中存在的因子導(dǎo)致凝血酶形成的那些反應(yīng)。一系列蛋白酶介導(dǎo)的反應(yīng)最終產(chǎn)生了因子Ⅸa，其與因子Ⅷa聯(lián)合，切割因子X(jué)形成Ⅹ a。在血液凝固的“外源性途徑”中，同樣的蛋白水解由因子Ⅶa及其輔因子(組織因子)進(jìn)行。組織因子是一種膜結(jié)合蛋白，一般不在血漿中循環(huán)。然而，一旦血管破裂，其可在Ca2+和磷脂存在下與因子Ⅶa復(fù)合以催化因子Ⅹ或因子Ⅸ的激活(Nemerson和Gentry，生物化學(xué)(Biochem.)25:4020-4033(1986))。雖然在止血中兩種凝血途徑的相對(duì)重要性不清楚，近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)因子Ⅶ和組織因子在調(diào)節(jié)血液凝固中起關(guān)鍵作用。
因子Ⅶ是以單鏈酶原形式在血漿中循環(huán)的痕量血漿糖蛋白。此酶原無(wú)催化活性(Williams等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)264:7536-7543(1989)；Rao等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci),85:6687-6691(1988))。單鏈因子Ⅷ可以在體外通過(guò)因子Ⅹa，因子Ⅻa，因子Ⅸa或凝血酶轉(zhuǎn)變成雙鏈因子Ⅷa。認(rèn)為因子Ⅹa是因子Ⅶ的主要生理激活劑。象其它幾種參與止血的血漿蛋白一樣，因子Ⅶ的活性依賴維生素K，這是在蛋白質(zhì)氨基端成簇的多谷氨酸殘基的g-羧基化所需的。這些g-羧基化的谷氨酸為因子Ⅶ與磷脂的金屬關(guān)聯(lián)的相互作用所需。
酶原因子Ⅷ到活化的雙鏈分子的轉(zhuǎn)變通過(guò)位于大約分子中部的內(nèi)肽鍵的切割來(lái)完成。人因子Ⅶ中，活性切割位點(diǎn)在Arg152-Ile153(Hagen等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，83:2412-2416(1986)；Thim等人，生物化學(xué)(Biochem.)27:7785-7793(1988)，此處引用兩篇文獻(xiàn)作為參考)。牛因子Ⅶ通過(guò)在類似的Arg152-Ile153鍵的切割被激活(Takeya等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.chem.)263:14868-14877,1988)。在組織因子、磷脂和鈣離子存在下，雙鏈因子Ⅶa通過(guò)有限蛋白水解迅速激活因子Ⅹ或因子Ⅸ。
經(jīng)常需要選擇性阻斷病人的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。例如，可以在腎透析或治療深靜脈栓塞、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)以及其它醫(yī)學(xué)疾病過(guò)程中使用如肝素、香豆素、香豆素衍生物、二氫化茚二酮衍生物等的抗凝藥。例如，肝素處理或檸檬酸離子的體外處理(美國(guó)專利4,500,309)可用于透析以防止在治療過(guò)程中的凝血。肝素也用于防止手術(shù)中病人的深靜脈血栓形成。
然而，用肝素和其它抗凝藥的治療有不期望的副作用?？傻玫目鼓幰话愕刈饔帽榧叭恚皇翘禺愋宰饔糜谀恢?。例如，肝素可引起嚴(yán)重出血。此外，由于半衰期約80分鐘，肝素被從血中迅速清除，需要頻繁給藥。因?yàn)楦嗡匾钥鼓涪?ATⅢ)的輔助因子起作用，而在DIC治療中ATⅢ被迅速地耗貧，維持肝素的合適劑量經(jīng)常是困難的，需要連續(xù)監(jiān)視ATⅢ和肝素水平。如果ATⅢ極度貧乏肝素也無(wú)作用。此外，肝素的長(zhǎng)期使用也可以增加血小板凝結(jié)且減少血小板數(shù)量，且參與骨質(zhì)疏松的形成。二氫化茚二酮衍生物也可有毒副作用。
除了上述簡(jiǎn)單描述的抗凝藥之外，已發(fā)現(xiàn)幾種天然存在的蛋白質(zhì)有抗凝藥活性。例如，Reutelingsperger(美國(guó)專利No.4,736,018)從牛主動(dòng)脈和人臍靜動(dòng)脈中分離了抗凝蛋白質(zhì)。Maki等人(美國(guó)專利No.4,732,891)公開了人胎盤衍生的抗凝蛋白質(zhì)。此外，ATⅢ已被提議用作治療性抗凝藥(Schipper等人，柳葉刀(Lancet)1(8069):854-856(1978)；Jordan，美國(guó)專利No.4,386,025；Bock等人，美國(guó)專利No.4,517,294)。
血管壁中平滑肌細(xì)胞(SMC)的增殖是動(dòng)脈粥樣硬化中血管再造或應(yīng)答其它血管損傷之后血管損傷形成中的重要事件。例如，動(dòng)脈粥樣硬化的治療經(jīng)常包括用血管成形術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)或減少動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)疏通封閉的血管，或者用旁路移植，一些通過(guò)導(dǎo)管插入術(shù)(血管成形術(shù))將動(dòng)脈粥樣硬化斑壓縮或除去，通過(guò)切開(動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù))從動(dòng)脈壁剝離或通過(guò)天然或合成移植物分流的手術(shù)方法疏通封閉的血管。這些方法清除了血管內(nèi)皮，干擾下面的內(nèi)膜層，導(dǎo)致中層平滑肌細(xì)胞的死亡。此損傷之后的中層平滑肌細(xì)胞增生且移入內(nèi)膜，這典型地在損傷后的頭幾周內(nèi)最多六個(gè)月內(nèi)發(fā)生，且當(dāng)覆蓋在上面的內(nèi)皮層重建后停止。在人中，這些損傷由約20％細(xì)胞和80％胞外基質(zhì)組成。
在約30％或更多的用血管成形術(shù)、動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)或旁路移植治療的病人中，血栓和/或內(nèi)膜中平滑肌細(xì)胞增生引起血管再閉塞且經(jīng)常使重建手術(shù)失敗。這種手術(shù)后血管的關(guān)閉稱為“再狹窄”。
目前仍需要具有抗凝活性改善的物質(zhì)，其能以相對(duì)低的劑量給藥且不產(chǎn)生與傳統(tǒng)抗凝劑相關(guān)的不期望的副作用。本發(fā)明通過(guò)提供特異性作用于損傷位置的抗凝藥且進(jìn)一步提供了其他相關(guān)的便利來(lái)滿足這一需要。修飾過(guò)的因子Ⅶ分子給人施用治療包括血管內(nèi)凝血的各種情況特別有用。例如，雖然深靜脈血栓和肺栓塞可以用傳統(tǒng)抗凝藥治療，此處所述的修飾過(guò)的因子Ⅶ可用于在確定的如那些經(jīng)歷手術(shù)或有充血性心力衰竭的高危病人中防止血栓栓塞并發(fā)癥。此外，修飾過(guò)的因子Ⅶ可作為組織因子介導(dǎo)的凝血誘導(dǎo)的拮抗劑，阻止凝血酶的產(chǎn)生和隨后的纖維蛋白沉淀。同樣，修飾過(guò)的因子Ⅶ可用于抑制組織因子活性，導(dǎo)致如對(duì)血液凝固、血栓形成或血小板沉積的抑制。
修飾過(guò)的因子Ⅶ分子特別可用于由于急性血管損傷的內(nèi)膜增生或再狹窄的治療。急性血管損傷是那些與慢性血管損傷(如動(dòng)脈粥樣硬化)相反的迅速發(fā)生的(即數(shù)天至數(shù)月的)損傷。急性血管損傷常常由手術(shù)過(guò)程造成，如血管重建，其中使用了血管成形術(shù)，動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)，動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)，血管移植物置入等技術(shù)。增生也可以作為對(duì)如移植物置入或器官移植的延遲反應(yīng)而發(fā)生。由于修飾過(guò)的因子Ⅶ比肝素更有選擇性，一般地僅結(jié)合暴露于損傷位置的組織因子，且因?yàn)樾揎椷^(guò)的因子Ⅶ不破壞其它凝血蛋白，因此當(dāng)防止深靜脈栓塞的預(yù)防性使用時(shí)比肝素更有效且更不易引起出血并發(fā)癥。
冠狀動(dòng)脈疾病的最新進(jìn)展包括機(jī)械性介入的使用以清除或取代病因性斑塊物從而重建通過(guò)冠狀動(dòng)脈的足夠的血流。除了各種形式的機(jī)械性介入的使用，包括氣囊血管成形術(shù)、減少動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)、血管斯坦特固定模(Stent)的放置、激光治療或噴丸，這些技術(shù)的有效性仍受到治療后六個(gè)月內(nèi)約40％的再狹窄率的局限。
再狹窄被認(rèn)為是由生物過(guò)程的復(fù)雜相互作用造成的，包括血小板沉積和血栓形成，趨化因子和促分裂因子的釋放以及血管平滑肌細(xì)胞遷移和增生進(jìn)入擴(kuò)張的動(dòng)脈部分的內(nèi)膜。
對(duì)機(jī)械性損傷位置的血小板積累的抑制可限制人的再狹窄速率。血小板GpⅡb/Ⅲa的單克隆抗體的治療性使用可限制人的再狹窄水平(Califf等人，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Engl.J.Med.),330:956-961(1994)。該抗體可結(jié)合到血小板表面的GpⅡb/Ⅲa受體上因而抑制了血小板積累。此數(shù)據(jù)提示人冠狀動(dòng)脈中機(jī)械性損傷的位置血小板累積的抑制對(duì)發(fā)生最終治愈反應(yīng)有利。當(dāng)在急性血管損傷位置發(fā)生血小板積累時(shí)，這些位置的凝血酶的產(chǎn)生可能負(fù)責(zé)血小板的激活和其隨后的累積。
如后面的實(shí)施例所示，本發(fā)明修飾過(guò)的因子Ⅶ能與細(xì)胞表面的組織因子結(jié)合。例如，DEGR-因子Ⅶa以與野生型因子Ⅶa相同或更高的親和力與細(xì)胞表面組織因子結(jié)合。然而，DEGR-因子Ⅶa無(wú)酶活性，但其與組織因子結(jié)合且用作野生型因子Ⅶa的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，從而抑制外源性凝血途徑導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生的后續(xù)步驟。
修飾過(guò)的因子Ⅶ分子保持組織因子結(jié)合能力，其通過(guò)阻斷凝血酶產(chǎn)生以及后續(xù)纖維蛋白沉積來(lái)抑制血管損傷位置的血小板積累。
由于DEGR-因子Ⅶ阻斷凝血酶產(chǎn)生以及限制在急性血管損傷處血小板沉積的能力，保持組織因子結(jié)合活性但無(wú)因子Ⅶa酶活性的修飾過(guò)的因子Ⅶ分子可用于抑制血管再狹窄。
含有修飾過(guò)的因子Ⅶ的組合物當(dāng)配制成藥物組合物時(shí)在用于治療病人的方法中特別有用，其中向處于不同疾病狀態(tài)的個(gè)體施用這些修飾過(guò)的因子Ⅶ的組合物以治療與凝血相關(guān)的病狀。這種修飾過(guò)的因子Ⅶ分子能與組織因子結(jié)合但在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中只有很低的催化其它因子活化的能力，其具有較長(zhǎng)的血漿半衰期，因而與其它抗凝藥相比有相應(yīng)的較長(zhǎng)期的抗凝血活性。適于此組合物的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥是那些通常用抗凝藥治療的如深靜脈血栓，肺栓塞，中風(fēng)，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)，與革蘭氏陰性內(nèi)毒血癥相關(guān)的肺和腎中纖維蛋白沉積和心肌梗死。這些組合物可用于抑制機(jī)械性血管損傷之后發(fā)生的血管再狹窄，如由氣囊血管成形術(shù)，動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)，減少的動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)，斯坦特固定模放置，激光治療或rotablation造成的損傷，或在血管移植，斯坦特固定模，旁路移植或器官移植之后發(fā)生的損傷。這些組合物可因而用于抑制血小板沉積和相關(guān)的疾病。因此，一種抑制凝血、血管再狹窄或血小板沉積的方法，例如，包括以足有效抑制凝血、血管再狹窄或血小板沉積的量給病人施用含有修飾過(guò)的因子Ⅶ，如在其催化三聯(lián)體Ser344、Asp242和His193中至少有一種氨基酸替換的組合物。該方法也可用于治療個(gè)體中急性冠狀動(dòng)脈閉合(如急性心肌梗塞)，其包括與組織型纖維蛋白溶酶原激活劑或鏈激酶聯(lián)合使用修飾過(guò)的因子Ⅶ(包括DEGR-因子Ⅶ和FFR-因子Ⅶ)，可加速tPA誘導(dǎo)的血栓溶解。修飾過(guò)的因子Ⅶ可在血栓溶解劑如組織型纖維蛋白溶酶原激活劑施用之前、同時(shí)，或緊隨其后使用。
國(guó)際申請(qǐng)No.WO92/15686涉及修飾過(guò)的因子Ⅶa、多核酸和用于修飾過(guò)的因子Ⅶa生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，以及用于抑制血液凝固的含有修飾過(guò)的因子Ⅶa的組合物。
國(guó)際申請(qǐng)No.WO94/27631涉及用于抑制血管再狹窄、組織因子活性和血小板沉積的方法。
國(guó)際申請(qǐng)No.WO96/12800涉及一種用于治療急性冠狀動(dòng)脈閉合的方法，包括給病人施用與組織型纖溶酶原激活劑或鏈激酶聯(lián)合使用的含有修飾過(guò)的因子Ⅶa的組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種用于抑制病人血栓形成的方法，其包括在病人易于形成血栓的血管位置局部施用治療有效劑量的組合物，此組合物含有在其催化中心至少有一種修飾的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。血栓形成的位置可與手術(shù)，顯微手術(shù)、血管成形術(shù)或創(chuàng)傷有關(guān)。
本發(fā)明也涉及一種用于維持或改善病人中血管開放度的方法，其包括在易于減小開放度的血管位置局部施用治療有效劑量的組合物，此組合物含有在其催化中心至少有一種修飾的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。血栓形成的位置可與手術(shù)、顯微手術(shù)、血管成形術(shù)或創(chuàng)傷有關(guān)。
本發(fā)明還涉及一種預(yù)防或減少個(gè)體與缺血后再灌注相關(guān)的心肌損傷的方法，其包括給個(gè)體施用一種組合物，此組合物含有在其催化中心至少有一種修飾的藥學(xué)可接受的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
本發(fā)明還涉及一種改善個(gè)體在缺血后再灌注過(guò)程中局部心肌血流的方法，其包括給個(gè)體施用一種組合物，此組合物包含在其催化中心至少有一種修飾的藥學(xué)可接受的因子Ⅶ此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，修飾過(guò)的因子Ⅶ包含因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。在一更優(yōu)選的方面，此蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫(Sulfanyl fluoride)，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。在一更為優(yōu)選的方面，此蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮，Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮，Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮及Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮，最優(yōu)選的為Phe-Phe-Arg氯甲基酮。
本發(fā)明還涉及在其催化中心至少有一種修飾的因子Ⅶ用于制造用來(lái)防止或減少與缺血后再灌注相關(guān)的心肌損傷的組合物的用途，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。本發(fā)明還涉及在其催化中心至少有一種修飾的因子Ⅶ用于制造用來(lái)改善缺血后再灌注過(guò)程中局部心肌血流的組合物的用途，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
本發(fā)明提供了抑制與缺血后再灌注相關(guān)的有害事件的方法和組合物。組織、器官或肢體的嚴(yán)重缺血可以由于血流減少也可以與創(chuàng)傷、手術(shù)操作或低血壓相關(guān)。與嚴(yán)重缺血相關(guān)的一種并發(fā)癥是在動(dòng)脈系統(tǒng)中組織因子的上調(diào)。認(rèn)為這種組織因子表達(dá)的增加刺激了促凝血反應(yīng)(主要在毛細(xì)血管床)，因而引發(fā)和/或維持了血管內(nèi)的血栓形成。此外，通過(guò)冠狀血管系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞在缺血后心臟的再灌注過(guò)程中組織因子(TF)的從頭合成可以導(dǎo)致再灌注過(guò)程中冠狀動(dòng)脈血流的減少，因而影響最終經(jīng)歷壞死的缺血性心肌層的結(jié)局。與患穩(wěn)定性心絞痛的病人相比，獲自患不穩(wěn)定性心絞痛病人的動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)標(biāo)本中的組織因子抗原及促凝血活性升高。因此，認(rèn)為在這些病人中不穩(wěn)定心絞痛可能有大心外膜冠狀動(dòng)脈的亞內(nèi)皮組織中組織因子暴露造成斑塊破壞這一因素的參與。這將最終促進(jìn)冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成，引起冠狀動(dòng)脈血流確實(shí)減少。
組織因子也可以一種不同的途徑影響冠狀動(dòng)脈血流。在缺血性組織再灌注后，可以產(chǎn)生閉塞性的或非閉塞性的血栓。動(dòng)脈床中血栓的產(chǎn)生及在血栓周圍血小板的沉積導(dǎo)致該組織中繼發(fā)性缺血的產(chǎn)生。血栓的產(chǎn)生及血小板的存在于是可引起多種生物活性因子的產(chǎn)生和釋放，包括那些從凝血途徑產(chǎn)生的如凝血酶和因子Ⅹ以及從活化的血小板中釋放的各種因子。這些因子又可引起由底部的內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞或由相鄰的單核細(xì)胞產(chǎn)生額外的因子，如TNF-α和IL-1。這些因子又可再激活內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致與單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞結(jié)合相關(guān)的各種粘附分子的上調(diào)。一般地，與循環(huán)血接觸的內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)明顯的組織因子活性。在特定條件下，內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)組織因子樣促凝血活性有效地促進(jìn)凝血。特別是，外源和內(nèi)源性產(chǎn)生的氧自由基(OFR)可刺激冠狀血管內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞合成和表達(dá)大量的組織因子。氧自由基是高活性的分子，可進(jìn)攻各種細(xì)胞成分。在缺血期后血流恢復(fù)之后有大量氧自由基產(chǎn)生，這些氧化劑可在脂過(guò)氧化和細(xì)胞成分的其它不可逆改變之后造成一種特殊形式的再灌注介導(dǎo)的組織損傷。氧自由基也可急劇減低組織因子途徑抑制劑(TFPI)(一種由內(nèi)皮細(xì)胞合成的抑制外源性凝血途徑的kunitz型蛋白質(zhì))的活性，這種氧自由基的雙重效果(由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子和降低TFPI活性)可以將正常內(nèi)皮天然的抗凝血性質(zhì)轉(zhuǎn)變成一種促凝血狀態(tài)，因而有利于一種不希望的血管內(nèi)凝血的活化。因此，在冠狀循環(huán)中氧自由基介導(dǎo)的組織因子表達(dá)導(dǎo)致在缺血后再灌注過(guò)程中冠狀動(dòng)脈血流的明顯減少。這種氧自由基介導(dǎo)的組織因子的表達(dá)及其帶來(lái)的外源性凝血途徑的活化有嚴(yán)重后果，因?yàn)榇爽F(xiàn)象影響缺血后再灌注的病理生理特別是在經(jīng)歷冠狀動(dòng)脈血栓的急性心肌梗死病人中。
不復(fù)流現(xiàn)象，即在先前缺血組織中缺乏對(duì)微血管系統(tǒng)一致的灌注，已由Krug等人首次描述(Circ.Res.1966；19:57-62)。可以影響缺血性心肌命運(yùn)的最重要的決定因素被認(rèn)為是缺血過(guò)程中的側(cè)流量、危險(xiǎn)面積的大小以及心肌的氧需求。
在過(guò)去的十年中有大量的興趣集中在用再灌注方案治療急性的心肌梗死病人方面，包括冠狀動(dòng)脈血栓溶解，初級(jí)血管成形術(shù)或兩者都有。然而，并非全部研究都證實(shí)在梗死相關(guān)的動(dòng)脈復(fù)通后左心室功能的改善。目前，有相當(dāng)數(shù)目的病人在梗死相關(guān)的冠狀動(dòng)脈床中表現(xiàn)出“低流量”狀況。此狀況至少在死亡率方面幾乎完全無(wú)益。這種低流量狀況被認(rèn)為至少部分地是由血液缺乏再進(jìn)入所有的先前缺血性心肌的血管系統(tǒng)的能力引起。現(xiàn)已令人驚訝的表明因子Ⅶai影響且增加在再灌注過(guò)程中局部的心肌血流。也已令人驚訝的表明因子Ⅶai導(dǎo)致不復(fù)流區(qū)域的明顯減少。
單核和中性粒細(xì)胞的結(jié)合和轉(zhuǎn)移以及這些細(xì)胞釋放的生物活性物質(zhì)(包括氧自由基的產(chǎn)生)可以加劇內(nèi)皮細(xì)胞活化的水平及破壞程度。最終，如果這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)不經(jīng)抑制，就可導(dǎo)致全身性并發(fā)癥和可能刺激多種器官衰竭。通過(guò)施用針對(duì)組織因子/因子Ⅶ結(jié)合(如FFR-FⅦa)的特異性抑制劑封閉組織因子，從而阻斷凝血外源性途徑的起始，防止級(jí)聯(lián)反應(yīng)的起始，從而調(diào)節(jié)與缺血/再灌注相關(guān)事件的破壞程度，如，消除或減少心肌的損傷或壞死。


圖1．表示一種Ser344Ala修飾過(guò)的因子ⅦDNA序列的表達(dá)載體的構(gòu)建。所用符號(hào)包括0-1,0-1圖譜單元序列來(lái)自腺病毒5；E，是SV40的增強(qiáng)子；MLP，腺病毒2主要晚期啟動(dòng)子；SS，一套剪切位點(diǎn)；及pA，在晚期方向中來(lái)自SV40的聚腺苷酸化作用信號(hào)。
圖2．表示與鹽水處理的對(duì)照相比在動(dòng)脈內(nèi)膜切除的狒狒主動(dòng)脈上大劑量注射DEGR-因子Ⅶa對(duì)血栓形成(血小板沉積)的影響。對(duì)動(dòng)脈測(cè)量了60分鐘以上。DEGR-因子Ⅶa明顯地抑制了在此急性血管損傷的靈長(zhǎng)類模型中的富含血小板的血栓的發(fā)展。
圖3．表示當(dāng)在恒定量的FⅦa(5nM)存在下用遞增濃度的FⅦa(空心框)或是DEGR-因子Ⅶa(實(shí)心框)培養(yǎng)狒狒平滑肌細(xì)胞時(shí)所獲結(jié)果。FX活化的水平隨后用產(chǎn)色底物S-2222測(cè)定。數(shù)據(jù)以在5nmFⅦa單獨(dú)存在時(shí)產(chǎn)生的活性的百分比用酰胺水解活性給出。
圖4．顯示與對(duì)照動(dòng)物相比，在頸動(dòng)脈動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)之后且用DEGR-因子Ⅶa處理7或30天的狒狒的內(nèi)膜面積尺寸。
圖5．顯示在氣囊損傷之后且用DEGR-因子Ⅶa處理的狒狒股動(dòng)脈內(nèi)膜面積與內(nèi)膜+中層面積的比率，其中對(duì)照組包括5只血管，處理7天的檢測(cè)了11只血管，處理30的檢測(cè)了2只血管(n是檢測(cè)的血管數(shù))。
圖6．顯示用于測(cè)量梗死尺寸(IS)、不復(fù)流(NR)、危險(xiǎn)面積(AR)、凝血酶原時(shí)間(PT)及活化的部分凝血激酶時(shí)間(aPTT)的實(shí)驗(yàn)方案。
圖7．顯示三個(gè)治療組中以梗死的危險(xiǎn)面積的百分比表示的再灌注期(IS)結(jié)束時(shí)梗死尺寸圖，三個(gè)治療組分別用FFR-因子Ⅶa，因子Ⅶa和鹽水治療。每條代表8只動(dòng)物的±SD平均值。
圖8．顯示以梗死的危險(xiǎn)面積的百分比表示的再灌注期結(jié)束時(shí)不復(fù)流(NR)的面積圖(動(dòng)物分別用FFR-因子Ⅶa，因子Ⅶa和鹽水治療)。每條代表8只動(dòng)物的±SD平均值。
圖9．顯示對(duì)每只動(dòng)物用多元線性回歸方程計(jì)算出的預(yù)期的不復(fù)流(以左心室百分比，LV)與觀察到的不復(fù)流(以LV百分比)之間的關(guān)系。
圖10．顯示在缺血20分鐘、再灌注10分鐘及2小時(shí)后用于缺血性心肌評(píng)估的局部心肌血流(RMBF)圖。
圖11．顯示FFR-因子Ⅶa和因子Ⅶa對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)的影響。
具體實(shí)施方案的說(shuō)明修飾過(guò)的因子Ⅶ可為酶原的形式(即一種單鏈分子)或可在其活性位點(diǎn)被切割。因此，“修飾過(guò)的因子Ⅶ”是指包括結(jié)合組織因子并抑制因子Ⅸ到Ⅸa和因子Ⅹ到Ⅹa活化的修飾過(guò)的因子Ⅶ以及修飾過(guò)的因子Ⅶa。因子Ⅶ序列有至少一種氨基酸修飾，其中所選的修飾可顯著減少活化的因子Ⅶ催化血漿因子Ⅹ或Ⅸ活化的能力，因而可抑制凝血活性。修飾過(guò)的因子Ⅶ有經(jīng)至少一種氨基酸替換修飾的活性位點(diǎn)，且其修飾過(guò)的形式能與組織因子結(jié)合。修飾過(guò)的因子Ⅶ組合物典型的是基本上純的形式。
在優(yōu)選的人和牛因子Ⅶ的實(shí)施方案中，活性位點(diǎn)殘基Ser344被改變，用Gly，Met,Thr或更優(yōu)選地用Ala取代。這種取代可單獨(dú)進(jìn)行或與催化三聯(lián)體中在其它位點(diǎn)(包括His193和Asp242)的取代聯(lián)合進(jìn)行。
修飾過(guò)的因子Ⅶ組合物適合施用于不同的哺乳動(dòng)物，特別是人，以抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)。修飾過(guò)的因子Ⅶ可以與其它抗凝化合物聯(lián)合或代替其它抗凝化合物施于病人。典型地，用于施于人的藥物組合物含有修飾過(guò)的人因子Ⅶ蛋白質(zhì)以及藥學(xué)可接受的載體和緩沖劑。
因子Ⅶ在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起重要作用，特別是參與了外源性途徑。作為一種單鏈酶原蛋白質(zhì)在循環(huán)血漿中存在的因子Ⅶ一旦被活化成為因子Ⅶa，其與組織因子及鈣離子一起激活因子Ⅹ成為Ⅹa，激活因子Ⅸ成為Ⅸa，最終形成一種纖維蛋白塊。
因子Ⅶ有一個(gè)催化位點(diǎn)被修飾以降低因子Ⅶa的催化活性，同時(shí)此分子保留與組織因子結(jié)合的能力。修飾過(guò)的因子Ⅶ分子與天然的因子Ⅶ和/或因子Ⅶa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合組織因子。結(jié)果抑制了因子Ⅹ和Ⅸ的活化。
修飾過(guò)的因子Ⅶ可以由含有兩種可操縱性連接的序列編碼區(qū)域的一種多核苷酸分子編碼，此兩種序列編碼區(qū)域分別編碼一種前原肽和一種維生素K依賴型血漿蛋白質(zhì)的gla結(jié)構(gòu)域以及一種無(wú)gla結(jié)構(gòu)域的因子Ⅶ蛋白質(zhì)，其中一旦表達(dá)，該多核苷酸編碼一種不明顯激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ且能與組織因子結(jié)合的修飾過(guò)的因子Ⅶ分子。由此多核苷酸表達(dá)的修飾過(guò)的因子Ⅶ是一種生物活性的抗凝劑，即它能抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因而抑制纖維蛋白沉積或凝塊的形成。為了表達(dá)修飾過(guò)的因子Ⅶ，將此多核苷酸轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如，BHK,BHK570或293細(xì)胞系。
因子Ⅶa的催化活性可以通過(guò)催化中心或三聯(lián)體的化學(xué)衍生抑制。通過(guò)因子Ⅶ與一種不可逆抑制劑如一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫(Sulfbnyl fluoride)，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽反應(yīng)或通過(guò)例如?；饔脤?shí)現(xiàn)衍生化。優(yōu)選的肽鹵甲基酮包括PPACK(D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮)；(見美國(guó)專利No.4,318,904，此處引用作為參考)，D-Phe-Phe-Arg和Phe-Phe-Arg氯甲基酮(FFR-cmk)以及DEGRck(Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮)。
也可以通過(guò)氨基酸替換、插入或刪除抑制因子Ⅶa的催化活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在因子Ⅶ催化三聯(lián)體的氨基酸序列中(此處限定為含有對(duì)因子Ⅶa催化位點(diǎn)有貢獻(xiàn)的氨基酸的區(qū)域)進(jìn)行氨基酸替換。一般地在或鄰近構(gòu)成催化位點(diǎn)的氨基酸上進(jìn)行催化三聯(lián)體的替換、插入或缺失。在人和牛因子Ⅶ蛋白中，構(gòu)成催化“三聯(lián)體”的氨基酸是Ser344,Asp242和His193(下標(biāo)編號(hào)表明在序列中的位置)。可以用目前可能的技術(shù)包括(除了其它之外)蛋白質(zhì)分離和氨基酸序列測(cè)序來(lái)測(cè)定來(lái)自其它哺乳動(dòng)物種類的因子Ⅶ中的催化位點(diǎn)。也可以通過(guò)與其它絲氨酸蛋白酶，特別是活性位點(diǎn)已測(cè)定的胰凝乳蛋白酶的序列比較從而由該序列的類似活性位點(diǎn)殘基測(cè)定催化位點(diǎn)(Sigler等人，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)35:143-164,(1968)，此處引用作為參考)。
通過(guò)氨基酸替換、插入或刪除以防止或是抑制因子Ⅹ和/或Ⅸ由因子Ⅶa的活化。然而，這種修飾過(guò)的因子Ⅶ也應(yīng)保持其在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中與真的因子Ⅶ和/或因子Ⅶa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合組織因子的能力。可以利用如此處所述的一種凝血試驗(yàn)的方法或是利用如人膀胱癌細(xì)胞系J82(Sakai等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol,chem.)264:9980-9988(1989)，此處引用作為參考)的含有細(xì)胞表面組織因子的一種細(xì)胞系的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)的方法方便地測(cè)定這種競(jìng)爭(zhēng)能力。
在人或牛因子Ⅶ中構(gòu)成因子Ⅶ中催化位點(diǎn)的氨基酸，如Ser344,Asp242和His193可以被取代或刪除。在本發(fā)明中優(yōu)選僅改變一個(gè)氨基酸，從而減少增加此分子抗原性或是抑制其與組織因子結(jié)合的可能性，然而，可以進(jìn)行兩個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(取代、添加或刪除)，也可以聯(lián)合進(jìn)行一種(些)取代、添加和刪除。在一優(yōu)選的關(guān)于人和牛因子Ⅶ的實(shí)施方案中，優(yōu)選地用Ala替換Ser344，也可以取代以Gly,Met,Thr或其它氨基酸。優(yōu)選的用Glu取代Asp以及用Lys或Arg取代His。一般地，所選的取代應(yīng)盡可能少干擾蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。此處引用作為參考的Dayhoft等人的模型(Atlas，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，1978(Atlas of Protein Structure 1978),Nat＇lBiomed.Res.Found.，華盛頓特區(qū))可用作選擇其他氨基酸取代的指導(dǎo)。人們可以在人、?；蚱渌N的合適的催化位點(diǎn)中引入如前述的替代殘基，且可以如此處所述測(cè)試所得的蛋白質(zhì)催化活性抑制的水平以及所獲的抗凝活性。修飾過(guò)的因子Ⅶ的催化活性將基本被抑制，一般地比相應(yīng)種類的野生型因子Ⅶ的催化活性的約5％更低，更優(yōu)選地比其活性的約1％更低。
可以利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)修飾過(guò)的因子Ⅶ。一般地，克隆的野生型因子ⅦDNA序列經(jīng)過(guò)修飾以編碼期望的蛋白質(zhì)。再將此修飾過(guò)的序列插入一種表達(dá)載體，此載體再被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞。高等真核細(xì)胞，特別是培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是優(yōu)選的宿主細(xì)胞。已知人因子Ⅶ的完整的核苷酸和氨基酸序列。見美國(guó)專利No.4,784,950，此處引用作為參考，其中描述了重組人因子Ⅶ的克隆和表達(dá)。牛因子Ⅶ序列由Takeya等人在生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)263:14868-14872(1988)中描述，此處引用作為參考。
可以通過(guò)不同的技術(shù)完成氨基酸序列的改變?？赏ㄟ^(guò)定點(diǎn)突變進(jìn)行DNA序列的修飾。用來(lái)定點(diǎn)突變的技術(shù)為本領(lǐng)域周知，且由如Zoller和Smith(DNA 3:479-488,1984)所述。因此，利用因子Ⅶ的核苷酸和氨基酸序列可以引入所選擇的一種(些)改變。
因子Ⅶ相應(yīng)的修改包括那些用一種選自維生素K依賴型血漿蛋白質(zhì)因子Ⅶ，因子Ⅹ，凝血酶原，蛋白質(zhì)C，蛋白質(zhì)S或蛋白質(zhì)Z的gla結(jié)構(gòu)域取代其氨基端部分(gla結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)。維生素K依賴型血漿蛋白質(zhì)的gla結(jié)構(gòu)域的特征為存在γ-羧基谷氨酸殘基和長(zhǎng)度一般從約30到約40個(gè)氨基酸以及在相關(guān)基因中帶有相應(yīng)于外顯子-內(nèi)含子邊界位置的C末端。生產(chǎn)帶有異源gla結(jié)構(gòu)域的因子Ⅶ的方法公開于美國(guó)專利No.4,784,950，此處引用作為參考。
用于生產(chǎn)修飾過(guò)的因子Ⅶ的DNA序列典型地編碼一種在因子Ⅶ蛋白質(zhì)的氨基端的前肽原以獲得正確的翻譯后加工(例如谷氨酸殘基的γ-羧基化)以及由宿主分泌。前肽原可以是因子Ⅶ的或是其它如因子Ⅸ，因子Ⅹ，凝血酶原，蛋白質(zhì)C或蛋白質(zhì)S的維生素K依賴型血漿蛋白質(zhì)的。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所知曉，在修飾過(guò)的因子Ⅶ中可進(jìn)行附加的各種修飾，這些修飾不會(huì)明顯損害此蛋白質(zhì)作為一種抗凝藥的能力。例如，在催化三聯(lián)體上修飾過(guò)的因子Ⅶ也可在活化切割位點(diǎn)上修飾以抑制此因子Ⅶ酶原到其活化的雙鏈形式的轉(zhuǎn)變，一般地如美國(guó)專利No.5,288,629中所述，此處引用作為參考。
用于表達(dá)修飾過(guò)的因子Ⅶa的表達(dá)載體含有能指導(dǎo)一種克隆的基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。優(yōu)選的用于培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的啟動(dòng)子包括病毒啟動(dòng)子和細(xì)胞啟動(dòng)子。病毒啟動(dòng)子包括S40啟動(dòng)子(Subramani等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)1:854-864,1981)和CMV啟動(dòng)子(Boshart等人，細(xì)胞41:521-530,1985)。一種特別優(yōu)選的病毒啟動(dòng)子是一種來(lái)自腺病毒2的主要晚期啟動(dòng)子(Koufman和Sharp，分子細(xì)胞生物學(xué)，2:1304-1319,1982)。細(xì)胞啟動(dòng)子包括鼠κ基因啟動(dòng)子(Bergman等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，81:7041-7045,1983)和鼠VH啟動(dòng)子(Loh等人，細(xì)胞(cell)33:85-93,1983)。一種特別優(yōu)選的細(xì)胞啟動(dòng)子是鼠金屬硫蛋白-Ⅰ啟動(dòng)子(Palmiter等人，科學(xué)(Science)222:809-814,1983)。表達(dá)載體也可以含有一套位于啟動(dòng)子下游和因子Ⅶ序列本身插入位點(diǎn)的上游的RNA剪切位點(diǎn)。優(yōu)選的RNA剪切位點(diǎn)可以獲自腺病毒和/或免疫球蛋白基因。表達(dá)載體中也包含位于插入位點(diǎn)下游的多腺苷酸化信號(hào)。特別優(yōu)選的多腺苷酸化信號(hào)包括來(lái)自SV40的早期或晚期多腺苷酸化信號(hào)(Kaufman和Sharp，出處同上)，來(lái)自腺病毒5Elb區(qū)域的多腺苷酸化信號(hào)，人生長(zhǎng)激素基因終止子(DeNoto等人，核酸研究(Nuc.Acids Res.)9:3719-3730,1981)或是來(lái)自人因子Ⅶ或牛因子Ⅶ基因的多腺苷酸化信號(hào)。表達(dá)載體也可包括一種位于啟動(dòng)子和RNA剪切位點(diǎn)之間的非編碼性病毒先導(dǎo)序列，如腺病毒2三聯(lián)基因先導(dǎo)以及增強(qiáng)子序列，如SV40增強(qiáng)子。
克隆的DNA序列通過(guò)例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法(Wigler等人，細(xì)胞14:725-732,1978；Corsaro和Pearson，體細(xì)胞遺傳學(xué)(Somatic CellGenetics)7:603-616,1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)(Virology)52d:456-467,1973)或是電穿孔法(Neumann等人，EMBO.J.1:841-845,1982)導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。為了鑒別和挑選表達(dá)外源DNA的細(xì)胞，一般地將一種能賦予可選擇表型(一種選擇性標(biāo)記)的基因與目的基因或cDNA一起導(dǎo)入細(xì)胞。優(yōu)選的選擇性標(biāo)志包括對(duì)能賦予藥物如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的基因。選擇性標(biāo)記可以是一種可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記。一種優(yōu)選的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記是一種二氫葉酸還原酶序列。選擇性標(biāo)記由Thilly綜述(哺乳動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)(MammalianCell Technology)Butterworth出版社，Stoneham,MA，此處引用作為參考)。選擇性標(biāo)記的選擇在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員水平之內(nèi)。
選擇性標(biāo)記可以與在不同質(zhì)粒上的目的基因同時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，也可以在同一質(zhì)粒上轉(zhuǎn)入。如果在同一質(zhì)粒上，選擇性標(biāo)記和目標(biāo)基因可以在不同和相同的啟動(dòng)子控制之下，后一情形產(chǎn)生一種雙順?lè)醋?dicistronic)信息。這種類型的構(gòu)建物為本領(lǐng)域已知(例如，Levinson和Simonsen，美國(guó)專利4,713,339)。在待引入細(xì)胞的混合物中添加一個(gè)附加DNA(稱作“載體DNA”)也可能是有益的。
細(xì)胞吸收該DNA之后，在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，典型地1-2天，以開始表達(dá)目的基因。此處所用“合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基”指一種含有營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞生長(zhǎng)及修飾過(guò)的因子Ⅶ表達(dá)所需的其它成份的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基一般地包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、維生素、鹽、磷脂、蛋白質(zhì)和生長(zhǎng)因子。為了產(chǎn)生γ-羧基化的修飾過(guò)的因子Ⅶ，培養(yǎng)基含有優(yōu)選地從約0.1mg/ml到約5mg/ml的濃度的維生素K。再應(yīng)用藥物篩選用于挑選以穩(wěn)定形式表達(dá)選擇性標(biāo)記的細(xì)胞的生長(zhǎng)。對(duì)于已用可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可增加藥物濃度以挑選一種高拷貝數(shù)的克隆序列，從而增加表達(dá)水平。再篩選穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆中修飾過(guò)的因子Ⅶ的表達(dá)。
優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括COS-1(ATCC CRL1650)，幼倉(cāng)鼠腎(BHK)和293細(xì)胞系(ATCC CRL1573；Graham等人，普通病毒學(xué)雜志(J.Gen.Virol.)36:59-72,1977)。一種優(yōu)選的BHK細(xì)胞系是tk-ts13BHK細(xì)胞系(Waechter和Baserga，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，79:1106-1110,1982，此處引用作為參考)，此后稱為BHK570細(xì)胞。BHK570細(xì)胞系已保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，12301 Parklawn Dr.,MD 20852,ATCC保藏號(hào)CRL 10314。tk-ts13 BHK細(xì)胞系也可從ATCC獲得，其編號(hào)為CRL 1632。此外，可能用到一些其它細(xì)胞系，包括大鼠HepⅠ(大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠HepⅡ(大鼠肝細(xì)胞瘤；ATCCCRL 1548)，TCMK(ATCC CCL 139)，人肺(ATCC HB8065)，NCTC1469(ATCC CCL9:1),CHO(ATCC CCL61)及DUKX細(xì)胞(Urlaub和Chasin，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)77:4216-4220,1980)。
也可利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)生產(chǎn)修飾過(guò)的因子Ⅶ。優(yōu)選在宿主雌性哺乳動(dòng)物的乳腺內(nèi)生產(chǎn)蛋白質(zhì)。在乳腺內(nèi)表達(dá)之后將目標(biāo)蛋白質(zhì)分泌到奶中克服了許多分離源自其它來(lái)源的蛋白質(zhì)遇到的困難。奶便于收集，可大量獲得且已在生化上很好地表征。此外，奶中的主要乳蛋白為高濃度的(典型的從約1到15g/L)。
從商業(yè)觀點(diǎn)出發(fā)，顯然優(yōu)選的用作宿主的種類有大的產(chǎn)奶量。雖然可以使用較小的動(dòng)物如鼠和大鼠(且是在原理的證明期優(yōu)選的)，優(yōu)選使用家畜類哺乳動(dòng)物包括，但不局限于豬、山羊、綿羊和牛。由于下列因素在綿羊中先前的轉(zhuǎn)基因的歷史、奶產(chǎn)量、價(jià)格及用于收集綿羊奶的方便易得的設(shè)備，使綿羊成為特別優(yōu)選的。關(guān)于影響所選的宿主種類的因素的比較參見WIPO公開文本W(wǎng)O88/00239。一般地期望選擇一種已培育為乳用的宿主動(dòng)物的品種，如East Friesland綿羊或是在晚些時(shí)候通過(guò)轉(zhuǎn)基因品系培育以引入乳用牲畜。在任何情況下，應(yīng)使用已知健康狀況良好的動(dòng)物。
為獲得在乳腺中的表達(dá)，使用來(lái)自乳蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。乳蛋白質(zhì)基因包括那些編碼酪蛋白(見美國(guó)專利No.5,304,489，此處引用作為參考)，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白及乳清酸性蛋白的基因。優(yōu)選β-乳球蛋白(BLG)啟動(dòng)子。對(duì)于羊β-乳球蛋白基因，一般使用該基因序列5＇側(cè)翼的至少約406bp區(qū)域，雖然優(yōu)選長(zhǎng)達(dá)約5kbp的5＇側(cè)翼序列的更長(zhǎng)部分，如包含5＇側(cè)翼啟動(dòng)子和β-乳球蛋白基因的非編碼部分。見Whitelaw等人，生物化學(xué)雜志(Biochem J.)286:31-39(1992)。來(lái)自其它種類的啟動(dòng)子DNA的相似片段也是合適的。
β-乳球蛋白基因的其它區(qū)域也可摻入到構(gòu)建體中，這可以是待表達(dá)基因的基因組區(qū)域。本領(lǐng)域一般認(rèn)同例如，缺乏內(nèi)含子的構(gòu)建體與含有這種DNA序列的構(gòu)建體相比表達(dá)較差(見Brinster等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85:836-840(1988)；Palmiter等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88:478-482(1991)；Whitelaw等人，轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Res.)1:3-13(1991)；WO89/01343；及WO91/02318，此處引入每一文獻(xiàn)作為參考)。在這點(diǎn)上，可能情況下一般地優(yōu)選使用包含編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的或多肽的基因的全部或部分天然的內(nèi)含子的基因組序列，因此優(yōu)選還包括至少一些源自如β-乳球蛋白的基因的內(nèi)含子。一種這樣的區(qū)域是提供用于內(nèi)含子剪切及從綿羊β-乳球蛋白基因的3＇非編碼區(qū)的RNA多腺苷酸化的一種DNA片段。當(dāng)用于取代一種基因的天然3＇非編碼序列時(shí)，此種綿羊β-乳球蛋白片段可同時(shí)增強(qiáng)和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的表達(dá)水平。在其它實(shí)施方案中，用源自一種乳特異性蛋白質(zhì)基因的相應(yīng)序列取代修飾過(guò)的因子Ⅶ起始ATG周圍的區(qū)域。這種取代提供了一種推測(cè)的組織特異性起始環(huán)境以增加表達(dá)。修飾過(guò)的因子Ⅶ的整個(gè)前原序列和5＇非編碼區(qū)序列用例如BLG基因的那些取代是方便的，雖然也可以用較小的區(qū)域取代。
對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中修飾過(guò)的因子Ⅶ的表達(dá)，將編碼修飾過(guò)的因子Ⅶ的DNA片段可操縱地連接到其表達(dá)所必需的其他片段上以產(chǎn)生表達(dá)單元。這種其他片段包括上述提到的啟動(dòng)子，以及用于提供轉(zhuǎn)錄終止和mRNA多腺苷酸化的序列。表達(dá)單元也包括編碼一種可操縱性地連接到編碼修飾過(guò)的因子Ⅶ的片段上的分泌性信號(hào)序列的DNA片段。分泌性信號(hào)序列可以是一種天然的因子Ⅶ分泌性信號(hào)序列或可以是另一種蛋白質(zhì)如乳蛋白的。見如，Von Heine，核酸研究，14:4683-4690(1986)；和Meade等人，美國(guó)專利No.4,873,316，此處引入作為參考。
用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表達(dá)單元的構(gòu)建通過(guò)將修飾過(guò)的因子Ⅶ序列插入含有其他DNA片段的一種質(zhì)?；蚴删w載體中方便地進(jìn)行，雖然表達(dá)單元實(shí)質(zhì)上可以通過(guò)任何序列的連接而構(gòu)建。特別方便的是提供一種含有編碼一種乳蛋白的DNA片段的載體，用編碼修飾過(guò)的因子Ⅶ多肽的序列取代編碼此乳蛋白的序列就可構(gòu)建一種包含此乳蛋白基因表達(dá)控制序列的融合基因。在任何情況下，在質(zhì)?；蚱渌d體中表達(dá)單元的克隆有利于修飾過(guò)的因子Ⅶ序列的擴(kuò)增。擴(kuò)增可在細(xì)菌宿主細(xì)胞中(如E.coli)方便地進(jìn)行，因此載體中典型地包括在細(xì)菌宿主細(xì)胞中有功能的復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記。
再將表達(dá)單元引入所選宿主種類的受精卵(包括早期胚)?？赏ㄟ^(guò)幾種途徑，包括顯微注射(如美國(guó)專利No.4,873,191)，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染(Jaenisch，科學(xué)240:1468-1476(1988))或利用胚胎干細(xì)胞(ES)進(jìn)行定點(diǎn)整合(由Bradley等人，Bio/Technology 10:534-539(1992)綜述)等方式中的一種完成異源DNA導(dǎo)入。將卵植入假妊娠的雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮中以使之發(fā)育足月。在其胚系中攜帶導(dǎo)入的DNA的子代可將此DNA以正常孟德爾方式傳入其子代，以使轉(zhuǎn)基因種群發(fā)展。
用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般程序?yàn)楸绢I(lǐng)域已知。見如，Hogan等人，鼠胚胎操作一種實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1986(Manipulating theMouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,1986)；Simons等人，Bio/Technology 6:179-183(1988)；Wall等人，Biol.Reprod.32:645-651(1985)；Buhler等人，Bio/Technology 8:140-143(1990)；Ebert等人，Bio/Technology9:835-838(1991)；Krimpenfort等人，Bio/Technology9:844-847(1991)；Wall等人，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell Biochem.)49:113-120(1992)；美國(guó)專利No.4,873,191和4,873,316；WIPO公開文本W(wǎng)O88/00239,WO90/05188,WO 92/11757和GB87/00458，此處引入這些文獻(xiàn)作為參考。用于將異源DNA序列引入到哺乳動(dòng)物和其胚細(xì)胞中的技術(shù)最初是在鼠中發(fā)展的。見如，Gordon等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)77:7380-7384,(1980)；Gordon和Ruddle，科學(xué)214:1244-1246(1981)；Palmiter和Brinster，細(xì)胞41:343-345(1985)；Brinster等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，82:448-4442(1985)；及Hogan等人，(出處同上)。這些技術(shù)隨后被修改以適于用在較大的動(dòng)物，包括家畜品種中(見如，WIPO公開文本W(wǎng)O88/00239,WO90/05188和WO92/11757和Simons等人，Bio/Technology 6:179-183(1988)。總之，目前最有效的用于轉(zhuǎn)基因鼠或家畜產(chǎn)生的途徑中，按照已建立的技術(shù)將數(shù)百個(gè)線性目標(biāo)DNA分子注射入一個(gè)受精卵的核原(pro-nuclei)中。也可將DNA注射入受精卵的細(xì)胞質(zhì)中。
也可以采用在轉(zhuǎn)基因植物中的生產(chǎn)。表達(dá)可以是廣泛的或定向于特定的器官如塊莖。見Hatt，自然344:469-479(1990)；Edelbaum等人，干擾素研究雜志(J.Interferon Res.)12:449-453(1992)；Sijmons等人，Bio/Technology,8:217-221(1990)；及歐洲專利局公開文本EP255,378。
修飾過(guò)的因子Ⅶ可以通過(guò)親和層析在一種抗因子Ⅶ抗體柱上純化。特別優(yōu)選的是鈣離子依賴型單克隆抗體的使用，如Wakabayashi等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)261:11097-11108(1986)和Thim等人，生物化學(xué)(Biochem.)27:7785-7793(1988)所述，此處引入此文獻(xiàn)作為參考。可以通過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)純化手段如高效液相層析進(jìn)行進(jìn)一步的純化。其它純化方法，包括檸檬酸鋇沉淀為本領(lǐng)域已知，可以用于純化此處所述的新型修飾過(guò)的因子Ⅶ(一般地見，Scopes R.，蛋白質(zhì)純化(ProteinPurification)Springer-Verlag,N.Y.,1982)。基本上純的修飾過(guò)的因子Ⅶ優(yōu)選為至少約90～95％同質(zhì)的，最優(yōu)選為98～99％同質(zhì)的，以用于藥物用途。一旦純化，如所期望的部分同質(zhì)或達(dá)到同質(zhì)這種修飾過(guò)的因子Ⅶ就可用于治療。
修飾過(guò)的因子Ⅶ在其活化位點(diǎn)被切割以將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式?；罨梢园幢绢I(lǐng)域已知的方式進(jìn)行，如由Osterud等人，生物化學(xué)(Biochemistry)11:2853～2857(1972)；Thomas，美國(guó)專利No.4,456,591；Headner和Kisiel臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)71:1836-1841(1983)；或Kisiel和Fujikawa,Behring Inst.Mitt.,73:29-42(1983)所述，此處引入作為參考。所獲分子再如下述配制和施用。組合物化合物典型地在實(shí)施干預(yù)之前24小時(shí)內(nèi)及之后多達(dá)7天內(nèi)施用。用于防止或減小心肌損傷的給藥可通過(guò)如此處進(jìn)一步詳述的多種途徑?；衔镆部梢栽谝子谛纬裳ǖ难芪恢美缭谖呛闲g(shù)位置或在易于減少開放度的血管位置局部施用。
在預(yù)防或治療心肌損傷時(shí)，修飾過(guò)的因子Ⅶ的劑量對(duì)于70kg病人的作為注入和維持劑量的范圍為約50mg到500mg/天，更典型的1mg到200mg/天，且更優(yōu)選的從10mg到約175mg/天，取決于病人的體重和病況的嚴(yán)重性。
用于治療心肌損傷的藥物組合物用于在預(yù)防和/或治療中的非腸道給藥。優(yōu)選地，該藥物組合物是非腸道性給藥，即靜脈、皮下或肌內(nèi)給藥。用于非腸道給藥的組合物包含溶于一種可接受的載體，優(yōu)選地為一種水性載體中的修飾過(guò)的因子Ⅶ分子的一種溶液。可以使用多種水性載體如水、緩沖液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。也可將修飾過(guò)的因子Ⅶ分子制成用于輸送和定位于損傷靶點(diǎn)的脂質(zhì)體制劑中。脂質(zhì)體制劑一般地如U.S.4,837,028,U.S.4,501,728及U.S.4,975,282中所述，此處引入作為參考?？梢杂脗鹘y(tǒng)的周知的滅菌技術(shù)將組合物滅菌。所得的水溶液可以被包裝使用或在無(wú)菌條件下過(guò)濾和冷凍干燥，凍干制劑可以在施用前與無(wú)菌水溶液混合。該組合物可含有近似生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)可接受的輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等等，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。在這種制劑中修飾過(guò)的因子Ⅶ的濃度可有很大變化，即從低于約5％，通常至少在約1％到最多達(dá)15或20％重量百分比，且主要由液體體積、粘度等以及所選的特定給藥方式所決定。
因此，典型地用于靜脈輸注的藥物組合物可由多達(dá)250ml的無(wú)菌林格溶液(Ringer＇s Solution)和10mg修飾過(guò)的因子Ⅶ制成。制備非腸道給藥化合物的具體方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知或顯而易見的，且如Remington藥物科學(xué)(Remington Pharmaceutical Science)16版，Mack出版公司，Easton,PA(1982)中所詳述，此處引入作為參考。
含有修飾過(guò)的因子Ⅶ分子的組合物可以在預(yù)防和/或治療性處理中給藥。在治療性應(yīng)用中，組合物如前述以足以治愈或至少部分阻止該疾病及其并發(fā)癥的量施用于已患病的病人。足以達(dá)到目的量稱為“治療有效劑量”。用于此的有效劑量取決于疾病或損傷的嚴(yán)重性以及病人的體重和一般狀況，對(duì)于70kg病人而言一般地范圍從約0.05mg到約500mg修飾過(guò)的因子Ⅶ/天，常用的劑量為從約1.0mg到約200mg修飾過(guò)的因子/天。必須注意本發(fā)明的材料可以一般地應(yīng)用于嚴(yán)重的疾病或損傷狀態(tài)中，即威脅生命或可能威脅生命的情況。在這種情況下，由于所含外源物質(zhì)很少且在人中修飾過(guò)的人因子Ⅶ的免疫原性普遍缺乏，可能(也可能是治療醫(yī)生期望的)施用大大過(guò)量的修飾過(guò)的因子Ⅶ組合物。
在預(yù)防性應(yīng)用中，含有修飾過(guò)的因子Ⅶ的組合物施用于易于受到或處于疾病狀況或損傷威脅的病人以增強(qiáng)病人自身的抗凝血能力。這種劑量稱為“預(yù)防有效劑量”。在此用途中，精確的量同樣取決于病人的健康狀況和體重，對(duì)于70kg病人一般地范圍從約0.05mg到約500mg，更常見的從約1.0mg到約200mg/70kg體重。
該組合物的單次或多次施用可以治療醫(yī)生所選的劑量水平和方案進(jìn)行。對(duì)于救護(hù)車病人需要日常維持水平，可以用例如便攜式泵系統(tǒng)連續(xù)注入方式完成修飾過(guò)的因子Ⅶ的施用。
修飾過(guò)的因子Ⅶ的局部運(yùn)送如，在易于形成血栓的血管位置(如吻合術(shù)處)或在易于減少開放度的血管位置局部應(yīng)用修飾過(guò)的因子Ⅶ可以通過(guò)如噴霧，灌注，雙氣囊導(dǎo)管，斯坦特固定模，植入血管的移植物或斯膽特固定模，用于包被氣囊導(dǎo)管的水凝膠或是其它已建立的方法進(jìn)行。在任何情況下，藥物組合物應(yīng)提供足以有效治療病人的量的修飾過(guò)的因子Ⅶ。
提供下列實(shí)施例用于闡明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1.Ser344Ala344因子Ⅶ的表達(dá)為產(chǎn)生Ser344Ala因子Ⅶ活性位點(diǎn)突變體，用XbaⅠ和KpnⅠ消化質(zhì)粒FⅦ(565+2463)/pDX(美國(guó)專利No.4,784,950，此處引入作為參考；保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)40205)，回收所得的含有絲氨酸344編碼區(qū)域的0.6kb片段。此片段如圖所示克隆入XbaⅠ,KpnⅠ消化的M13mp19。此操作及隨后的步驟一般地如下述按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行(如Maniatis等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社所述，冷泉港，N.Y.(1982)，此處引入作為參考)。
利用突變的寡核苷酸ZC 1656 (5＇TGG GCC TCC GGC GTC CCCCTT3＇)及“通用”第二引物ZC87(5＇TCC CAG TCA CGA CGT3＇)按照Z(yǔ)oller和Smith的方法在M13模板上進(jìn)行突變。用激酶化的(Kinased)ZC1656篩選反應(yīng)產(chǎn)物。挑選陽(yáng)性克隆，制備模板DNA并從在1077的PstⅠ位點(diǎn)到在1213的KpnⅠ位點(diǎn)測(cè)序。序列分析證實(shí)存在期望的突變。突變的克隆稱為1656。
用1656克隆構(gòu)建一種表達(dá)載體。以約0.14kb的PstⅠ-KpnⅠ片段從M13載體上分離突變的序列。此序列與來(lái)自FⅦ(565+2463)/pDX的1.7kb HindⅢ-XbaⅠ片段，來(lái)自FⅦ(565+2463)pDX的0.5kb XbaⅠ-PstⅠ及來(lái)自FⅦ(565+2463)/pDX 4.3kb KpnⅠ-HindⅢ片段連接，如圖所示。通過(guò)用PstⅠ消化突變體和野生型克隆及用KpnⅠ和XbaⅠ消化M13中插入因子Ⅶ的突變體，準(zhǔn)備所消化DNA的Southern雜交及用放射性標(biāo)記的ZC1656探查雜交證實(shí)期望的突變序列的存在。
以兩種分離的(命名為#544和#545)的1656表達(dá)載體轉(zhuǎn)染幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系BHK570(保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)10314)。通過(guò)以1∶10比例將鋪滿10cm平皿的BHK570細(xì)胞稀釋入5個(gè)非選擇性培養(yǎng)基的10cm平皿中(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基[DMEM]，含10％胎牛血清及1％PSN抗生素混合物[GIBCO生命技術(shù)，Gaithersburg,MD])。24小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到20～30％鋪滿度時(shí)，它們將與一種編碼1656突變的表達(dá)載體質(zhì)粒p486(含有腺病毒5起點(diǎn)，SV40增強(qiáng)子，腺病毒2主要晚期啟動(dòng)子，腺病毒2三聯(lián)體先導(dǎo)，5＇和3＇剪切位點(diǎn)，DHFRrcDNA和pML-1中的SV40多腺苷酸化信號(hào)(Lusky和Botchan，自然293:79-81,(1981))以及10mg載體DNA(超聲過(guò)的鮭精DNA)共轉(zhuǎn)染，如表1所示。DNA加入15ml管中，再加入0.5ml2×Hepes(25g Hepes,40g NaCl,1.8g KCl,0.75gNa2HPO4·2H2O,5g葡萄糖用蒸鎦水稀釋到2.5L,pH調(diào)到pH6.95-7.0)，試管中混合。通過(guò)以巴斯德吸管向DNA/Hepes溶液鼓入空氣的同時(shí)加入0.5ml 0.25M CaCl2的方式沉淀每管中的DNA。振蕩這些管，室溫下孵育15分鐘，再次振蕩。用吸頭將DNA混合物滴加到細(xì)胞平皿上。旋轉(zhuǎn)平皿且在37℃下培養(yǎng)4～6小時(shí)。培養(yǎng)后，向每一平皿中加入2ml以Tris-鹽水(0.375gKCl,0.71g Na2HPO2,8.1gNaCl,3.0gTris-HCl,0.5g蔗糖，稀釋到1L,pH調(diào)到pH7.9)稀釋的20％甘油。旋轉(zhuǎn)平皿，室溫下放置2分鐘。將培養(yǎng)基移出平皿且換成2ml Tris-鹽水。室溫下放置平皿2分鐘后，移去Tris-鹽水，用10ml非選擇性培養(yǎng)基替換。平皿在37℃下培養(yǎng)兩天。
表1轉(zhuǎn)染*

*所用DNA濃度為克隆544:0.7mg/ml；克隆545:0.3mg/ml；p486:1.49mg/ml。
培養(yǎng)兩天后，細(xì)胞稀釋于選擇性培養(yǎng)基(DMEM，含10％透析過(guò)的胎牛血清，1％PSN抗生素混合物和150nM氨甲蝶呤)且以1∶100,1∶250和1∶500的稀釋度接種于特大平皿中。平皿在37℃下培養(yǎng)一周。一周后，更換培養(yǎng)基且用選擇培養(yǎng)基替換，檢查平皿中群落的形成。
八天后，菌落形成之后從#544和#545轉(zhuǎn)染的1∶500稀釋的平皿中隨機(jī)選擇12個(gè)菌落。每個(gè)菌落接種于6孔板中的一個(gè)孔，生長(zhǎng)于選擇性培養(yǎng)基。七天后，平皿鋪滿后將每個(gè)菌落分入10cm平皿的選擇性培養(yǎng)基中。
上述克隆及轉(zhuǎn)染以表達(dá)野生型因子Ⅶ的對(duì)照細(xì)胞用35S-甲硫氨酸-半胱氨酸蛋白質(zhì)標(biāo)記混合物(NEN DuPont生物技術(shù)系統(tǒng)，Wilmington，DE)代謝性標(biāo)記。菌落生長(zhǎng)且制備用于在選擇性培養(yǎng)基中脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。用磷酸緩沖鹽溶液(Sigma,St.Louis,MO)沖洗細(xì)胞，在20mCi/ml35S-Cys-35S-Met中脈沖標(biāo)記4小時(shí)。4小時(shí)后，收集上清液和細(xì)胞。細(xì)胞裂解基本上如Lenk和Penman所述(細(xì)胞16∶289-302,1979))且用50ml Staph A(Sigma,st.Louis,Mo)預(yù)清除400ml每種裂解液。
來(lái)自代謝性標(biāo)記的細(xì)胞樣本通過(guò)首先與6ml抗因子Ⅶ多克隆血清孵育4小時(shí)放射免疫沉淀(RIP)。每種樣品中加入60μl洗過(guò)的葡萄球菌蛋白A,4℃下輕搖樣品1.5小時(shí)。離心樣品，除去上清液。沉淀在0.7MRIPA緩沖液[10mM Tris,pH7.4,1％脫氧膽酸[Calbiochem公司，LaJolla,CA],1％Triton X-100,0.1％SDS,5mMEDTA,0.7M NaCl)中洗兩次再在0.15M RIPA緩沖液中(10mM Tris,pH7.4,1％脫氧膽酸[Calbiochem公司，La Jolla,CA],1％Triton X-100,0.1％SDS,5mMEDTA,0.15M NaCl)洗一次。每個(gè)樣品中加入100μl 1×SDS染料(50mM Tris-HCl,pH6.8,100mM二硫蘇糖醇,2％SDS,0.1％溴酚藍(lán)，10％甘油)，樣品煮沸5分鐘，隨后離心以除去蛋白A。每個(gè)樣品的50μl在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。結(jié)果顯示，10個(gè)菌落中的9個(gè)分泌修飾過(guò)的因子Ⅶ。實(shí)施例Ⅱ修飾過(guò)的因子Ⅶ的抗凝血活性修飾過(guò)的因子Ⅶ蛋白質(zhì)抑制凝血的活性在一步凝血實(shí)驗(yàn)中測(cè)定，利用野生型因子Ⅶ作為對(duì)照。重組蛋白質(zhì)基本上按照上述方法從培養(yǎng)于含5mg/ml維生素K的培養(yǎng)基中的細(xì)胞制備。不同量的修飾過(guò)的因子Ⅶ(來(lái)自克隆544)或重組野生型因子Ⅶ用50mM Tris,pH7.5,0.1％BSA稀釋到100ml。此混合物與100ml缺乏因子Ⅶ的血漿(George King生物醫(yī)學(xué)公司，Overland Park,KS)和200ml促凝血酶原激酶C(Dade,Miami,FL；含有兔腦促凝血酶原激酶和11.8mM Ca++)一起孵育。在一種自動(dòng)凝血計(jì)時(shí)儀(MLA Electra 800，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化公司，Pleasantville,NY)中進(jìn)行凝血實(shí)驗(yàn)，利用由1∶5到1∶640收集的正常的人血漿稀釋液構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(假定含有每毫升1個(gè)單位因子Ⅶ活性；通過(guò)從健康供體收集檸檬酸鹽血清制得)將凝血時(shí)間轉(zhuǎn)變成因子Ⅶ活性單位。通過(guò)此實(shí)驗(yàn)，修飾過(guò)的因子Ⅶ制劑未顯示可檢測(cè)的凝血活性。表2顯示對(duì)照(未轉(zhuǎn)染的)BHK細(xì)胞條件的培養(yǎng)基(+/-維生素K)、野生型因子Ⅶ和兩株分離的表達(dá)修飾過(guò)的因子Ⅶ細(xì)胞的凝血時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)在凝血時(shí)間上比對(duì)照樣品的減少可見因子Ⅶ活性。
表2

為了測(cè)定修飾過(guò)的因子Ⅶ對(duì)血漿因子底物的作用，修飾過(guò)的因子Ⅶ制劑以及重組野生型或天然的因子Ⅶ一起與因子Ⅹ或因子Ⅸ孵育，通過(guò)凝血實(shí)驗(yàn)或聚丙烯酰胺凝膠電泳監(jiān)測(cè)其活性。實(shí)施例Ⅲ修飾過(guò)的因子Ⅶ結(jié)合組織因子的能力修飾過(guò)的因子Ⅶ與野生型因子Ⅶ競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合組織因子以及抑制其凝血活性的能力在一步凝血實(shí)驗(yàn)中在有限量的組織因子(促凝血酶原激酶)存在下測(cè)定。
在類似于實(shí)施例Ⅱ所述的一步實(shí)驗(yàn)中確定凝血時(shí)間。在混合實(shí)驗(yàn)中使用有限量的組織因子、恒定量的野生型因子Ⅶ以及增加的變體因子Ⅶ的量。在含有增加的變體因子Ⅶ的量的實(shí)驗(yàn)中凝血時(shí)間的增加顯示因子Ⅶ/Ⅶa凝血原活性的抑制。
在測(cè)試樣品中，因子Ⅶ的量以在收集正常的血漿中測(cè)定的因子Ⅶ活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線的百分比計(jì)算。利用在磷酸緩沖鹽液(PBS)中范圍從1∶5～1∶640的收集的正常血漿系列稀釋液得出因子Ⅶ活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了此目的，假定正常血漿含約500ng/ml因子Ⅶ，且以此為一個(gè)活性單位。100ml因子Ⅶ缺乏的血漿，100ml血漿稀釋液及200ml凝血凝酶C(Dade,Miami,FL)的混合物用于在MLA Electra800自動(dòng)計(jì)時(shí)儀上測(cè)量凝血時(shí)間。為建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每秒計(jì)的凝血時(shí)間的活性百分?jǐn)?shù)(1∶5=100％活性)畫圖。
實(shí)驗(yàn)所要求的培養(yǎng)基含有組成少于1％血清的野生型及變體因子Ⅶ。用PBS制成稀釋液以使凝血時(shí)間落入標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。典型的最低稀釋度為1∶2。終體積為100ml。在實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了命名為克隆“#10”和“#6”的兩個(gè)不同的人因子Ⅶ Ser344Ala變體。列于下表的結(jié)果顯示，隨著因子Ⅶ變體的增加，因子Ⅶa的活性百分比減少。表3用Ser344→Ala混合實(shí)驗(yàn)的結(jié)合變體(B4A1(野生型)培養(yǎng)基用作在10μl/反應(yīng)的100％活性)

未轉(zhuǎn)染條件的培養(yǎng)基5除了標(biāo)明“(-K)”的情況，為表達(dá)變體因子Ⅶ，細(xì)胞在有維生素K存在下生長(zhǎng)這些實(shí)驗(yàn)表明，帶有Ser344Ala取代的因子Ⅶ變體以劑量依賴型形式與天然因子Ⅶ競(jìng)爭(zhēng)，抑制天然因子Ⅶ/Ⅶa的凝血原活性。因此可得出結(jié)論Ser344Ala變體人因子Ⅶ與天然人因子Ⅶa競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制人血漿中因子Ⅹ和/或Ⅸ的活性。實(shí)施例Ⅳ因子Ⅶ與PPACK的反應(yīng)重組因子Ⅶ在轉(zhuǎn)染的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞中產(chǎn)生。此蛋白質(zhì)的純化和活化如Thim等人(生物化學(xué)(Biochemistry)27:7785-7793,1988),Brinkous等人(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)86:1382-1386,1989)及Bjoern和Thim(Res.Discl.No.269,564,1986)所公開，此處引入作為參考。細(xì)胞培養(yǎng)液回收、過(guò)濾并稀釋以減低鹽濃度。稀釋的培養(yǎng)液再利用含有CaCl2的洗脫緩沖液通過(guò)陰離子交換層析分離?；厥找蜃英髁鞣菰倮免}離子依賴抗因子Ⅶ單克隆抗體通過(guò)免疫層析進(jìn)一步純化。利用分別以CaCl2和NaCl洗脫因子Ⅶ的兩步陰離子交換層析進(jìn)行進(jìn)一步純化。
50mM Tris-HCl,100mM NaCl,5mM CaCl2,pH7.4中的重組因子Ⅶa(1mM)與20mM PPack(D-苯丙酰-脯氨酰-精氨酰氯甲基酮；Calbiochem,La JoHa,CA)孵育5,20和60分鐘。再加入含有產(chǎn)色底物S2288(H-D-異亮氨酸-L-脯氨酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺；Kabi Vitrum AB,Molndal，瑞典)以獲得2.5倍稀釋液，且終濃度為0.3mM S2288。測(cè)量對(duì)硝基苯胺的產(chǎn)生且與利用未處理的因子Ⅶa為對(duì)照所獲的結(jié)果比較。結(jié)果表明在這些反應(yīng)條件下約60分鐘后因子Ⅶa完全失活。實(shí)施例Ⅴ DEGR-因子Ⅶa的產(chǎn)生如實(shí)施例Ⅳ所述制備重組人因子Ⅶa。10mM甘氨酸緩沖液，pH8.0,10mM CaCl2,50mM NaCl中的重組人因子Ⅶa稀釋到1.5mg/ml的濃度。加入10倍摩爾過(guò)量的溶于蒸鎦水中的Dansyl-L-Glu-Gly-Arg-氯甲基酮，DEGRck,(Calbiochem,La Jolla,CA,92037)到因子Ⅶa中，37℃孵育2小時(shí)后，再加入10倍摩爾過(guò)量的DEGRck到混合物中，37℃下再孵育2小時(shí)。第三次加入10倍摩爾過(guò)量的DEGRck到因子Ⅶa中，4℃下孵育約16小時(shí)。此DEGR-因子Ⅶa樣品在4℃下對(duì)Tris緩沖鹽水(0.05M Tris-HCl,0.1M NaCl,pH7.5)充分透析以除去任何游離的DEGRck。
在因子Ⅹa產(chǎn)色底物實(shí)驗(yàn)中測(cè)定最終DEGR-因子Ⅶa混合物中游離DEGRck的存在。DEGR-因子Ⅶa混合物與產(chǎn)色底物S-2222一起加入到純化的人因子Ⅹa中。此底物特異性地由因子Ⅹa切割，而不被因子Ⅶa切割。混合物中未結(jié)合的DEGRck能與因子Ⅹa結(jié)合，從而抑制因子Ⅹa的產(chǎn)色活性。將游離DEGRck加入因子Ⅹa的混合物中產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，以通過(guò)因子Ⅹa產(chǎn)色活性的抑制測(cè)量溶液中游離DEGRck的水平。DEGR-因子Ⅶa混合物的分析表明游離DEGRck:DEGR-因子Ⅶa的比率在充分透析后低于0.5％，從而保證在下述不同鑒定體系中通過(guò)DEGR-因子Ⅶa觀察到的抑制不是由于游離DEGRck的存在。實(shí)施例Ⅶ在大鼠平滑肌細(xì)胞上因子Ⅹa的產(chǎn)生通過(guò)利用特異于因子Ⅹa的產(chǎn)色底物測(cè)定細(xì)胞刺激因子Ⅹ轉(zhuǎn)變?yōu)橐蜃英鷄的能力分析平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞表面組織因子的存在。
大鼠血管平滑肌細(xì)胞(Clowes等人，臨床醫(yī)學(xué)研究(J.Clin.Invest.)93:644-651(1994))以8,000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)皿(美國(guó)科學(xué)產(chǎn)品，Chicago,IL)的培養(yǎng)基中(表4)。
表4500ml Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)；(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)10％胎牛血清(Hyclone,Logan,UT)1mM丙酮酸鈉(Irvine,Santa Ana,CA)0.29mg/ml L-谷氨酰胺(Hazelton,Lenexa,KS)1×PSN；(100x為5mg/ml青霉素，5mg/ml鏈霉素，10mg/ml新霉素)(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)37℃培養(yǎng)48小時(shí)后培養(yǎng)基換成無(wú)血清培養(yǎng)基(表5)
表5250ml Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，250ml Ham F-12培養(yǎng)基(Fred Hutchinson癌癥研究中心，西雅圖，WA)1mM丙酮酸鈉0.29mg/ml L-谷氨酰胺20mM轉(zhuǎn)鐵蛋白(JRH,Lenexa,KS)5mM胰島素(GIBCO-BRL)16ng硒(Aldrich,Milwaukee,WI)1mg/ml牛血清血蛋白(Sigma,St.Louis,MO)37℃下培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)。培養(yǎng)后，或加入PDGF-BB(10ng/ml)或加入10％胎牛血清到細(xì)胞中以刺激組織因子表達(dá)(Taubman等人，臨床醫(yī)學(xué)研究，91:547-552,1993)。監(jiān)測(cè)一套平行的既無(wú)PDGF也無(wú)血清的未受刺激的細(xì)胞中的內(nèi)源性活性。培養(yǎng)6小時(shí)后，細(xì)胞中加入重組人因子Ⅶa至終濃度10nM。以不加入因子Ⅶa的一套細(xì)胞為陰性對(duì)照。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)2小時(shí)，用HEPES緩沖液(10mM HEPES,137mMNaCl,4mM KCl,5mM CaCl2,11mM葡萄糖，0.1％BSA)洗滌。洗滌后，細(xì)胞與每孔50ml的200nM血漿純化的人因子Ⅹ(補(bǔ)加5mM CaCl2的Tris-緩沖鹽液中)培養(yǎng)5分鐘。每孔中加入25μl 0.5M的EDTA及25ml S-2222產(chǎn)色底物(Kabi Pharmacia,Franklin,OH)的800mM溶液。室溫下孵育平皿40分鐘，用THERMOMAX微孔板讀數(shù)儀(MolecularDevices,Menlo Park,CA)在405nm分析。
表6顯示用因子Ⅶa處理過(guò)的孔與對(duì)照孔相比(無(wú)因子Ⅶa加入)吸光度增加。吸光度增加是孔中產(chǎn)生的因子Ⅹa水平的直接測(cè)定，其隨后切割產(chǎn)色底物，稀放出產(chǎn)色團(tuán)。數(shù)據(jù)也表明用PDGF-BB或10％胎牛血清預(yù)處理的孔中產(chǎn)色活性水平比未刺激的細(xì)胞高。
表6

這些結(jié)果清楚地顯示在大鼠平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞表面上因子Ⅹ到因子Ⅹa轉(zhuǎn)變是一種因子Ⅶa依賴性活化。實(shí)施例Ⅶ通過(guò)DEGR-因子Ⅶa的細(xì)胞表面產(chǎn)色活性的抑制如前述將大鼠血管平滑肌細(xì)胞接種于96孔板中。如前述在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)，添加10％胎牛血清6小時(shí)以刺激組織因子表達(dá)。刺激后，每孔中分別加入緩沖液(對(duì)照)，或10nM因子Ⅶa，或[10nM因子Ⅶa+100nM DEGR-因子Ⅶa]。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，用HEPES緩沖液洗。洗滌后，細(xì)胞與每孔50ml的200nM因子Ⅹ(補(bǔ)加5mMCaCl2的Tris緩沖鹽溶液中)一起培養(yǎng)5分鐘。每孔中加入25μl 0.5MEDTA和25mlS-2222(800mM)產(chǎn)色底物(Kabi Pharmacia)。室溫下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘。如前述在405nm處分析產(chǎn)色活性。
表7顯示僅用因子Ⅶa處理的孔中產(chǎn)色活性的刺激，以及當(dāng)DEGR-因子Ⅶa與因子Ⅶa共培養(yǎng)時(shí)刺激的抑制。這些結(jié)果顯示，DEGR-因子Ⅶa作為因子Ⅶa結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，抑制因子Ⅹ轉(zhuǎn)變?yōu)橐蜃英鷄的活性，隨即抑制S-2222色原的切割。
表7

實(shí)施例ⅧDEGR-因子Ⅶa對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞上細(xì)胞表面產(chǎn)色活性的劑量依賴性抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞以4,000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)皿的補(bǔ)加1％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(如表4，無(wú)10％胎牛血清)。5天后除去培養(yǎng)基，細(xì)胞中或是僅加入濃度增加的因子Ⅶa，或是與增加濃度的DEGR-因子Ⅶa一起加入10nM因子Ⅶa。細(xì)胞與因子Ⅶ混合物37℃下一起培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)后，洗滌細(xì)胞且與50ml 200nM的因子Ⅹ(Tris緩沖鹽水中)室溫下培養(yǎng)5分鐘。每孔中加入0.5M EDTA 25ml及800mM-2222(Kabi Pharmaeia)25ml，室溫下培養(yǎng)平皿40分鐘。如前述用微孔板讀數(shù)儀在405nm處分析產(chǎn)色活性。
表8顯示了隨著加入孔中因子Ⅶa量的增加產(chǎn)色活性的劑量依賴性增加。當(dāng)DEGR-因子Ⅶa與100nM因子Ⅶa混合物加入細(xì)胞時(shí)(表9)，存在產(chǎn)色活性的劑量依賴性抑制。1∶1摩爾比的DEGR-因子Ⅶa因子Ⅶa抑制產(chǎn)色活性的約95％。這些數(shù)據(jù)表明此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中DEGR-因子Ⅶa對(duì)培養(yǎng)中的平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞表面組織因子的親和力比天然因子Ⅶa明顯要高。如果DEGR-因子Ⅶa與因子Ⅶa對(duì)結(jié)合組織因子有同等親和力，則當(dāng)兩種分子以等摩爾比加入到細(xì)胞中所觀察到的抑制水平不會(huì)如此高。
表8

表9顯示由DEGR-因子Ⅶa對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞的因子Ⅹa產(chǎn)色活性的劑量依賴性抑制。DEGR-因子Ⅶa增加的濃度與100nM因子Ⅶa共培養(yǎng)，因子Ⅹa產(chǎn)色活性用產(chǎn)色底物S-2222測(cè)定。
表9

>實(shí)施例Ⅸ在可溶性組織因子實(shí)驗(yàn)中通過(guò)DEGR-因子Ⅶa對(duì)因子Ⅹa產(chǎn)生的抑制通過(guò)產(chǎn)色實(shí)驗(yàn)建立使用純化的重組可溶性組織因子的因子Ⅹ到因子Ⅹa的轉(zhuǎn)變。組織因子從釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Shigematsu等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol,Chem.)267:21329-21337,1992)中表達(dá)并純化?？扇苄越M織因子由W.Kisiel博士純化并表征(新墨西哥大學(xué))。制備含有65.9ml可溶性組織因子(2.2mM),29.0ml PCPS(1mM,Sigma,St.Louis,MO),29.5mi人因子Ⅹ(4.1mM),2.77ml Hank緩沖液(25mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,2.7mM KCl,5mM CaCl2,0.1％BSA)的反應(yīng)混合物。96孔板中每孔加入40μl組織因子/因子Ⅹ混合物，25ml用TBS稀釋的因子Ⅶa及25ml用TBS稀釋的DEGR-因子Ⅶa。也使用了40ml組織因子/因子Ⅹ混合物；25ml用TBS/稀釋的因子Ⅶa以及僅有25mlTBS的對(duì)照。10μl S-2222(4mM)產(chǎn)色底物加到孔中的反應(yīng)混合物中且在室溫培養(yǎng)2～10分鐘。如前述在微孔板讀數(shù)儀在405nm處分析結(jié)果。
利用在無(wú)DEGR-因子Ⅶa條件下因子Ⅶa濃度的增加確定因子Ⅶa活化因子Ⅹ的標(biāo)準(zhǔn)曲線。列于表10中的結(jié)果表明，隨著加入到反應(yīng)混合物中因子Ⅶa量的測(cè)量產(chǎn)色活性呈劑量依賴性增加。不同量的DEGR-因子Ⅶa和100nM因子Ⅶa的同時(shí)加入導(dǎo)致產(chǎn)色活性的劑量依賴性減少(表11)。這些數(shù)據(jù)表明，DEGR-因子Ⅶa作為天然因子Ⅶa結(jié)合可溶性組織因子的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，因而抑制因子Ⅹa的產(chǎn)生，如通過(guò)針對(duì)產(chǎn)色底物S-2222的產(chǎn)色活性的降低所測(cè)。
表10以增加濃度的因子Ⅶa加入到可溶性組織因子的因子Ⅹa產(chǎn)色活性的刺激。用產(chǎn)色底物S-2222測(cè)定光密度的改變。

表11通過(guò)在天然因子Ⅶa存在下向可溶性組織因子加入DEGR-因子Ⅶa測(cè)定對(duì)因子Ⅹa產(chǎn)色活性的抑制。用產(chǎn)色底物S-2222測(cè)定光密度的改變。

實(shí)施例Ⅹ通過(guò)DEGR-因子Ⅶa對(duì)凝血的抑制監(jiān)測(cè)DEGR-因子Ⅶa對(duì)凝血時(shí)間的作用的標(biāo)準(zhǔn)凝血實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備如下100ml正常狒狒血漿(用作為抗凝劑的檸檬酸鈉收集)加入到以TBS(20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl)稀釋的100ml不同DEGR-因子Ⅶa濃度的溶液中。樣品混合后在37℃短暫孵育。樣品加入Electra800自動(dòng)凝血計(jì)時(shí)儀(醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化公司，Pleasantville,NY)中。孵育后，含有25mM CaCl2的200ml組織因子制劑加入到DEGR-因子Ⅶa制劑。組織因子制劑以源自新鮮冷凍腦組織的狒狒腦鹽水提取物形式制得，用其引發(fā)狒狒血漿凝血的能力表征。選擇凝血時(shí)間在約40秒鐘的組織因子的濃度。
列于表12的數(shù)據(jù)表明凝血時(shí)間的劑量依賴性增加是由于DEGR-因子Ⅶa的添加。血漿中低至1mg/ml DEGR-因子Ⅶa導(dǎo)致凝血時(shí)間的明顯增加。
表12 DEGR-因子Ⅶa導(dǎo)致的凝血時(shí)間的劑量依賴性增加

>實(shí)施例ⅪDEGR-因子Ⅶa對(duì)血小板積累的抑制分析了DEGR-因子Ⅶa的對(duì)非人的靈長(zhǎng)類中由于機(jī)械性損傷在動(dòng)脈血栓處血小板積累的抑制能力。在狒狒中使用主動(dòng)脈動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)模型，基本上如Lumsden等人所述(血液(blood),81:1762-1770(1993))。長(zhǎng)度為1-2cm的狒狒主動(dòng)脈部分被切下，翻轉(zhuǎn)并刮擦以除去動(dòng)脈的內(nèi)膜及約50％的中膜。動(dòng)脈回復(fù)到其正確方向，兩端插管，置于狒狒的一條體外旁路中，從而通過(guò)此旁路將機(jī)械性損傷的動(dòng)脈暴露于血液。在打開旁路到循環(huán)血液之前，用111In標(biāo)記的自體血小板靜脈注射到動(dòng)物中。利用實(shí)時(shí)γ照像儀測(cè)定在損傷動(dòng)脈位置累積的血小板的水平。
利用在即將打開旁路前DEGR-因子Ⅶa或?qū)φ整}水的大量注射進(jìn)行DEGR-因子Ⅶa對(duì)血小板累積抑制的評(píng)價(jià)。對(duì)損傷的動(dòng)脈連續(xù)測(cè)量60分鐘。0.005mg/kgⅦa劑量的DEGR-因子抑制血小板累積。在以1.0mg/kg量注射時(shí)，在給藥后1小時(shí)約90％的血小板累積被抑制。結(jié)果見圖2。
這些數(shù)據(jù)表明，用DEGR-因子Ⅶa抑制組織因子可明顯抑制動(dòng)脈血管損傷的非人靈長(zhǎng)類模型中富含血小板的血栓的形成。實(shí)施例Ⅻ在動(dòng)脈粥樣硬化兔中氣囊血管成形術(shù)后DEGR-因子Ⅶa抑制血管再狹窄在新西蘭白色(NZW)動(dòng)脈粥樣硬化兔中氣囊血管成形術(shù)后評(píng)價(jià)DEGR-因子Ⅶa的調(diào)節(jié)損傷形成的能力。此動(dòng)物模型已被很好的表征且已證明是用于評(píng)價(jià)抗血栓化合物對(duì)血管損傷形成的作用的好模型(Gimple等人，循環(huán)(Circulation)86:1536-1546(1992)，及Rogosta等人，循環(huán)89:1262-1271(1994))。用于評(píng)價(jià)DEGR-因子Ⅶa的動(dòng)物模型基本如Ragosta(出處同前)所述。
通過(guò)向兔肌內(nèi)注射5mg/kg甲苯噻嗪和35mg/kg氯胺酮麻醉動(dòng)物。通過(guò)在腹股溝韌帶下方切開暴露近端股動(dòng)脈，在近端和遠(yuǎn)端結(jié)扎。用27號(hào)針頭插入分離的部分。通過(guò)針刺造口。分離的片段用鹽水灌滿以消除殘余血液，通過(guò)以80ml/min速度的空氣注入干燥8分鐘?？諝飧稍锖?，分離的片段再次用鹽水灌滿，除去結(jié)扎。用非閉塞性局部壓迫維持止血。用金屬鉗分開此片段。在局部用1％甲苯噻嗪處理局部痙攣。手術(shù)后一天，動(dòng)物用1％膽固醇和6％花生油飼養(yǎng)一個(gè)月直至氣囊血管成形術(shù)。口服對(duì)乙酰氨基酚(Tylenol)10mg/kg3～5天以緩解手術(shù)后疼痛。在手術(shù)后的3～5天內(nèi)給1cc的Ambipen。
用于動(dòng)物的測(cè)試藥物輸送包括初始大量注射后立即施氣囊血管成形術(shù)，隨后利用滲透泵通過(guò)內(nèi)部頸靜脈進(jìn)行連續(xù)的全身性注入。注入藥物持續(xù)3天。對(duì)照動(dòng)物在接受肝素(150U/k，靜脈注射)后進(jìn)行氣囊血管成形術(shù)，隨后再用鹽水注入。用DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物在接受1mg/kg大劑量注射后以50mg/kg/hr注入。
為了用于連續(xù)全身性注入的滲透泵的置入，如前述麻醉動(dòng)物，在全部過(guò)程中另外肌肉內(nèi)注射甲苯噻嗪和氯胺酮維持。通過(guò)頸部中線切開，用鈍器解剖法分離右內(nèi)部頸靜脈，遠(yuǎn)端結(jié)扎。用硅化橡膠管(PE-160)導(dǎo)入到右內(nèi)部頸靜脈。制備皮下通路以使硅化橡膠管穿過(guò)。此管與滲透泵連接。滲透泵在兔背的皮下植入。右公用頸動(dòng)脈用鈍器解剖法分開，遠(yuǎn)端結(jié)扎。通過(guò)動(dòng)脈切開術(shù)，將5F導(dǎo)管插入器在主動(dòng)脈弓連接之前置入。抽血以確定止血參數(shù)，藥物和膽固醇水平。動(dòng)脈內(nèi)注射20mg甲苯噻嗪。通過(guò)位于主動(dòng)脈分支處上方的5F Berman導(dǎo)管用手注射3～4ml泛影鈉-泛影葡胺進(jìn)行對(duì)照主股動(dòng)脈血管造影。
除去Berman導(dǎo)管后，在下行主動(dòng)脈和位于主動(dòng)脈分支上方位置中導(dǎo)入0.14英寸的導(dǎo)線。在熒光鏡指導(dǎo)下，引入2.0到2.5mm的合適大小的氣囊血管成形術(shù)導(dǎo)管，且在導(dǎo)線之前置于橫跨狹窄處。用手動(dòng)充氣機(jī)充脹氣囊到6個(gè)大氣壓60秒。在三次充脹之間有60秒間隔。在每個(gè)動(dòng)物中的兩個(gè)股動(dòng)脈均進(jìn)行此過(guò)程。
氣囊膨脹后，撤除血管成形術(shù)導(dǎo)管，將Berman導(dǎo)管再次引入到主動(dòng)脈分支上方3cm位置。在動(dòng)脈內(nèi)給20mg利多卡因以減少痙攣。如前述進(jìn)行血管造影術(shù)后程序。在股動(dòng)脈水平定出一個(gè)1cm格以計(jì)算實(shí)際直徑。然后再除去導(dǎo)管。用3-0絲線結(jié)扎右頸動(dòng)脈，逐層縫合傷口。如上述施用Ambipen和對(duì)乙酰氨基酚。
在測(cè)試化合物的即將大量注射前，注射1小時(shí)后以及在3天連續(xù)注射結(jié)束時(shí)測(cè)定血液中DEGR-因子Ⅶa濃度和凝血酶原時(shí)間。獲得檸檬酸化的血漿1～2毫升，測(cè)定凝血酶原時(shí)間和抗原水平。
下面的標(biāo)準(zhǔn)凝固實(shí)驗(yàn)用于監(jiān)測(cè)對(duì)照和DEGR-因子Ⅶa處理的動(dòng)物中的凝血酶原時(shí)間。25μl測(cè)試的兔血漿(用作為抗凝劑的檸檬酸鈉收集)加入到150mlTBS中(20mM Tris,pH7.4,150mM NaCl.)?；旌蠘悠非壹尤隕lectra 800自動(dòng)凝血計(jì)時(shí)儀(醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化公司，Pleasan Tville,NY)。培養(yǎng)后，含有25mM CaCl2的200ml促凝血酶原激酶制劑(SigmaChemical)加入到血漿制劑中。選擇在對(duì)照兔血漿中約20秒產(chǎn)生凝血的時(shí)間的促凝血酶原激酶濃度。
用ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定來(lái)自對(duì)照和DEGR-因子Ⅶa處理的兔的血漿樣品中的DEGR-因子Ⅶa濃度。實(shí)驗(yàn)包括首先在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋抗人因子Ⅶ單克隆抗體(W.Kisiel博士，新墨西哥大學(xué))到2.0mg/ml，且以100ml/孔加入到96孔板中。平板在4℃下孵育過(guò)夜，隨后用洗滌緩沖液(PBS,pH7.4，含0.05％Tween20)洗兩次。每孔中用200ml封閉緩沖液(PBS,pH7.4，含0.05％Tween 20和1％牛血清血蛋白)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃孵育2小時(shí)后再用洗滌緩沖液洗滌。
封閉后，范圍從20到0.027ng/ml的DEGR-因子Ⅶa標(biāo)準(zhǔn)稀釋系列與測(cè)試的兔血漿(在封閉液中1∶100～1∶4000)的稀釋系列一起加入，每孔中100ml。非免疫兔血漿用作陰性對(duì)照。平皿37℃培養(yǎng)1小時(shí)后用洗滌緩沖液洗滌4次。
通過(guò)加入每孔100ml封閉緩沖液中1∶1000的兔抗人因子Ⅶ多克隆抗體稀釋液(Kisiel博士，新墨西哥大學(xué))檢測(cè)DEGR-因子Ⅶa。37℃下培養(yǎng)平皿1小時(shí)后再用洗滌緩沖液洗5次。用每孔100毫升1∶2000稀釋的山羊抗兔IgG抗體辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物(Tago公司)檢測(cè)特異性抗體結(jié)合。37℃下培養(yǎng)平皿1小時(shí)，用洗滌緩沖液洗6次。最后，加入100ml底物溶液(0.2M檸檬酸鹽緩沖液中的0.42mg/ml二鹽酸化鄰苯二胺[OPD],pH5.0，含0.3％H2O2)。室溫下1～3分鐘后，通過(guò)加入100ml/孔的1N H2SO4終止顏色反應(yīng)，在微孔板分光光度計(jì)上于490nm測(cè)定平板讀數(shù)。通過(guò)與那些DEGR-因子Ⅶa標(biāo)準(zhǔn)曲線比較未知物的A490值測(cè)定血漿樣品中DEGR-因子Ⅶa濃度。
對(duì)血漿樣品的凝血酶原時(shí)間和DEGR-因子Ⅶa抗原水平的分析分別見表13和表14。數(shù)據(jù)代表每個(gè)單獨(dú)的動(dòng)物。表15顯示平均凝血時(shí)間的總括。在所有情況中，DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物在注射后1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)，在注射后第3天時(shí)間點(diǎn)凝血酶原時(shí)間回復(fù)到接近處理前的水平。DEGR-因子Ⅶa抗原水平的分析也顯示在1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)血漿中的DEGR-因子Ⅶa水平較高，其血漿中范圍在2-6mg/ml之間，在第3天時(shí)間點(diǎn)上循環(huán)水平很低。在1小時(shí)時(shí)段測(cè)得的的DEGR-因子Ⅶa水平與預(yù)計(jì)的凝血酶原時(shí)間增加相一致，通過(guò)在體外以DEGR-因子Ⅶa強(qiáng)化正常兔血漿測(cè)定DEGR-因子Ⅶ水平，在標(biāo)準(zhǔn)稀釋促凝血酶原激酶實(shí)驗(yàn)中測(cè)定凝血酶原時(shí)間。
表15漿凝固時(shí)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)總括不成對(duì)的t-檢驗(yàn)Ⅹ 流血前DF 不成對(duì)的t值 概率(雙尾)121.12 0.2852組 數(shù)量均值標(biāo)準(zhǔn)離差標(biāo)準(zhǔn)誤差對(duì)照 8 24.15 1.640.58DEGR-Ⅶa 6 23.2 1.480.60不成對(duì)的t-檢驗(yàn)Ⅹ管成形術(shù)后1小時(shí)DF 不成對(duì)的t值 概率(雙尾)10 -5.440.0003組 數(shù)量均值 標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)誤差對(duì)照 6 24.5 3.35 1.37DEGR-因子Ⅶa 6 40.8 6.53 2.67不成對(duì)的t-檢驗(yàn)Ⅹ 管成形術(shù)后3天DF 不成對(duì)的t值 概率(雙尾)13 -2.040.0622組 數(shù)量均值 標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)誤差對(duì)照 8 19.54 1.53 0.54DEGR-因子Ⅶa 7 21.06 1.33 0.50如前述血管成形術(shù)三周后通過(guò)左頸動(dòng)脈在處死前重復(fù)一次隨訪血管造影術(shù)。通過(guò)一垂直的下腹部切口，分離遠(yuǎn)端主動(dòng)脈，近端剝離，在主動(dòng)脈分支處插入灌注管。遠(yuǎn)端主動(dòng)脈用50ml鹽水沖洗后再在體內(nèi)用500mlHistochoice(AMRESCO,Solon,OH)溶液以120mm Hg注入超過(guò)15分鐘以固定。一旦灌注開始，用過(guò)量戊巴比妥鈉(3ml巴比妥鈉Ⅳ,65mg/ml)處死。5cm段股動(dòng)脈被對(duì)側(cè)切割。組織保存于Histochoice溶液中用于光學(xué)顯微鏡觀察。
為測(cè)定在氣囊血管成形術(shù)位點(diǎn)內(nèi)膜損傷的形成，將被切除的股動(dòng)脈切成連續(xù)的3mm切片，包被在石蠟中，切片切自每個(gè)動(dòng)脈的各種區(qū)域。切片固定于玻璃載玻片上，用蘇木精和伊紅及姬姆薩染色法染載玻片。用Bioquant Program進(jìn)行形態(tài)測(cè)量分析以獲得腔、內(nèi)膜和中膜的面積測(cè)量。對(duì)來(lái)自損傷動(dòng)脈的組織切片進(jìn)行形態(tài)測(cè)量分析，測(cè)量總腔面積；內(nèi)膜面積的測(cè)定則通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)彈性層之內(nèi)的面積減去相應(yīng)的來(lái)自每一組織切片的腔面積得到；中膜面積則通過(guò)測(cè)量外彈性層之內(nèi)的面積再減去內(nèi)彈性層之內(nèi)的面積得到。測(cè)定對(duì)照和用DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物的股動(dòng)脈中內(nèi)膜損傷的測(cè)量表明用DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的內(nèi)膜尺寸明顯減少(表16)。相反，在兩組中中膜面積的測(cè)量無(wú)明顯差異。

來(lái)自血管成形術(shù)測(cè)量的數(shù)據(jù)列于表17，如對(duì)照和DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物的全部三個(gè)時(shí)間點(diǎn)即將施行血管成形術(shù)之前，血管成形術(shù)后立即，及血管成形術(shù)之后21天的平均腔直徑(MLD)+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。在對(duì)照和DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物之間的血管成形術(shù)前或后測(cè)量的MLD無(wú)明顯差異。然而觀察到在用DEGR-因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物中血管成形術(shù)之后測(cè)量的MLD明顯增加。

實(shí)施例ⅧDEGR-因子Ⅶa對(duì)狒狒平滑肌細(xì)胞(SMC)上細(xì)胞表面因子Ⅹa產(chǎn)生的抑劑基本上如前面實(shí)施例Ⅷ所述進(jìn)行細(xì)胞表面產(chǎn)色鑒定以測(cè)量DEGR-因子Ⅶa在狒狒單層平滑肌細(xì)胞(SMC)上對(duì)因子Ⅶa與細(xì)胞表面的組織因子結(jié)合的封閉，抑制隨后因子Ⅹ到因子Ⅹa轉(zhuǎn)變的功效。此方法是對(duì)如Sakai等人生物化學(xué)雜志(J.Bio.Chem.)264:9980-9980(1989)和Wildgoose等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87:7290-7294(1990)所述方法的改進(jìn)。狒狒平滑肌細(xì)胞獲自華盛頓大學(xué)，西雅圖，美國(guó)，且培養(yǎng)自主動(dòng)脈外植體。狒狒平滑肌細(xì)胞以8,000細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)皿的每孔200ml的DEME培養(yǎng)基(補(bǔ)加10％胎牛血清)中，在此培養(yǎng)基中37℃下5％CO2中維持4天。鑒定時(shí)除去110ml培養(yǎng)液，每孔中加入遞增濃度的因子Ⅶa或與DEGR-因子Ⅶa一起加入因子Ⅶa。得出因子Ⅶa濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，范圍從5nM到0.04nM。為測(cè)量DEGR-因子Ⅶa對(duì)因子Ⅶa活性的抑制活性，每測(cè)試孔中在恒量因子Ⅶa(5nM)存在下，加入遞增濃度的DEGR-因子Ⅶa。因子Ⅶa和DEGR-因子Ⅶa均用HEPES緩沖液(10mM HEPES,137mM NaCl,4mM KCl,5mM CaCl2,11mM葡萄糖，0.1％BSA)稀釋，且細(xì)胞中加入10ml 10×貯存液。細(xì)胞與測(cè)試化合物37℃下一起培養(yǎng)2小時(shí)，再用HEPES緩沖液洗3次。每孔中再加入50μl在Tris緩沖液(25mM Tris,pH7.4,150mM NaCl,2.7mM KCl,5mM CaCl2,0.1％BSA)中的200nM因子Ⅹ溶液。室溫下4分鐘后，加入25ml 0.5M EDTA以終止因子Ⅹ向因子Ⅹa的轉(zhuǎn)變。每孔中加入25μl溶于Tris緩沖液的0.8mM S-2222(一種因子Ⅹa特異性產(chǎn)色底物)，60分鐘后在Thermomax微孔板讀數(shù)儀(Molecular Devices公司，Menlo Park,CA)中405nm處讀數(shù)。
圖3所示結(jié)果表明，因子Ⅶa處理過(guò)的孔中(空心方框)酰胺水解活性呈劑量依賴性增加。吸光度的增加是孔中產(chǎn)生的因子Ⅹa水平的直接測(cè)量，因子Ⅹa隨即切割產(chǎn)色底物。恒量因子Ⅶa(5nM)中加入遞增水平的DEGR-因子Ⅶa顯示隨著DEGR-因子Ⅶa(實(shí)心方框)水平的增加，酰胺水解活性呈劑量依賴性下降。與因子Ⅶa等摩爾比的DEGR-因子Ⅶa能抑制＞90％的產(chǎn)色活性。即使在DEGR-因子Ⅶa的水平低10倍時(shí)，仍有對(duì)因子Ⅹa產(chǎn)色活性產(chǎn)生40％的抑制。這些結(jié)果支持了DEGR-因子Ⅶa是一種完整細(xì)胞單層平滑肌細(xì)胞表面上因子Ⅶa使因子Ⅹ向因子Ⅹa轉(zhuǎn)變活化的極強(qiáng)有力的拮抗劑的結(jié)論。實(shí)施例ⅩⅣDEGR-因子Ⅶa對(duì)狒狒中血管血栓形成及血管損傷形成的影響測(cè)試了人DEGR-因子Ⅶa抑制在非人靈長(zhǎng)類中組織因子(TF)和活化的因子Ⅶ(因子Ⅶa)調(diào)節(jié)血管損傷形成(LF)的能力，此LF是由機(jī)械性血管損傷誘發(fā)的。
在即將于狒狒中創(chuàng)造機(jī)械性血管損傷之前開始靜脈注射DEGR-因子Ⅶa7天(5只動(dòng)物)或30天(1只動(dòng)物)。在第30天進(jìn)行血管損傷形成測(cè)量。5只處理過(guò)的動(dòng)物的結(jié)果與5只同時(shí)注入緩沖液的對(duì)照的結(jié)果比較。
測(cè)定關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)值a)血小板計(jì)數(shù)，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；b)血漿纖維蛋白原水平；c)血漿凝固因子Ⅶ,Ⅶa,Ⅹ和Ⅴ的活性水平以及因子Ⅶ的抗原性水平；和d)抗因子Ⅶa抗體水平的基線血漿樣品。
在三氟溴氯乙烷麻醉及無(wú)菌操作條件下，用自體111In-血小板標(biāo)記過(guò)的動(dòng)物使用連續(xù)靜脈內(nèi)給藥的tether系統(tǒng)接受DEGR-因子Ⅶa靜脈內(nèi)注入(初始注射1mg/kg，隨后連續(xù)靜脈內(nèi)注入50mg/kg/hr)。動(dòng)物接受頸動(dòng)脈動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)、對(duì)側(cè)肱動(dòng)脈或?qū)?cè)股動(dòng)脈Fogarty氣囊導(dǎo)管血管成形術(shù)的手術(shù)。
利用tether系統(tǒng)通過(guò)靜脈導(dǎo)管連續(xù)注入以施用DEGR-因子Ⅶa7到30天。手術(shù)后30天用三氟溴氯乙烷麻醉動(dòng)物，用含0.1％戊二醛的4％多聚甲醛在原位加壓灌注固定30分鐘。那時(shí)，用Harker等人，循環(huán)(Circulation)83:41-44(1991)和Hanson等人，高血壓(Hypertension)18:1170-1176(1991)的方法收集血管片段(含有先前損傷過(guò)的位置)。樣品在體外固定后(含0.1％戊二醛的4％多聚甲醛)低溫保藏(Cryopreserved)且加工用于損傷程度的形態(tài)測(cè)量學(xué)分析。
研究了11只正常成年狒狒(Paio anubis)。其中6只動(dòng)物接受DEGR-因子Ⅶa的注入(50mg/kg/hr)，剩余5只為不接受DEGR-因子Ⅶa的對(duì)照動(dòng)物。在采用前將動(dòng)物去蠕蟲且經(jīng)三個(gè)月觀察無(wú)疾病。全部過(guò)程經(jīng)研究性動(dòng)物關(guān)懷及使用委員會(huì)批準(zhǔn)并遵守由NIH關(guān)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的關(guān)懷及使用指南列出的操作及方法，以及動(dòng)物保護(hù)法案和相關(guān)研究性政策。在用氯胺酮(10mg/kg肌內(nèi)注射)和安定(0.5mg/kg靜脈內(nèi)注射)誘導(dǎo)后在三氟溴氯乙烷麻醉下進(jìn)行侵入性過(guò)程。為了在隨后的手術(shù)后進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)性操作中短期固定，使用鹽酸氯胺酮(5-20mg/kg，肌內(nèi)注射)。
用Hanson等人，高血壓，18:I170-I176(1991)和Krupski等人，循環(huán)84:1749-1757(1991)所述的技術(shù)(此處引入作為參考)通過(guò)頸中線切口完成頸動(dòng)脈動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)。使用動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)作為血管損傷模型是因?yàn)槠渑R床上的相關(guān)性，以及已證實(shí)正常動(dòng)脈的動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)誘導(dǎo)的VLF具有可重復(fù)性。簡(jiǎn)言之，從鎖骨近側(cè)到頸動(dòng)脈分支遠(yuǎn)端的共用頸動(dòng)脈被無(wú)包圍組織的切下。大量注射硫酸鹽肝素(100U/kg靜脈內(nèi)注射，Elkins-Simm公司，Cherry Hill,NJ)后3分鐘用置于暴露血管兩端的無(wú)創(chuàng)傷血管來(lái)交叉夾住其用頸動(dòng)脈，且近側(cè)與遠(yuǎn)端交叉夾分開1cm。再將近側(cè)動(dòng)脈段在彎鉗上翻轉(zhuǎn)。在獲得最大翻轉(zhuǎn)后，將一對(duì)聚丙烯駐留縫線(7-0)置于任一端近側(cè)，將另一對(duì)置于暴露出腔的片段的近端。從翻轉(zhuǎn)血管段分隔端的1cm處開始進(jìn)行動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)，持續(xù)達(dá)測(cè)量長(zhǎng)度為1cm。此步驟包括利用彎鉗和手術(shù)顯微鏡(32x放大倍數(shù))將正常內(nèi)膜和中膜的部分厚度機(jī)械性除去。動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)后，血管回復(fù)到正常構(gòu)象，用7-0聚丙烯縫線進(jìn)行末端對(duì)末端的吻合術(shù)及在2.5倍放大倍數(shù)下連續(xù)操作將傷口逐層縫合。
為了對(duì)VLF進(jìn)行形態(tài)測(cè)量分析，包埋在石蠟中且用蘇木精-伊紅染色相連組織成分(蝕原，彈性蛋白)的部分利用帶有影像分析系統(tǒng)(Thomas光學(xué)測(cè)量系統(tǒng)，Columbus,GA)的Zeiss透視鏡評(píng)價(jià)，此顯像分析系統(tǒng)含有帶高分辨率(700線)監(jiān)視器的高分辨率(580線)CCD顯微鏡照相機(jī)，一塊IBM386芯片，帶有用于顯像捕獲和貯存的高分辨率圖像分析儀的80MB計(jì)算機(jī)。用形態(tài)測(cè)量軟件進(jìn)行定量顯像分析(Optimas,Bioscan公司，Edmonds,WA)。針對(duì)新內(nèi)膜增生性損傷的總面積及相應(yīng)的動(dòng)脈中膜面積分析動(dòng)脈截面。為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用成對(duì)和不成對(duì)數(shù)據(jù)的學(xué)生檢驗(yàn)(雙尾)比較不同的組。
結(jié)果顯示在用DEGR-因子Ⅶa處理7天后在第30天進(jìn)行研究的動(dòng)物中的內(nèi)膜面積與經(jīng)過(guò)同樣血管損傷但未接受任何DEGR-因子Ⅶa的對(duì)照動(dòng)物相比明顯下降(圖4)。在用DEGR-因子Ⅶa處理30天且在第30天檢查的動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果。
利用氣囊血管造影肱動(dòng)脈模型的初步研究表明，用DEGR-因子Ⅶa治療無(wú)可檢測(cè)的益處。然而此模型已證實(shí)在狒狒中是一個(gè)組織因子起關(guān)鍵作用的凝血酶原模型。
狒狒中的股動(dòng)脈氣囊損傷研究的確表明與對(duì)照相比，DEGR-因子Ⅶa有統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯的益處，如圖5所示。實(shí)施例XV DEGR-因子Ⅶa對(duì)tPA誘導(dǎo)的血栓溶解的影響在急性心肌梗死過(guò)程中進(jìn)行性冠狀動(dòng)脈血栓形成主要是由與因子Ⅶa復(fù)合的組織因子通過(guò)外源性凝血途徑調(diào)節(jié)。確定了在外源性途徑中的不同位點(diǎn)輔助性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制對(duì)組織型纖溶酶原激活劑(TPA)血栓溶解的影響。
帶有電子誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈血栓的正在用tPA(1mg/kg,20分鐘以上)溶栓的36只狗分別被給予四種輔助性治療的一種9只接受30mg/kg/min的蜱抗凝固肽(TAP，一種選擇性因子Ⅹa抑制劑)90分鐘。在9只狗中TF-因子Ⅶa復(fù)合物被重組組織因子途徑抑制劑(TFPI)(100-150mg/kg/min,90分鐘)抑制，在另9只狗中被DEGR-因子Ⅶa(1～2mg/kg次)(作為活化的因子Ⅶa競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)抑制。還有9只狗接受鹽水對(duì)照。在溶栓后觀察狗的再閉塞120分鐘。這些試劑對(duì)溶栓功效的影響見下表18(數(shù)據(jù)為平均±SD)表18

*數(shù)值與鹽水對(duì)照的差異為0.05顯著性水平。
這些數(shù)據(jù)表明，由DEGRⅦa或TFPⅠ封閉因子Ⅹa或TF-因子Ⅶa造成的外源性途徑的抑制加速了t-PA誘導(dǎo)的血栓溶解。選擇性因子Ⅹa抑制劑在成功再灌注后維持動(dòng)脈開放更為有效。實(shí)施例Ⅶ修飾過(guò)的因子Ⅶa對(duì)血管內(nèi)血栓形成的抑制不影響系統(tǒng)性凝血為確定與TF結(jié)合的因子Ⅶ的抑制是否會(huì)導(dǎo)致抗血栓形成作用，通過(guò)將外用縮窄器置于內(nèi)皮損傷的免頸動(dòng)脈周圍(Fott＇s模型)引發(fā)由于復(fù)發(fā)的血栓形成造成的循環(huán)血流變化(CFV)。利用置于縮窄器近端的Dopple流量探測(cè)器連續(xù)測(cè)定頸動(dòng)脈血流。在動(dòng)脈周圍放置縮窄器后，6只兔中的6只形成平均頻率11±2循環(huán)/小時(shí)的CFV，而在CFV最低點(diǎn)頸動(dòng)脈血流速度平均為5±2％基線值。觀察CFV30分鐘后，動(dòng)物接受人重組活性位點(diǎn)封閉的(Phe-Phe-Arg氯甲基酮)因子Ⅶa(因子Ⅶai)(0.1mg/kg/min,10分鐘)的注入。因子Ⅶai完全消除了6只動(dòng)物中6只的CFV(CFV頻率=0循環(huán)/小時(shí)；P＜0.05；頸動(dòng)脈血流速度=106.9％基線值；p=NS，相對(duì)于基線基)。CFV抑制30分鐘后，以0.1mg/kg/min的劑量注入人重組因子Ⅶa10分鐘。因子Ⅶa的注入在所有動(dòng)物中恢復(fù)了CFV，這表明因子Ⅶa與TF的結(jié)合是競(jìng)爭(zhēng)性的。在因子Ⅶai注入后與基線值相比，凝血酶原時(shí)間、活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間、應(yīng)答ADP和凝血酶的離體血小板沉積均無(wú)差異。因此，在體內(nèi)引發(fā)血栓形成中，因子Ⅶ-Ⅶa起了重要作用。因子Ⅶai的施用在此模型中表現(xiàn)出不影響系統(tǒng)性凝血的強(qiáng)的抗血栓形成作用。實(shí)施例ⅩⅦ通過(guò)局部施用修飾過(guò)的因子Ⅶa抑制微動(dòng)脈血栓在血管手術(shù)、微血管再造手術(shù)或再植手術(shù)中，最常見的失敗原因是在吻合處的血栓。當(dāng)血管經(jīng)過(guò)創(chuàng)傷、顯示出病理性改變或當(dāng)使用介入性靜脈移植物時(shí)閉塞性血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)大大增加了。因而，抗血栓形成性干預(yù)經(jīng)常與手術(shù)一起使用。目前可得的用于此目的的物質(zhì)以非腸道途徑(肝素，葡聚糖)或口服途徑(ASA)施用且均帶有出血副作用。此外，肝素和尤其是ASA在防止(動(dòng)脈)血栓形成時(shí)僅部分有效。由于這些缺點(diǎn)，需要在血管手術(shù)中使用防止血栓的一種試劑，此試劑能通過(guò)可被局部運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)的方式在吻合術(shù)區(qū)域和血管損傷位置結(jié)合且發(fā)揮功效，避免不期望的系統(tǒng)性副作用。此實(shí)施例中，活性位點(diǎn)失活的因子Ⅶa在動(dòng)脈損傷位點(diǎn)的局部施用用于產(chǎn)生不會(huì)誘發(fā)出血增加或其它止血缺陷的傾向的抗血栓形成作用。方法
重為～3.5kg的瑞典魯普兔(Swedish Loop)(雌、雄均可)用標(biāo)準(zhǔn)糖丸飼料和隨意量的水喂養(yǎng)。用前在實(shí)驗(yàn)室觀察至少一周無(wú)疾病。
邊緣耳靜脈插管，用巴比妥鈉(18mg/kg)麻醉且重復(fù)注射以維持。
雙側(cè)耳引出皮瓣，制備中央動(dòng)脈3cm長(zhǎng)的片段(外徑～1mm)。所有分支用10-0縫線連接和切割。操作區(qū)用等滲鹽水沖洗且蓋上薄塑料膜。為了保持高且恒定的血流量和防止痙攣，將動(dòng)物置于熱墊上且保持在約39.5℃的(正常體溫約38.5℃)稍高體溫下，在操作后向血管局部施用3滴10mg/ml利多卡因(再灌注后及再灌注后第30分鐘測(cè)試開放度后)。
兩側(cè)血管同時(shí)置于雙微血管夾中(S&T2V,S&T市場(chǎng)有限公司，Neuhausen，瑞士)，分離兩個(gè)夾子之間7mm動(dòng)脈片段。進(jìn)行縱向動(dòng)脈切開術(shù)(7mm)后使兩個(gè)夾子接近，血管復(fù)位后將血管腔翻轉(zhuǎn)弄平，暴露中膜的深層。用連續(xù)10-0單線尼龍縫線閉合動(dòng)脈切口(Ethilon 10-0BV-75-3,Ethicon有限公司，Edinburg，英國(guó))。全部手術(shù)操作由一名外科醫(yī)生用高質(zhì)操作顯微鏡(Wild M-650,Leica-Heerbrugg,Heerbrugg，瑞士)進(jìn)行。
通過(guò)打開血管夾使血管同時(shí)再灌注。迅速用鹽水浸透過(guò)的紗布蓋上，每分鐘檢查一次。記錄動(dòng)脈切開術(shù)出血完全終止的時(shí)間。
再灌注后30和120分鐘，用標(biāo)準(zhǔn)顯微外科空/滿(empty/refill)測(cè)試評(píng)價(jià)血管開放度用一對(duì)微彎鉗輕輕地在損傷面遠(yuǎn)端堵塞血管，用另一對(duì)彎鉗在下游騰空。釋放第一對(duì)彎鉗后，評(píng)價(jià)血管的再充滿，血管分類為開放的或閉合的。閉合的血管表現(xiàn)為不再充滿，而開放的血管表現(xiàn)為或快或慢的再充滿，后者被稱作“降低的開放度”。在最終的開放度測(cè)試后，切下血管并縱切開，移出血栓性物質(zhì)并稱量?；衔餄舛葹?.1mg/ml的重組化學(xué)性滅活的人因子Ⅶa(Ⅶai)或賦形劑以200ml/份貯存在編號(hào)的小瓶。實(shí)驗(yàn)方案
以如下的隨機(jī)雙盲法處理20只兔，每只兔用作其自身對(duì)照在如前述方法部分造成深動(dòng)脈損傷后，一只耳的暴露的損傷部位用Ⅶai溶液(總量為0.5mg)沖洗5分鐘，另一只耳用賦形劑處理。沖洗過(guò)的創(chuàng)面使之在另一個(gè)5分鐘過(guò)程中與溶液孵育，其后所有過(guò)量的溶液用等滲鹽水沖洗凈。閉合動(dòng)脈切口且再灌注血管。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用體征(Sign)測(cè)試、血栓重量及動(dòng)脈切開術(shù)出血數(shù)據(jù)等與Wilcoxon測(cè)試比較開放度結(jié)果。給出了雙邊(two-sided)P值。結(jié)果如開放率測(cè)試所得施用因子Ⅶai產(chǎn)生明顯的抗血栓形成作用。在因子Ⅶai組中，再灌注后第30分鐘血管開放度為85％，第120分鐘時(shí)為75％。在賦形劑組中的相應(yīng)值分別為40％和30％。此差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為P=0.008和P=0.004)。因子Ⅶai組中中等血栓重量為0.3mg，在賦形劑組中為0.5mg，雖然此差異并不顯著(P=0.19)。因子Ⅶai組中的中等動(dòng)脈切開術(shù)出血時(shí)間為1.5分鐘，在賦形劑組為2分鐘。兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(P=1)。
此實(shí)施例顯示在動(dòng)脈損傷位置局部施用因子Ⅶai可產(chǎn)生不引起出血傾向增加的抗血栓形成作用。這代表了用于預(yù)防由于手術(shù)、對(duì)血管的顯微手術(shù)、血管成形術(shù)或其他損傷造成的血栓綜合癥治療的高度有吸引力的模式。實(shí)施例ⅩⅧ因子Ⅶai的局部應(yīng)用減少血栓重量并增加開放度此實(shí)施例證實(shí)了化學(xué)性滅活的因子Ⅶa(因子Ⅶai)的局部應(yīng)用減少血栓重量并增加血管開放度。
20只麻醉的兔用于此實(shí)施例。松動(dòng)頸靜脈并在夾子之間分離10mm片段。通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的分離片段化學(xué)性(aetoxysclerol)破壞以及在該片段尾側(cè)半限制性結(jié)扎的聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)入血栓。在雙盲法中，一側(cè)用0.5mg化用基團(tuán))。
當(dāng)式Ⅰ肽衍生物含有式Ⅲ、Ⅳ、Ⅳa或Ⅴ的基團(tuán)時(shí)，式Ⅲ中的Ra和Ⅳ和Ⅳa中的Rb以及式Ⅴ中的Rz為烷基時(shí)，它們的具體有用基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基和異丙基。在含有式Ⅲ、Ⅲa、Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ或Ⅴa基團(tuán)的肽衍生物中，最好是含有式Ⅲa基團(tuán)的肽衍生物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選方面包括含有精氨酸殘基的式Ⅰ肽衍生物，特別是其中AA1或AA2為精氨酸的化合物(諸如部分序列AA1-AA2-AA3為Ala-Arg-Ala或Arg-Ala-Ala的化合物)。
特別感興趣的本發(fā)明的肽衍生物包括例如下文所附的實(shí)施例中提出的具體實(shí)施方案。其中實(shí)施例3和6的肽衍生物特別重要，這些化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為本發(fā)明的其它特征被提供。(SEQ ID NO:3)

實(shí)施例3注射入左心房)處理的組。危險(xiǎn)面積、梗死尺寸和不復(fù)流現(xiàn)象的評(píng)價(jià)為評(píng)價(jià)在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)組織灌注的分布(“不復(fù)流”現(xiàn)象，NR)，通過(guò)左心房導(dǎo)管向動(dòng)物注射6％的硫黃素S溶液(1mg/kg)。為獲得梗死危險(xiǎn)面積的評(píng)估，注射硫黃素后立即將冠狀動(dòng)脈再閉合，并通過(guò)左心房導(dǎo)管注射入單星藍(lán)(E.I.DuPont；1mg/kg)溶液。立即切割心臟，將左心室從全部其他結(jié)構(gòu)中切出并稱重。左心室在-70℃冷凍30分鐘，并以平行于房室溝方向切成8～10片。正常灌注的心肌輪廓以及危險(xiǎn)的面積均根據(jù)單星藍(lán)的分布描繪于一個(gè)透明的塑料片上。再在紫外光下觀察心肌切片，按照硫黃素的分布正常灌注心肌的(熒光)則可明顯地與缺血性心肌(無(wú)熒光)區(qū)分開來(lái)。這些區(qū)域也描繪于透明塑料片上。將切片37℃下再孵育在2％氯化三苯基四唑溶液(TTC,Sigma)中10分鐘，以觀察壞死的面積。再次用透明塑料片描繪正常心肌(TTC-陽(yáng)性)和梗死心肌(TTC-陰性)的輪廓。
計(jì)算下列變量1)在再灌注期終點(diǎn)評(píng)價(jià)梗死危險(xiǎn)面積占左心室的百分比(單星藍(lán)分布)(AR)；2)依TTC染色標(biāo)準(zhǔn)梗死尺寸(IS)占實(shí)際發(fā)展為壞死的面積的百分比；3)再灌注期終點(diǎn)不接受血流的危險(xiǎn)面積的百分?jǐn)?shù)(不復(fù)流現(xiàn)象，NR)。局部心肌血流的測(cè)量每處理組中的每只兔均測(cè)量局部心肌血流(RMBF)。不同顏色的塑料微球(蘭、紅和黃色，triton Technology,San Diego,CA)用于測(cè)量閉塞后20分鐘、再灌注后10分鐘和5小時(shí)的RMBF。
微球尺寸為15±1μ，懸浮于含0.01％Tween80的10％葡聚糖溶液中。在即將使用前用超聲波浴超聲微球5分鐘，以保證充分分散。將約500,000個(gè)微球(總體積0.5～1.0ml)注射入左心室導(dǎo)管。在微球注射前1分鐘，參比動(dòng)脈血流開始減少且注射后持續(xù)1分鐘。取自缺血性區(qū)域中央及取自非缺血性區(qū)域的組織樣品(100～300mg)按TTC染色。按制造商指示，再通過(guò)在72℃下于4M KOH溶液中消化3小時(shí)從組織中回收微球，并通過(guò)在室溫下于16M KOH溶液中消化后再經(jīng)過(guò)微孔過(guò)濾，從參比血樣中回收微球。按照制造商指示，從已知體積的溶劑(二甲基甲酰胺)中回收染料，用分光光度計(jì)在可見光波長(zhǎng)測(cè)定每種染色的濃度。每種染料溶液的組合光譜通過(guò)一種矩陣轉(zhuǎn)換技術(shù)分解成單組分光譜。用下式計(jì)算每個(gè)心肌樣品中的血流RMBF=Fr×Am/Ar，其中RMBF=每分鐘心肌血流的毫升(ml/min)，AM=心肌樣品的吸光度，及AR=參比血液樣品的吸光度。用樣品濕重除心肌血流，表示為ml/min/g。凝血研究為測(cè)定因子Ⅶai和因子Ⅶa施用對(duì)系統(tǒng)性凝血的作用，在基線和藥物施用后30分鐘測(cè)量凝血酶原時(shí)間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)。在0.5ml檸檬酸鈉中(3.8％)收集血液樣品(4.5ml)，4℃下離心(2000g)10分鐘以分離血漿。從血液收集時(shí)2小時(shí)之內(nèi)重復(fù)測(cè)定PT和aPTT。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以平均值±SD表示結(jié)果。變量分析用于組間的多重比較。對(duì)于帶Bonferroni修正的不成對(duì)觀察用學(xué)生t-檢驗(yàn)測(cè)試單個(gè)組之間的差異。為比較組之間的血液動(dòng)力學(xué)變量及局部心肌血流，采用了帶有用于重復(fù)測(cè)量的設(shè)計(jì)的雙路(2-way)變量分析。結(jié)果手術(shù)處理28只兔；在分配到處理組之前兩只兔在冠狀動(dòng)脈閉合過(guò)程中由于室顫死亡，另外兩只兔子在再灌注過(guò)程中死亡(一個(gè)為對(duì)照組，另一只在用因子Ⅶa處理過(guò)的組)。這些動(dòng)物從后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析中排除去。因此，研究中每個(gè)處理組中含有8只動(dòng)物。血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量在所有處理組之中，冠狀動(dòng)脈閉塞引起心率和平均動(dòng)脈壓力略有下降。在實(shí)驗(yàn)期間的過(guò)程中三組動(dòng)物在心率和平均動(dòng)脈壓力上未發(fā)現(xiàn)差異(表1)。危險(xiǎn)面積、梗死尺寸和不復(fù)流現(xiàn)象的評(píng)價(jià)
通過(guò)單星藍(lán)在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的注射所評(píng)價(jià)的由冠狀動(dòng)脈閉合產(chǎn)生的梗死危險(xiǎn)面積在三個(gè)治療組中相似(在對(duì)照、因子Ⅶai和因子Ⅶa處理過(guò)的動(dòng)物中分別為左心室的31.6±6.3％，28.2±4.1％和29.2±5.3％,P=NS)。
在冠狀動(dòng)脈閉塞30分鐘后和再灌注5.5小時(shí)后，對(duì)照組中向壞死發(fā)展的危險(xiǎn)面積的值平均為59.8±12.8％(圖7)。因子Hai的施用將梗死尺寸明顯減少到危險(xiǎn)面積的28.1±11.3％,P＜0.01，使用ANOVA(圖1)，而施用因子Ⅶa則與梗死尺寸明顯增加到危險(xiǎn)面積的80.1±13.1％相關(guān)(P＜0.01，相對(duì)于對(duì)照和用因子Ⅶai處理過(guò)的兔，圖7)。
在對(duì)照兔中，24.4±2.7％的危險(xiǎn)面積顯示有灌注缺陷，如在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)用硫黃素S的分布所測(cè)定(不復(fù)流現(xiàn)象)。此不復(fù)流面積的范圍分別由因子Ⅶai明顯減少到危險(xiǎn)面積的11.1±6.1％，由因子Ⅶ明顯增加到危險(xiǎn)面積的61.9±13.8％(P＜0.01，圖8)。
前面的研究表明在缺血后再灌注過(guò)程中顯示有灌注缺陷的心肌組織的量與多種參數(shù)相關(guān)；最重要的為危險(xiǎn)面積的范圍，梗死尺寸的大小及在閉塞過(guò)程中殘余伴隨血流的量。這些變量的控制使得對(duì)不復(fù)流現(xiàn)象的干預(yù)作用有更為精確的評(píng)價(jià)。在本研究中，將對(duì)照兔中不復(fù)流面積與這些參數(shù)相關(guān)聯(lián)時(shí)，觀察到有密切關(guān)系，其符合一多元線性回歸方程N(yùn)R(占左心室(LV)的％)=-14.62+0.75(AR)+0.07(IS)+3.69(RMBF)；R2=0.98；F檢驗(yàn)=109.3,(0.37)(0.3)(3.69)，其中NR為不復(fù)流面積，AR為危險(xiǎn)面積，RMBF為伴隨血流(ml/min/g)。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字顯示相關(guān)系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。r2值為0.98的此模型歸因于本研究觀察的對(duì)照動(dòng)物中＞95％的不復(fù)流面積變量。
獲自對(duì)照兔數(shù)據(jù)的多元線性回歸方程中的方程相關(guān)系數(shù)用于計(jì)算每干預(yù)組中單個(gè)動(dòng)物的預(yù)期不復(fù)流面積(圖9)。接受因子Ⅶai的兔子中實(shí)際觀察到的不復(fù)流的面積比應(yīng)用獲自多元回歸分析的方程計(jì)算的預(yù)期值小。實(shí)際上，在用因子Ⅶai處理過(guò)的兔中，任何實(shí)際觀察值小于其給定的預(yù)期不復(fù)流面積，即此組中全部動(dòng)物的值分布在獲自對(duì)照動(dòng)物的回歸線下方(圖9)。相反，用因子Ⅶa處理過(guò)的兔有正相反的顯示，即對(duì)于任何給定的預(yù)期不復(fù)流面積，實(shí)際觀察值明顯更大，此組中動(dòng)物分布在對(duì)照動(dòng)物的回歸線上(圖9)。綜上，這些數(shù)據(jù)顯示在因子Ⅶai處理過(guò)的動(dòng)物中觀察到的不復(fù)流現(xiàn)象的減少不完全是梗死面積減少造成的，這提示在缺血后再灌注過(guò)程中外源性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活對(duì)不復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生有作用。局部心肌血流的測(cè)量在對(duì)照動(dòng)物中，貫穿研究中的非缺血性心肌的RMBF平均為1.20ml/min/克組織(數(shù)據(jù)未給出)。在同一組動(dòng)物中，對(duì)缺血性心肌的RMBF在冠狀動(dòng)脈閉塞后20分鐘、灌注后10分鐘及5小時(shí)分別為0.08±0.02,1.43±0.28和0.98±0.19ml/min/克組織。與對(duì)照動(dòng)物相比本研究中所用的不同藥物在實(shí)驗(yàn)期間并不明顯改變無(wú)論是正常心肌還是在缺血性心肌中的RMBF(圖10)。凝血研究為了研究因子Ⅶai可能的系統(tǒng)性作用(可以誘發(fā)出血危險(xiǎn)的增加)，測(cè)量在第30分鐘的CFV收集的及在因子Ⅶa和因子Ⅶai施用后收集的血液樣品中的PT和aPTT。在30分鐘CFV期終止時(shí)，PT和aPTT平均分別為8.2±0.6秒和25±3秒。在因子Ⅶai施用后觀察到PT略微增加到10.1±0.6秒(圖11)。然而，這種增加，沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性(使用ANOVA)及帶有Bonferronis修正的學(xué)生t-檢驗(yàn)，P=0.09)。在因子Ⅶai施用后aPTT無(wú)明顯改變(圖10)。僅就因子Ⅶai施用后所獲的值而言，因子Ⅶa的施用導(dǎo)致PT和aPTT的明顯縮短(圖11)。
表1冠狀動(dòng)脈閉塞-再灌注過(guò)程中的血液動(dòng)力學(xué)變量


<p>表2冠狀動(dòng)脈閉合及再灌注過(guò)程中局部心肌血流(ml/min/克組織)

CAO=冠狀動(dòng)脈閉塞；REP=再灌注實(shí)施例ⅩⅨ因子Ⅶai的應(yīng)用減少梗死尺寸及梗死的危險(xiǎn)面積在冠狀動(dòng)脈血管系統(tǒng)中發(fā)生在缺血后心肌再灌注過(guò)程中的組織因子暴露導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈中血流的下降。
為鑒定組織因子暴露是否通過(guò)對(duì)凝血的活化及減少缺血后再灌注過(guò)程中冠狀動(dòng)脈血流來(lái)對(duì)心肌損傷有作用，將新西蘭白兔先經(jīng)過(guò)30分鐘冠狀動(dòng)脈閉塞后再經(jīng)過(guò)5.5小時(shí)的再灌注。再灌注時(shí)，動(dòng)物隨機(jī)的接受鹽水(n=8)；人重組活性位點(diǎn)封閉的因子Ⅶa(因子Ⅶai,100μg/kg/min注入左心房10分鐘，n=8)或人重組活化的因子Ⅶa(因子Ⅶa100μg/kg/min注入左心房10分鐘，n=8)。用彩色微球在缺血20分鐘及再灌注10分鐘和2小時(shí)后測(cè)量局部心肌血流(RMBF)。在實(shí)驗(yàn)終止時(shí)通過(guò)單星藍(lán)和硫黃素的分布以及通過(guò)TTC染色測(cè)定梗死危險(xiǎn)面積(AR)，梗死尺寸(IS)和不復(fù)流面積(NR)。與對(duì)照相比，因子Ⅶa導(dǎo)致IS和NR的明顯減少(分別為AR值的28.1±11.3％和11.1±6.1％，對(duì)應(yīng)AR值的59.8±12.8％和24.4±8.2％P＜0.01)，而與對(duì)照相比，因子Ⅶa導(dǎo)致在IS和NR上的顯著增加，分別為AR的80.1±13.1％和61.9±13.8％P＜0.01)。在各組中血壓、心率、AR及缺血20分鐘的RMBF均未觀察到差異。在因子Ⅶai處理過(guò)的動(dòng)物中再灌注2,小、時(shí)時(shí)RMBF明顯要高，而在因子Ⅶa處理過(guò)的兔中較低。因此，由TF介導(dǎo)的凝血活性對(duì)在缺血后再灌注過(guò)程中發(fā)生的心肌損傷有重要貢獻(xiàn)

AR=梗死危險(xiǎn)面積；IS=梗死尺寸(IS)；NR=不復(fù)流面積雖然上述發(fā)明已用闡明的方式和意在澄清理解的實(shí)施例進(jìn)行了某種程度的詳述，顯然地，可以在附屬的權(quán)利要求范圍之內(nèi)進(jìn)行特定的改變和修飾。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Zymo Genetics和Novo Nordisk A/S(ⅱ)發(fā)明名稱修飾過(guò)的因子Ⅶ(ⅲ)序列數(shù)目4(ⅳ)相關(guān)地址(A)收信人Novo Nordisk A/S，共同專利(B)街道Novo Alle(C)城市DK-2880 Bagsvaerd(D)國(guó)家丹麥(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.24(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)遞交日(C)分類，(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/475,845(B)遞交日1995年6月7日(C)分類(2)SEQ ID 1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度2422堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置28..1420(D)其它信息密碼子起始=28產(chǎn)物=因子Ⅶ(ⅵ)SEQ ID 1的序列描述CCTCCCGACA ATACAGGGGC AGCACTGCAG AGATTTCATC ATG GTC TCC CAG GCC55Met Val Ser Gln Ala-38 -35CTC AGG CTC CTC TGC CTT CTG CTT GGG CTT CAG GGC TGC CTG GCT GCA103Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala-30 -25 -20GTC TTC GTA ACC CAG GAG GAA GCC CAC GGC GTC CTG CAC CGG CGC CGG151Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg-15 -10 -5CGC GCC AAC GCG TTC CTG GAG GAG CTG CGG CCG GGC TCC CTG GGG AGG199Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg1 5 10 15GAG TGC AAG GAG GAG CAG TGC TCC TTC GAG GAG GCC CGG GAG ATC TTC247Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe20 25 30AAG GAC GCG GAG AGG ACG AAG CTG TTC TGG ATT TCT TAC AGT GAT GGG295Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly35 40 45GAC CAG TGT GCC TCA AGT CCA TGC CAG AAT GGG GGC TCC TGC AAG GAC343Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp50 55 60CAG CTC CAG TCC TAT ATC TGC TTC TGC CTC CCT GCC TTC GAG GGC CGG391Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg65 70 75AAC TGT GAG ACG CAC AAG GAT GAC CAG CTG ATC TGT GTG AAC GAG AAC439Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn80 85 90 95GGC GGC TGT GAG CAG TAC TGC AGT GAC CAC ACG GGC ACC AAG CGC TCC487Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser100 105 110TGT CGG TGC CAC GAG GGG TAC TCT CTG CTG GCA GAC GGG GTG TCC TGC535Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys115 120 125ACA CCC ACA GTT GAA TAT CCA TGT GGA AAA ATA CCT ATT CTA GAA AAA583Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys130 135 140AGA AAT GCC AGC AAA CCC CAA GGC CGA ATT GTG GGG GGC AAG GTG TGC631Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys145 150 155CCC AAA GGG GAG TGT CCA TGG CAG GTC CTG TTG TTG GTG AAT GGA GCT679Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala160 165 170 175CAG TTG TGT GGG GGG ACC CTG ATC AAC ACC ATC TGG GTG GTC TCC GCG727Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala180 185 190GCC CAC TGT TTC GAC AAA ATC AAG AAC TGG AGG AAC CTG ATC GCG GTG775Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val195 200 205CTG GGC GAG CAC GAC CTC AGC GAG CAC GAC GGG GAT GAG CAG AGC CGG823Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg210 215 220CGG GTG GCG CAG GTC ATC ATC CCC AGC ACG TAC GTC CCG GGC ACC ACC871Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr225 230 235AAC CAC GAC ATC GCG CTG CTC CGC CTG CAC CAG CCC GTG GTC CTC ACT919Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr240 245 250 255GAC CAT GTG GTG CCC CTC TGC CTG CCC GAA CGG ACG TTC TCT GAG AGG967ASD His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg260 265 270ACG CTG GCC TTC GTG CGC TTC TCA TTG GTC AGC GGC TG3 GGC CAG CTG 1015Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu275 280 285CTG GAC CGT GGC GCC ACG GCC CTG GAG CTC ATG GTC CTC AAC GTG CCC 1063Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro290 295 300Cgg CTG ATG ACC CAG GAC TGC CTG CAG CAG TCA CGG AAG GTG GGA GAC 1111Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp305 310 315TCC CCA AAT ATC ACG GAG TAC ATG TTC TGT GCC GGC TAC TCG GAT GGC 1159Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly320 325 330 335AGC AAG GAC TCC TGC AAG GGG GAC AGT GGA GGC CCA CAT GCC ACC CAC 1207Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His340 345 350TAC CGG GGC ACG TGG TAC CTG ACG GGC ATC GTC AGC TGG GGC CAG GGC 1255Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly355 360 365TGC GCA ACC GTG GGC CAC TTT GGG GTG TAC ACC AGG GTC TCC CAG TAC 1303Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr370 375 380ATC GAG TGG CTG CAA AAG CTC ATG CGC TCA GAG CCA CGC CCA GGA GTC 1351Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Giy Val385 390 395CTC CTG CGA GCC CCA TTT CCC TAG C CCAGCAGCCC TGGCCTGTGG 1396Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro400 405AGAGAAAGCC AAGGCTGCGT CGAACTGTCC TGGCACCAAA TCCCATATAT TCTTCTGCAG 1456TTAATGGGGT AGAGGAGGGC ATGGGAGGGA GGGAGAGGTG GGGAGGGAGA CAGAGACAGA 1516AACAGAGAGA GACAGAGACA GAGAGAGACT GAGGGAGAGA CTCTGAGGAC ATGGAGAGAG 1576ACTCAAAGAG ACTCCAAGAT TCAAAGAGAC TAATAGAGAC ACAGAGATGG AATAGAAAAG 1636ATGAGAGGCA GAGGCAGACA GGCGCTGGAC AGAGGGGCAG GGGAGTGCCA AGGTTGTCCT 1696GGAGGCAGAC AGCCCAGCTG AGCCTCCTTA CCTCCCTTCA GCCAAGCCCC ACCTGCACGT 1756GATCTGCTGG CCCTCAGGCT GCTGCTCTGC CTTCATTGCT GGAGACAGTA GAGGCATGAA 1816CACACATGGA TGCACACACA CACACGCCAA TGCACACACA CAGAGATATG CACACACACG 1876GATGCACACA CAGATGGTCA CACAGAGATA CGCAAACACA CCGATGCACA CGCACATAGA 1936GATATGCACA CACAGATGCA CACACAGATA TACACATGGA TGCACGCACA TGCCAATGCA 1996CGCACACATC AGTGCACACG GATGCACAGA GATATGCACA CACCGATGTG CGCACACACA 2056GATATGCACA CACATGGATG AGCACACACA CACCAAGTGC GCACACACAC CGATGTACAC 2116ACACAGATGC ACACACAGAT GCACACACAC CGATGCTGAC TCCATGTGTG CTGTCCTCTG 2176AAGGCGGTTG TTTAGCTCTC ACTTTTCTGG TTCTTATCCA TTATCATCTT CACTTCAGAC 2236AATTCAGAAG CATCACCATG CATGGTGGCG AATGCCCCCA AACTCTCCCC CAAATGTATT 2296TCTCCCTTCG CTGGGTGCCG GGCTGCACAG ACTATTCCCC ACCTGCTTCC CAGCTTCACA 2356ATAAACGGCT GCGTCTCCTC CGCACACCTG TGGTGCCTGC CACCCAAAAA AAAAAAAAAA 2416AAAAAA2422(2)SEQ ID 2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度444氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅵ)SEQ ID 2的序列描述Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Trp Leu Leu Leu Gly Leu Gln-38 -35 -30 -25Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val-20 -15 -10Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro-5 1 5 10Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu15 20 25Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile30 35 40Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly45 50 55Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr lle Cys Phe Cys Leu Pro60 65 70Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile75 80 85 90Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr95 100 105Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala110 115 120Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile125 130 135Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val140 145 150Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu155 160165 170Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile175 180 185Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg190 195 200Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly205 210 215Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr220 225 230Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln235 240 245 250Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg255 260 265Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser270 275 280Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met285 290 295Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser300 305 310Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lle Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala315 320 325 330Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly335 340 345Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val350 355360Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr365 370375Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu380 385390Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro395 400 405(2)SEQ ID 3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅵ)SEQ ID 3的序列描述TGGGCCTCCG GCGTCCCCCT T21(2)SEQ ID 4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)否(ⅳ)反義否(ⅵ)SEQ ID 4的序列描述TCCCAGTCAC GACGT 1權(quán)利要求
1．一種抑制病人血栓形成的方法，其包括在病人易于形成血栓的血管位置局部施用治療有效劑量的一種組合物，此組合物含有在其催化中心中至少有一種修飾的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
2．一種如權(quán)利要求1的方法，其中的修飾包括因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。
3．一種如權(quán)利要求2的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。
4．一種如權(quán)利要求3的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮、Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮、Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮。
5．如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中的血栓形成位置與手術(shù)、顯微手術(shù)、血管成型術(shù)或創(chuàng)傷相關(guān)。
6．一種用于維持或改善病人血管開放度的方法，其包括向易于減小開放度的血管位置局部施用治療有效劑量的一種組合物，此組合物含有在其催化中心中至少有一種修飾的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅶ的能力。
7．一種如權(quán)利要求6的方法。其中的修飾包括因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。
8．一種如權(quán)利要求7的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。
9．一種如權(quán)利要求8的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮、Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮、Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮。
10．如權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)的方法，其中的開放度減小的位置與手術(shù)、顯微手術(shù)、血管在型術(shù)或創(chuàng)傷相關(guān)。
11．在其催化中心中至少有一種修飾過(guò)的因子Ⅶ用于制造用來(lái)防止或減少與缺血后再灌注相關(guān)的心肌損傷的組合物的用途，其中的修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
12．如權(quán)利要求16的用途，其中的修飾包括因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。
13．如權(quán)利要求17的用途，其中的蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。
14．如權(quán)利要求18的用途，其中的蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮、Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮、Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮。
15．如權(quán)利要求16-19的用途，其中的心肌損傷是心肌壞死。
16．一種用于防止或減少個(gè)體中與缺血后再灌注相關(guān)的心肌損傷的方法，包括向個(gè)體施用一種組合物，此組合物含有一種在其催化中心中至少有一種修飾的藥學(xué)可接受的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
17．如權(quán)利要求21的方法，其中的修飾包括因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。
18．如權(quán)利要求22的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。
19．一種如權(quán)利要求23的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮、Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮、Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮。
20．如權(quán)利要求21-24的方法，其中的心肌損傷是心肌壞死。
21．在其催化中心中至少有一種修飾的因子Ⅶ用于制造用來(lái)改善在缺血后再灌注過(guò)程中局部心肌血流的組合物的用途，其中的修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅸ的能力。
22．如權(quán)利要求26的用途，其中的修飾包括因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。
23．如權(quán)利要求27的用途，其中的蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。
24．一種如權(quán)利要求28的用途，其中的蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮、Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮、Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮。
25．一種用于改善個(gè)體在缺血后再灌注過(guò)程中局部心肌血流的方法，包括向個(gè)體施用一種組合物，此組合物含有一種在其催化中心中至少有一種修飾的藥學(xué)可接受的因子Ⅶ，此修飾基本上抑制了修飾過(guò)的因子Ⅶ激活血漿因子Ⅹ或Ⅶ的能力。
26．如權(quán)利要求30的方法，其中的修飾包括因子Ⅶ與絲氨酸蛋白酶抑制劑的反應(yīng)。
27．如權(quán)利要求31的方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種有機(jī)磷化合物，一種氟化硫，一種肽鹵甲基酮或一種氮雜肽。
28一種如權(quán)利要求32方法，其中的蛋白酶抑制劑是一種選自Dansyl-Phe-Pro-Arg氯甲基酮、Dansyl-Glu-Gly-Arg氯甲基酮、Dansyl-Phe-Phe-Arg氯甲基酮和Phe-Phe-Arg氯甲基酮中的肽鹵甲基酮。
全文摘要
因子Ⅶ的催化活性位點(diǎn)經(jīng)修飾產(chǎn)生一種能有效地阻斷血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)的化合物。這些修飾使因子Ⅶa基本上不能激活血漿因子X(jué)或Ⅸ。本發(fā)明涉及一種新治療方法以及修飾過(guò)的因子Ⅶ用于預(yù)防和治療與缺血后再灌注相關(guān)的心肌損傷,用于改善再灌注過(guò)程中局部心肌血流以及用于維持或改善病人的血管開放度的用途,以及在血管易于形成血栓處修飾過(guò)的因子Ⅶ的局部應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1221427SQ9719529
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者L·C·彼特森, C·E·哈特, U·赫德內(nèi), M·E·拉斯穆森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司, 津莫吉尼蒂克斯