交配因子α原肽變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可用于在酵母中重組表達(dá)包含GLP?1肽的多肽的交配因子α原肽變體。本發(fā)明還涉及用于在酵母中表達(dá)多肽的DNA序列、載體和宿主細(xì)胞。
【專利說明】
交配因子α原化變體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，其中通過在酵母中重組表達(dá)而 制備多膚。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組多膚表達(dá)技術(shù)使得能夠產(chǎn)生大量的由于例如其生物活性而可使用的所需多 膚。運(yùn)樣的多膚通常在微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)為重組融合多膚。感興趣的多膚常常連接至 融合伴侶多膚，W便提高表達(dá)水平、促進(jìn)分泌、增加溶解度、促進(jìn)多膚折疊，W保護(hù)該多膚免 遭非故意的蛋白水解或促進(jìn)感興趣的多膚的純化。
[0003] 為了確保從酵母中分泌重組表達(dá)的多膚，前原膚(pre-pro peptide)(通常被稱為 "前導(dǎo)序列"）通常融合至重組產(chǎn)物的N-末端。該前序列確保融合蛋白轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)化R)內(nèi)， ER是分泌途徑的起點(diǎn)。該原序列確保從ER進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，在高爾基體中，被稱為 Kex化的內(nèi)源性蛋白酶通常用來切下該原序列。經(jīng)處理的重組膚隨后分泌至生長培養(yǎng)基，從 該培養(yǎng)基中可W純化該重組膚。
[0004] 當(dāng)分泌重組多膚時(shí)，來自交配因子a(Mating化ctor A1地a)的前原序列通常用作 前導(dǎo)序列。然而，許多其他序列能夠促進(jìn)分泌過程。前導(dǎo)序列不僅對(duì)所分泌的膚的量，而且 對(duì)有關(guān)降解和翻譯后修飾如0-糖基化的質(zhì)量具有重要影響。由于降解和0-糖基化通常是不 希望的事件，因此期望一種將運(yùn)些修飾減少至最低可能的程度，并且同時(shí)使分泌的多膚的 產(chǎn)率最大化的前導(dǎo)序列。
[0005] EP 0121884 A2描述了使用酵母α-因子在釀酒酵母(s.cerevisiae)中重組生產(chǎn)人 膜島素。
[0006] EP 0324274A1描述了使用截短的α-因子前導(dǎo)序列改善異源蛋白質(zhì)在酵母中的表 達(dá)和分泌。
[0007] Thim等人(PNAS 83(1986)6766-6770)描述了使用交配因子α在釀酒酵母中分泌和 加工膜島素前體。
[000引 W095/34666描述了用于在釀酒酵母中產(chǎn)生分泌的多膚的合成前導(dǎo)序列。
[0009] Rakestraw 等人(Biotech.Bioeng. 103(2009)1192-1201)描述了突變的交配因子曰 前導(dǎo)序列，它增加單鏈抗體的分泌并且增加人IgGl在釀酒酵母中的產(chǎn)生水平。
[0010] 需要增加多膚前體的產(chǎn)率并減少0-糖基化的重組多膚的比例的更加特異性的前 導(dǎo)序列。尤其需要用于在酵母中表達(dá)GLP-1膚的前導(dǎo)序列，該前導(dǎo)序列增加 GLP-1膚或其前 體的產(chǎn)率并減少化P-1膚的0-糖基化。運(yùn)樣更加特異性的前導(dǎo)序列可W促進(jìn)更高產(chǎn)率的重 組多膚W及更低量的0-糖基化雜質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有提高的異源多膚表達(dá)水平的酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供分泌重組多膚的酵母細(xì)胞，該重組多膚具有減少量的該重組多膚的0-糖基 化變體。特別地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有提高的重組多膚表達(dá)水平和減少的ο-糖基 化變體量的酵母細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于在酵母細(xì)胞中重組表達(dá)化Ρ-1膚的改 善的表達(dá)系統(tǒng)。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于在酵母中重組表達(dá)包含化Ρ-1膚的多膚 的方法，其包括培養(yǎng)包含編碼該多膚上游的加工和分泌信號(hào)的DNA序列的酵母菌株，其中所 述加工和分泌信號(hào)包含在位置38-42處的VIG化序列中具有至少一個(gè)置換從而包含通式(I) 的氨基酸序列的交配因子α原膚變體：
[OOU] X38-X39-X40-X4廣X42(SEQ ID N0:1) (I)
[0014] 其中
[0015] X38 是F、L、I或V;
[0016] X39是L、I、V或Μ;
[0017] Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[001 引 Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0019] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0020] 條件為 X38-X42 不是 VIGYS。
[0021] 在用于在酵母中重組表達(dá)多膚的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述交配因子α原膚變 體在位置38-42處的VIGYL序列中具有至少一個(gè)置換，從而包含通式(I)的氨基酸序列：
[002。 Χ38-Χ39-Χ40-Χ4 廣 Χ42(Ι)
[002；3 ]其中 Χ38是V; Χ39是L、I、V或Μ; Χ40是G或R; Χ41是Υ，且Χ42是L。
[0024]在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于重組表達(dá)的多膚是GLP-1膚。
[00巧]在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于重組表達(dá)的多膚包含化P-1(7-37)[K34R]、化P-U9- 37)比34R]或GLP-1(9-37)比34R，G37K]。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了 一種交配因子α原膚變體，其在位置38-42處的 VIG化序列中具有至少一個(gè)置換，從而包含通式(I)的氨基酸序列：
[0027] Χ38-Χ39-Χ40-Χ41-Χ42 (I)
[002引 其中
[0029] Χ38 是F、L、I或V;
[0030] X39是L、I、V或M;
[0031] X40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[0032] X41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0033] X42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0034] 條件為 X38-X42 不是 VIGYS。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的第Ξ方面，提供了一種GLP-1前體，它是一種融合多膚，其包含：
[0036] -前膚（pre-peptide)，
[0037] -交配因子α原膚變體，其在位置38-42處的VIG化序列中具有至少一個(gè)置換，從而 包含通式(I)的氨基酸序列：
[003引 Χ38-Χ39-Χ40-Χ4廣X42(SEQ ID Ν0:1) (I)
[0039] 其中
[0040] X38 是F、L、I或V;
[0041 ] X39是L、I、V或Μ;
[0042] Χ40是4、6、5、6、9、￥少、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[0043] Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0044] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0045] 條件為 X38-X42 不是 VIGYS，
[0046] -任選的延伸膚，和
[0047] -GLP-1 多膚。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了編碼所述交配因子α原膚變體或化P-1前體的DNA 序列。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種表達(dá)載體，其包含編碼所述交配因子α原膚變 體或GLP-1前體的DNA序列。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了包含根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0051] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)的宿主細(xì)胞具有非功能性pmtl基因或根本不具有 pmtl基因。已驚人地發(fā)現(xiàn)，運(yùn)樣的宿主細(xì)胞除了由本發(fā)明的交配因子α原膚變體獲得的0-糖 基化多膚的量的降低外，還獨(dú)立于所述降低而降低0-糖基化多膚的量。
【附圖說明】
[(Κ)對(duì)圖1示出了如實(shí)施例1中使用的最小(minimal)表達(dá)質(zhì)粒。
[0053] 圖2示出了 N-末端延伸的化P-1(7-37)[K34R]前體，其包括野生型交配因子α前原 膚，指示出了原膚的VIG化亞序列。
【具體實(shí)施方式】
[0054] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于在酵母中重組表達(dá)多膚的方法，其包括 培養(yǎng)包含編碼該多膚上游的加工和分泌信號(hào)的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌 信號(hào)包含在位置38-42處的VIG化序列中具有至少一個(gè)置換從而包含通式(I)的氨基酸序列 的交配因子α原膚變體：
[005引 Χ38-Χ39-Χ40-Χ4廣X42(SEQ ID Ν0:1) (I)
[0056] 其中
[0化7] X38 是F、L、I或V;
[0化引 X39是L、I、V或Μ;
[0化9] Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[0060] Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0061] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0062] 條件為 X38-X42 不是 VIGYS。
[0063] 如本文所用的術(shù)語"前導(dǎo)序列"意在表示由前膚(信號(hào)膚)和原膚組成的氨基酸序 列。前導(dǎo)序列的非限制性實(shí)例是例如來自釀酒酵母的α-因子信號(hào)前導(dǎo)序列和W095/34666中 所述的用于酵母的合成前導(dǎo)序列。
[0064] 如本文所用的"前膚"意在表示作為Ν-末端序列存在于待表達(dá)的多膚的前體形式 上的信號(hào)膚。信號(hào)膚的功能是在宿主細(xì)胞中促進(jìn)多膚轉(zhuǎn)位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。信號(hào)膚通常在該過 程期間被切下。信號(hào)膚可w與產(chǎn)生該多膚的宿主細(xì)胞是異源或同源的。
[0065] 如本文所用的"原膚"意在表示功能是使表達(dá)的多膚從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被引導(dǎo)至高爾基體 并進(jìn)一步引導(dǎo)至分泌小泡W便分泌至培養(yǎng)基中（即，多膚跨過細(xì)胞壁或至少通過細(xì)胞膜輸 出至酵母細(xì)胞的壁膜間隙內(nèi)）的膚序列。原膚的非限制性實(shí)例是酵母α-因子原膚（參見US 4,546,082和4,870,008)和在115 5,395,922、5,795,746、5，162,498和胖0 98/32867中公開 的合成原膚。原膚將優(yōu)選在C-末端含有內(nèi)膚酶加工位點(diǎn)，如Lys-A巧序列或其任何功能類似 物。
[0066] 如本文所用的術(shù)語"交配因子α"(Μ化、Μ化或MFalpha)意在表示釀酒酵母前原序 列，其在結(jié)構(gòu)MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTT邸ETAQIPAEAV化YU3LEGD抑VAVUFSNSTNNGLLFI NTTIASIAAKEEGVSLDKR(SEQ ID ^:2)中包含作為氨基酸殘基1-19的交配因子〇前膚和作為 氨基酸殘基20-85的交配因子α原膚。
[0067] 交配因子α包含作為氨基酸殘基38-42的序列VIG化(SEQ ID NO: 3)。交配因子α的 變體已用于多膚的重組表達(dá)，其在交配因子α序列中包含作為氨基酸殘基38-42的序列 VIGYS(SEQ ID N0:4)〇
[0068] 在本文中，術(shù)語"多膚"、"蛋白質(zhì)"和1太"可W可互換地使用，W表示多膚。應(yīng)當(dāng)理 解，所使用的具體術(shù)語對(duì)于分子的大小沒有限制(除非在特定的情況下直接說明）。
[0069] 通常根據(jù)按照IUPAC命名法的單字母縮寫來指定氨基酸殘基，例如，D表示天冬氨 酸(Asp)而G表示甘氨酸。然而，在一些情況下也使用相應(yīng)的Ξ字母縮寫。
[0070] 如本文所用的"遺傳編碼的氨基酸"意在表示由W下氨基酸組成的組:G、P、A、V、L、 I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S、TW及它們的任何生物學(xué)修飾。運(yùn)類生物學(xué)修飾的非限制 性實(shí)例是例如酷胺化、糖基化和二硫鍵形成。
[0071] 如本文所用的"類似物"意在表示通過一個(gè)或多個(gè)來自參考多膚的氨基酸殘基的 置換、缺失和/或添加而從參考多膚衍生的多膚。GLP-1 (7-37)(SEQ ID NO:5)的類似物的非 限制性實(shí)例是殘基34已被精氨酸殘基置換的化P-U7-37)比34RKSEQ ID N0:6)和殘基34 已被精氨酸殘基置換并且氨基酸殘基7-8已經(jīng)缺失的化P-1(9-37)[K34R](SEQ ID N0:7) (采用針對(duì)GLP-1膚的氨基酸殘基的常用編號(hào)）。
[0072] 如本文所用的關(guān)于多膚的"變體"意在表示該多膚的化學(xué)變體，其保留與原始蛋白 質(zhì)基本相同的主要功能。因此，變體通常是多膚的修飾形式，其中引入使修飾的多膚獲得一 些期望的性質(zhì)、同時(shí)保留原始多膚的基本相同的主要功能所需的盡可能少的修飾。多膚變 體的非限制性實(shí)例是例如延伸的多膚、截短的多膚、融合多膚和類似物。交配因子α原膚的 變體的一個(gè)非限制性實(shí)例是L42S-交配因子a(20-85)(SEQ ID N0:8)dGLP-1(7-37)的變體 的一個(gè)非限制性實(shí)例是GLP-1 (7-37)比34R]。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方案中，多膚的變體與未修飾的多膚相比包含1-2個(gè)氨基酸置換、缺失 或添加。在另一實(shí)施方案中，變體與未修飾的多膚相比包含1-5個(gè)氨基酸置換、缺失或添加。 在另一實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)的未修飾的多膚，變體包含1-15個(gè)氨基酸置換、缺失或添 加。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了 一種交配因子α原膚變體，其在位置38-42處的 VIG化序列中具有至少一個(gè)置換，從而包含通式(I)的氨基酸序列：
[007引 Χ38-Χ39-Χ40-Χ4廣X42(SEQ ID Ν0:1) (I)
[0076] 其中
[0077] X38 是F、L、I或V;
[007引 X39是L、I、V或Μ;
[00 巧]Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[0080] Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0081 ] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0082] 條件為X38-X42不是VIGYS。在一個(gè)實(shí)施方案中，交配因子α原膚變體不包含VIGYS、 VIDYS、VATYL、VIGYR 或 AIG 化作為 Χ38-Χ42。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明的第Ξ方面，提供了一種GLP-1前體，它是一種融合多膚，其包含：
[0084] -前膚，
[0085] -交配因子α原膚變體，其在位置38-42處的VIG化序列中具有至少一個(gè)置換，從而 包含通式(I)的氨基酸序列：
[0086] X38-X39-X4〇-X4i-X42(SEQ ID N0:1) (I)
[0087] 其中
[0088] X38 是F、L、I或V;
[0089] X39是L、I、V或Μ;
[0090] Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[0091] Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0092] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0093] 條件為 X38-X42 不是 VIGYS，
[0094] -任選的延伸膚，和
[0095] -GLP-1 膚。
[0096] 如本文所用的術(shù)語制^^-1膚"意在表示GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36)酷胺及其類似 物，它們能夠通過常規(guī)重組DNA技術(shù)W及常規(guī)合成方法產(chǎn)生。運(yùn)樣的化P-1膚包括但不限于 天然膜高血糖素樣膚-1，例如，如W0 87/06941中公開的包含化P-U7-37)和其功能性變體 的運(yùn)類膚片段；如W0 90/11296中公開的包含化P-1 (7-36)和其功能性衍生物的運(yùn)類膚片 段；如W0 91/11457中公開的活性化？-1膚7-：34、7-35、7-36和7-37的運(yùn)類類似物；如6口 0699686-A2中公開的化P-1的運(yùn)類N-末端截短片段；W及如EP 0708179-A2中公開的包含N- 末端咪挫基團(tuán)的運(yùn)類化P-1類似物和衍生物。GLP-1膚的非限制性實(shí)例是化P-1 (7-37)和 GLP-U7-37)比 34R]。
[0097] 如本文所用的術(shù)語"化P-1前體"意在表示包含延伸的化P-1膚的多膚，其中該延伸 用于促進(jìn)化P-1膚的分泌、表達(dá)或回收。GLP-1前體的實(shí)例可見于W003/010186和W009/ 083549中。GLP-1前體旨在包括具有小延伸例如2-5個(gè)氨基酸殘基的化P-1膚，W及具有包含 前膚和原膚的較長延伸的GLP-1膚。
[0098] 在用于在酵母中重組表達(dá)多膚的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述通式（I)的氨基酸 序列具有一種序列，其中
[0099] X38 是F、L或 V;
[0100] X39是L、I、V或M;
[0101] X40 是G或R;
[0102] X41是5、￥、1^、1、￥或1，并且
[0103] X42是￥、胖、1^、￥或1。
[0104] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一種序列，其中
[0105] X38是 I 或 V;
[0106] X39是L、I、V或M;
[0107] X40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[010引 X41是Y、F或W，并且
[0109] X42 是 L或 I。
[0110] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一種序列，其中
[0111] X38是 V;
[0112] X39是L、I、V或M;
[0113] X40 是G或R;
[0114] X41是Y，并且
[01 巧]X42 是L。
[0116] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一種序列，其中X40是R。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述通式(I)的氨基酸序列具有一種序列，其中X40是R，并且X42是L。
[0117] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述通式（I)的氨基酸序列具有一種序列，其中X38是V，X39 是I，X4Q是R，X"是Y，并且X42是L。
[0118] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組表達(dá)的多膚是化P-1膚或其變體，如化P-1 (7-37) 比34R]或GLP-1(9-37)比34R]。
[0119] 在一個(gè)實(shí)施方案中，重組表達(dá)的多膚具有N-末端延伸，即，位于交配因子α變體與 待產(chǎn)生的多膚之間。該延伸可促進(jìn)由宿主細(xì)胞表達(dá)或分泌所述多膚，或者它可保護(hù)所述多 膚的一部分免遭不期望的在Ν-末端的蛋白水解處理。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述Ν-末端延 伸是具有2-10個(gè)氨基酸殘基或具有約8至約200個(gè)氨基酸殘基的多膚。當(dāng)延伸用于促進(jìn)在宿 主細(xì)胞中表達(dá)多膚時(shí)，或當(dāng)延伸用于保護(hù)多膚免遭在Ν-末端的蛋白水解處理時(shí)，通常使用 較小的Ν-末端延伸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述Ν-末端延伸選自趾Κ、趾ΑΕΚ、皿、ΕΕΑ服、Ε (ΕΑ)2ΗΚ、Ε 化A)3冊(cè)、EEGHK、ΕΗΡΚ、邸GEPK、ΕΕΑ肥LK、EEAHEVK、ΕΕΑΗΕΜΚ、ΕΕΑ肥FK、ΕΕΑΗΕΥΚ、 EEA皿WK趾GNTTPK和趾LDARLEALK。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述N-末端延伸選自QPMYKR、 GQPMYK、PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WLQLKP、冊(cè)LQLK、W冊(cè)L化、AW冊(cè)LQ、EAW冊(cè)L、 AEAW 冊(cè)和 EAEAWH。
[0120] 當(dāng)表達(dá)的多膚包含N-末端延伸時(shí)，慣常通過使用蛋白酶、膚酶或通過化學(xué)切割來 切下該N-末端延伸?？蒞使用蛋白酶如膜蛋白酶、Acromobacter lyticus蛋白酶和腸激酶。 選擇用于切割的具體蛋白水解酶通常取決于所產(chǎn)生的多膚。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常將 根據(jù)多膚序列，尤其是任何內(nèi)部主要或次要切割位點(diǎn)的存在，W及使N-末端延伸適應(yīng)于形 成良好的切割位點(diǎn)，來選擇蛋白水解酶。
[0121] 當(dāng)用來切割具有N-末端延伸的表達(dá)的多膚時(shí)，蛋白酶的切割效率可W如下通過簡 單的試驗(yàn)來確定:將多膚的適當(dāng)水溶液在有利于蛋白酶的抑和溫度下溫育，并隨著時(shí)間從 反應(yīng)混合物中取出樣品。一取出樣品就將酶活性滅活。收集覆蓋了感興趣的時(shí)段的所有樣 品之后，通過例如HPLC分析測定相應(yīng)的沒有N-末端延伸的多膚的濃度。將切割的多膚的濃 度描述為時(shí)間的函數(shù)將指示該反應(yīng)的進(jìn)程。比較多膚的不同N-末端延伸的運(yùn)類反應(yīng)軌跡將 允許依據(jù)蛋白酶釋放不含N-末端延伸的多膚的能力對(duì)N-末端延伸進(jìn)行排序。
[0122] 編碼多膚的核酸構(gòu)建體可W適當(dāng)?shù)貫榛蚪M、cDNA或合成來源的。通過公知的技 術(shù)經(jīng)由遺傳密碼的修飾來完成氨基酸序列的改變。
[0123] 編碼多膚的DNA序列通常插入到可W是任何載體的重組載體中，該載體可W方便 地經(jīng)歷重組DNA程序，并且載體的選擇通常將取決于其將被引入到的宿主細(xì)胞。因此，該載 體可W是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外的實(shí)體存在、其復(fù)制與染色體復(fù)制無關(guān)的載體， 例如質(zhì)粒?；蛘撸撦d體可W是運(yùn)樣的載體，當(dāng)引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，其被整合到宿主細(xì)胞 基因組中并與其所整合至的染色體一起復(fù)制。
[0124] 該載體優(yōu)選地是表達(dá)載體，其中編碼多膚的DNA序列與DNA轉(zhuǎn)錄所需的其他區(qū)段可 操作地連接。術(shù)語"可操作地連接"表示運(yùn)些區(qū)段排列成使得它們一致地發(fā)揮作用W用于它 們的預(yù)期目的，例如，轉(zhuǎn)錄在啟動(dòng)子中開始并通過編碼該多膚的DNA序列繼續(xù)進(jìn)行，直至其 在終止子內(nèi)終止。
[0125] 因此，用于表達(dá)多膚的表達(dá)載體將包含能夠啟動(dòng)和引導(dǎo)經(jīng)克隆的基因或cDNA的轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可W是任何DNA序列，其在所選擇的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性并且 可W衍生自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
[01 %]此外，用于表達(dá)多膚的表達(dá)載體還將包含終止子序列，即被宿主細(xì)胞識(shí)別而終止 轉(zhuǎn)錄的序列。該終止子序列與編碼該多膚的核酸序列的3'末端可操作地連接。在所選擇的 宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子均可在本發(fā)明中使用。
[0127]多膚的表達(dá)目的在于被引導(dǎo)至分泌途徑，W用于細(xì)胞外表達(dá)至生長培養(yǎng)基中。例 如，從釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因中獲得作為前導(dǎo)序列中的前膚用于在酵母 宿主細(xì)胞中表達(dá)的有用的信號(hào)膚。有用的前膚（信號(hào)膚）的其他實(shí)例是天冬氨酸蛋白酶3 (Ypsl)信號(hào)膚巧gel-Mitani等人（1990)YEAST 6:127-137和US 5，726,038)、MFal基因的α- 因子信號(hào)（Thorner(1981)in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae，Sl:rathe;rn等人編著，pp 143-180,Cold Spring 化rbor Laboratory,NY和US 4,870,008)、小鼠唾液淀粉酶的信號(hào)膚（0.化genbuchle等人，Nature 289，1981，pp.643- 646)、修飾的簇膚酶信號(hào)膚化.A. Vails等人，Cell 48,1987，pp. 887-897)和酵母BARI信號(hào) 膚(WO 87/02670)。
[01%]分別用于連接編碼多膚的DNA序列、啟動(dòng)子、終止子和分泌信號(hào)序列，W及用于將 它們插入到含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體中的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的（參見，例如， Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)〇
[0129]許多酵母細(xì)胞含有被稱為2微米質(zhì)粒的內(nèi)源質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有確保其穩(wěn)定維持在 酵母細(xì)胞中的各種元件（Guerineau等人，1971 ,Biochem.Biophys .Res . Comm. 42(3): 550- 557)。該內(nèi)源2微米質(zhì)粒的全部或一部分可與重組基因一起使用，作為一種用于確保穩(wěn)定維 持重組表達(dá)所需的序列的方法（Beggs J.D., 1978,Transformation of yeast by a r邱lieating hybrid plasmid,Na1:ure ,275:104-109)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)源2微米質(zhì)粒 存在于細(xì)胞中時(shí)，用于重組表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒僅需要包含復(fù)制起點(diǎn)和STB區(qū)域。內(nèi)源2微米質(zhì) 粒上存在的其他因子可W反式作用。復(fù)制起點(diǎn)和STB區(qū)域僅構(gòu)成內(nèi)源化質(zhì)粒的一小部分。
[0130] 在一方面，本發(fā)明提供了一種僅含有來自2微米質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)和STB區(qū)域的表達(dá) 質(zhì)粒。因此，運(yùn)一最小表達(dá)質(zhì)粒不含有化P區(qū)域、重復(fù)1區(qū)域、REP1區(qū)域、D-蛋白、重復(fù)2區(qū)域和 REP2區(qū)域中的任何一個(gè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該質(zhì)粒包含表達(dá)盒、大腸桿菌部分(包括AmpR 基因）、女曰Russel 1, PR( 1985 , Transcription of the triose-phosph曰te gene of Schizos曰cch曰romyces pombe initi曰tes from 曰 start point different from th曰t in Saccharomyces cerevisiae,Gene,40:125-130)中所述的編碼憐酸丙糖異構(gòu)酶的粟酒裂殖 酵母(S.pombe)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述最小質(zhì)粒不包含AmpR或其他抗生素抗性基 因。在例如大腸桿菌中的克隆工作期間，運(yùn)樣的抗生素抗性基因是有用的，但是在用于工業(yè) 規(guī)模的重組蛋白表達(dá)的質(zhì)粒中優(yōu)選消除抗生素抗性基因。可使抗生素抗性基因成為非功能 性的或通過公知的程序從宿主細(xì)胞中去除，參見例如W0 00/04172。所述最小表達(dá)質(zhì)?？捎?于多膚在酵母中的表達(dá)。
[0131] 本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，其允許容易地選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 選擇性標(biāo)記是運(yùn)樣一種基因，其產(chǎn)物提供殺蟲劑或病毒抗性、重金屬抗性、互補(bǔ)營養(yǎng)缺陷 等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)或地衣芽抱桿菌 (Bacillus licheniformis)的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉 素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。用于在營養(yǎng)缺陷型酵母細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括ADE2、HIS3、 LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于酵母的優(yōu)選選擇性標(biāo)記是粟酒裂殖酵母TPI基因 (Russell(1985)Gene 40:125-130)。
[0132] 在載體中，多核巧酸序列與合適的啟動(dòng)子序列可操作地連接。該啟動(dòng)子可W是在 選擇的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變、截短和雜合啟動(dòng)子，并且可 從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多膚的基因中獲得。在酵母宿主細(xì)胞中有 用的啟動(dòng)子的實(shí)例是釀酒酵母Μ陽1、TP11、AD肥、I'D冊(cè)或PGK1啟動(dòng)子。
[0133] 本發(fā)明的多核巧酸構(gòu)建體通常也將與合適的終止子可操作地連接。在酵母中，合 適的終止子的實(shí)例是TPI1終止子(A化er等人（1982)J.Mol.Appl.Genet. 1:419-434)，但是 也可W是任何內(nèi)源酵母終止子。
[0134] 用于分別連接本發(fā)明的多核巧酸序列、啟動(dòng)子和終止子，W及用于將它們插入到 含有酵母復(fù)制所需信息的合適的酵母載體中的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。應(yīng)當(dāng)理解， 載體可W如下構(gòu)建:首先制備含有編碼待表達(dá)的多膚的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體，隨后將 該片段插入到合適的表達(dá)載體中，或者順序插入含有單個(gè)元件（如本發(fā)明的交配因子α變 體，任選包含Ν-末端延伸的待表達(dá)的多膚)的遺傳信息的DNA片段，然后通過連接、無縫克隆 方法或通過在酵母細(xì)胞中經(jīng)由同源重組直接克隆來組裝運(yùn)些元件。
[0135] 本發(fā)明還設(shè)及重組宿主細(xì)胞，其包含編碼本發(fā)明的交配因子α變體和待表達(dá)的多 膚的多核巧酸序列。將包含運(yùn)種多核巧酸序列的載體引入到宿主細(xì)胞中，使得該載體保持 為染色體組成部分或自我復(fù)制的染色體外載體。
[0136] 如本文所用的"宿主細(xì)胞"意在表示用于表達(dá)感興趣的多膚的微生物。宿主細(xì)胞包 括由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不相同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0137] 本發(fā)明的合適的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。如本文所用的"酵母"包括產(chǎn)子囊酵母 (basidiosporogenous yeast)(內(nèi)抱霉目（Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母 (basidiosporogenous yeast)和屬于半知菌綱（Fungi Impe;rfecti)(芽抱綱 (Blastomycetes))的酵母。產(chǎn)子囊酵母分為蝕精霉科（Spermophthoraceae)和酵母科 (Saccharomycetaceae)。后者包括四個(gè)亞科：裂殖酵母亞科（Schizosaccharomycoideae) (例如，裂殖酵母屬）、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科化ipomycoideae)和酵 母亞科（Saccharomycoideae)(例如，畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬化luyveromyces) 和酵母屬（Saccharomyces))。產(chǎn)擔(dān)子酵母包括白冬抱酵母屬化eucosporidim)、紅冬抱酵母 屬（Miodosporidium)、鎖擲酵母屬（Sporidiobolus)、網(wǎng)抱菌屬化ilobasidium)和線黑粉菌 屬（F i 1 0 b a S i d i e 1 1 a )。屬于半知菌綱的酵母分為兩個(gè)科：擲抱酵母科 (Sporobolomycetaceae )(例如，擲抱酵母屬（Sorobolomyces )和布勒彈抱酵母屬 (Bullera))和隱球酵母科（Cryptococcaceae)(例如，假絲酵母屬（Candida))。因?yàn)榻湍傅?分類在將來可能改變，所W為了本發(fā)明的目的，應(yīng)按照Biology and Activities of Yeast (Skinner,F.A. ,Passmore, S.M. ,and Davenport,R.R. ,eds, Soc.App.Bacteriol .Symposium Series No.9,1980)所述定義酵母。酵母的生物學(xué)和酵母 遺傳學(xué)的操作是本領(lǐng)域公知的（參見，例如，Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil ,M. ,Horecke;r ,B. J.和Stopani ,Α.Ο.Μ.編著，第2版，1987 ;The 化asts ,Rose ,Α.Η.和 Harrison,J.S.編著，第2 版，1987;和The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern等人，editors, 1981)。
[0138] 本發(fā)明的方法中使用的酵母宿主細(xì)胞可W是任何合適的酵母生物體，其一旦培 養(yǎng)，便產(chǎn)生大量待表達(dá)的多膚。
[0139] 合適的酵母生物體的實(shí)例是選自假絲酵母屬、克魯維酵母屬、酵母屬、裂殖酵母 屬、畢赤酵母屬、漢遜酵母屬化ansenula)和耶氏酵母屬(Yarrowia)的種的細(xì)胞的菌株。在 一個(gè)實(shí)施方案中，酵母宿主細(xì)胞選自卡爾酵母（Saccharomyces carlsbergensis)、釀酒酵 母、糖化酉奉母（Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces dou邑lasii、克魯弗酉奉母 (Saccharomyces kluyveri)、諾地酉奉母（Saccharomyces norbensis)、卵形酉奉母 (Saccharomyces oviformis)、粟酒裂殖酵母、葡萄汁酵母（Sacchoromyces uvarum)、克魯 弗畢赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、產(chǎn)航假絲酵母 (Candida utilis)、可可假絲酵母（Candida cacaoi)和發(fā)酵地霉（Geotrichum fermentans)。其他有用的酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母化luyveromyces lactis)、脆壁 克魯維酵母化luyveromyces fragilis)、多形漢遜酵母(化nsenula polymor地a)、己斯德 畢赤酵母（Pichia pastoris)、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母、玉蜀泰黑粉菌（Ustilgo ma}dis)、麥芽糖假絲酵母（Candida maltose)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guillermondii) 和Pichia methanoliol(參見Gleeson等人，J.Gen.Microbiol. 132,1986,pp.：M59-3465;US 4,882,279和US 4,879,231)。例如，酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可^通過原生質(zhì)體形成^及隨后^本 身已知的方式轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)。
[0140] 用于表達(dá)多膚的宿主細(xì)胞優(yōu)選為不含任何功能性抗生素抗性基因的細(xì)胞。盡管運(yùn) 樣的抗生素抗性基因在例如大腸桿菌中的初始克隆步驟過程中是有用的，但是可使抗生素 抗性基因成為非功能性的或通過公知的程序從宿主細(xì)胞中去除，參見例如W0 00/04172。
[0141] 如本文所用的"培養(yǎng)基"意在表示用于培養(yǎng)宿主細(xì)胞，即，支持酵母的生長和產(chǎn)物 形成的液體溶液。合適的酵母用培養(yǎng)基是例如YPD或如W02008/037735中所述。該培養(yǎng)基含 有至少一種碳源，一種或數(shù)種氮源，包括鐘鹽、鋼鹽、儀鹽、憐酸鹽和硫酸鹽在內(nèi)的必要的 鹽，微量金屬，水溶性維生素，和加工助劑，包括但不限于消泡劑、蛋白酶抑制劑、穩(wěn)定劑、配 體和誘導(dǎo)物。典型的碳源是例如單糖或二糖。典型的氮源是例如氨、尿素、氨基酸、酵母提取 物、玉米漿和完全或部分水解的蛋白質(zhì)。典型的微量金屬是例如化、Zn、MnXu、Mo和出B03。典 型的水溶性維生素是例如生物素、泛酸鹽、煙酸、硫胺素、對(duì)氨基苯甲酸、膽堿、化唉醇、葉 酸、核黃素和抗壞血酸。
[0142] 如本文所用的"發(fā)酵"意在表示用于使浸入液體培養(yǎng)基中的微生物繁殖的無菌過 程。發(fā)酵優(yōu)選在具有用于添加包括但不限于空氣、氧氣和氨等壓縮的無菌氣體的供應(yīng)管線 的無菌攬拌罐中進(jìn)行。發(fā)酵罐可W含有用于監(jiān)控pH、溫度、壓力、攬拌速率、溶解氧水平、液 體含量、泡沫水平、加料速率和加酸及加堿速率的傳感器和裝置。此外，發(fā)酵罐可裝備有用 于監(jiān)控細(xì)胞密度的水平、代謝物和產(chǎn)物(不論其理化形式如何)的濃度的光學(xué)器件。
[0143] 在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的所需產(chǎn)物作為可溶性細(xì)胞外物質(zhì)而存在，或者作為呈可溶性 物質(zhì)形式或呈包括聚集物質(zhì)的不溶性物質(zhì)形式的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)而存在。所需產(chǎn)物優(yōu)選作為可 溶性細(xì)胞外物質(zhì)而存在。發(fā)酵過程通常在具有l(wèi)OOmL至200,00化的工作容積的罐中進(jìn)行。發(fā) 酵過程可W作為分批過程、補(bǔ)料分批過程、重復(fù)補(bǔ)料分批過程或連續(xù)過程來操作。
[0144] 分泌的多膚一-其中大部分將W適當(dāng)處理的形式存在于培養(yǎng)基中一一可通過常 規(guī)程序從培養(yǎng)基中回收，運(yùn)些程序包括通過離屯、、過濾從培養(yǎng)基中分離酵母細(xì)胞，或者通過 離子交換基質(zhì)或通過反相吸附基質(zhì)捕獲多膚，依靠鹽例如硫酸錠使上清液或?yàn)V液的蛋白質(zhì) 組分沉淀，然后通過各種色譜程序例如離子交換色譜法、親和色譜法等進(jìn)行純化。
[0145] 本發(fā)明的新型交配因子α變體還有利于在酵母中表達(dá)過程中減少多膚的0-糖基 化。如此，本發(fā)明的交配因子α變體可W在用于在酵母中制備多膚如化Ρ-1膚的改進(jìn)方法中 使用。在具有降低的0-糖基化能力的酵母細(xì)胞中表達(dá)多膚可維持所述前體的提高的產(chǎn)率， 而同時(shí)甚至進(jìn)一步降低在表達(dá)過程中0-糖基化的所述多膚的比例。
[0146] 蛋白質(zhì)0-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(ΡΜΤ)啟動(dòng)了 0-甘露糖基聚糖的組裝，運(yùn)是真菌中必要 的蛋白質(zhì)修飾。ΡΜΤ在真菌中保守，并且ΡΜΤ家族在系統(tǒng)發(fā)育上分類為PMTUPMT2和ΡΜΤ4亞家 族，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)底物特異性上不同。通過從多祗基憐酸-D-甘露糖中轉(zhuǎn)移甘露糖基殘基， 蛋白質(zhì)0-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶Pmtlp和化t2p在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化蛋白質(zhì)中的絲氨酸和蘇氨 酸殘基的0-糖基化(Gentzsch等人，陽BS Lett 1995，18，口口128-130)。在釀酒酵母中^及在 許多其他酵母中，PMT家族是高度過剩的，并且只有PMT1/PMT2和PMT4亞家族成員的同時(shí)缺 失才是致死性的（Girrbach和Strahl，J. Biol. Chem. 2003，278，卵 12554-62) eUS5，714，377 描述了具有由于PMT1/PMT2修飾而降低的0-糖基化能力的酵母細(xì)胞仍然存活，并且在工業(yè) 發(fā)酵條件下顯示出良好的生長特性。
[0147] 非限制性實(shí)施方案
[0148] 通過W下非限制性實(shí)施方案進(jìn)一步描述了本發(fā)明：
[0149] 1.-種用于在酵母中重組表達(dá)多膚的方法，其包括培養(yǎng)包含編碼該多膚上游的加 工和分泌信號(hào)的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信號(hào)包含在位置38-42處的 VIG化序列中具有至少一個(gè)置換從而包含通式(I)的氨基酸序列的交配因子α原膚變體：
[0150] X38-X39-X40-X41-X42(SEQ id N0:1) (I)
[0151] 其中
[0152] X38 是F、L、I或V;
[0153] X39是L、I、V或Μ;
[0154] Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[01 巧]Χ41是5、￥少、胖、1^、1、￥或1;
[0156] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0157] 條件為 X38-X42 不是 VIGYS。
[0158] 2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中
[0159] X38 是F、L或 V;
[0160] X39是L、I、V或M;
[0161] X40 是G或R;
[0162] X41是5、￥、1^、1、￥或1，并且
[0163] X42是￥、胖、1^、￥或1。
[0164] 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中 [01 化]X38是 I 或 V;
[0166] X39是L、I、V或M;
[0167] X40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[016引 X41是Y、F或W，并且
[0169] X42 是 L或 I。
[0170] 4.根據(jù)實(shí)施方案1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中
[0171] X38是 V;
[0172] X39是L、I、V或M;
[0173] X40 是G或R;
[0174] X41是Y，并且
[0175] X42 是L。
[Ο?Μ] 5.根據(jù)實(shí)施方案1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中Χ38-Χ39-Χ40-Χ41-Χ42中的四個(gè)氨 基酸殘基與VIG化或VIGl^中的相應(yīng)氨基酸殘基相同。
[0177] 6.根據(jù)實(shí)施方案1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X38-X39-X40-X41-X42中的至少立 個(gè)氨基酸殘基與VIG化或VIGYS中的相應(yīng)氨基酸殘基相同。
[017引7.根據(jù)實(shí)施方案1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X41是Y。
[0179] 8.根據(jù)實(shí)施方案1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X41是L。
[0180] 9.根據(jù)實(shí)施方案1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X42是L。
[0181] 10.根據(jù)實(shí)施方案1和5-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X42是S。
[0182] 11.根據(jù)實(shí)施方案1和5-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中乂42是￥、胖、1^、1、￥或1。
[018引12.根據(jù)實(shí)施方案1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X40是R。
[0184] 13.根據(jù)實(shí)施方案12所述的方法，其中X38是V，X39是I，X"是Y，并且X42是L。
[0185] 14.根據(jù)實(shí)施方案12所述的方法，其中X38是V，X39是I，X"是Y，并且X42是S。
[0186] 15.根據(jù)實(shí)施方案1和12中任意一項(xiàng)所述的方法，其中式（I)是VI-X40-化或VI-X40- YSo
[0187] 16.根據(jù)實(shí)施方案15所述的方法，其中X40是4、￥少、胖、3、1(、^1、￥或1。
[018引17.根據(jù)實(shí)施方案1-16中任意一項(xiàng)所述的方法，其中與SEQ ID N0:2所示的交配因 子口原膚(氨基酸殘基20-85)相比，所述交配因子α原膚變體在X38-X42序列之外具有少于10 個(gè)氨基酸殘基變化。
[0189] 18.根據(jù)實(shí)施方案1-17中任意一項(xiàng)所述的方法，其中與SEQ ID Ν0:2所示的交配因 子口原膚(氨基酸殘基20-85)相比，所述交配因子α原膚變體在Χ38-Χ42序列之外具有少于5個(gè) 氨基酸殘基變化。
[0190] 19.根據(jù)實(shí)施方案1-18中任意一項(xiàng)所述的方法，其中與SEQ ID Ν0:2所示的交配因 子口原膚(氨基酸殘基20-85)相比，所述交配因子α原膚變體在Χ38-Χ42序列之外具有少于2個(gè) 氨基酸殘基變化。
[0191] 20.根據(jù)實(shí)施方案1-19中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述交配因子α原膚變體是交 配因子α前原膚的一部分，該交配因子α前原膚包含與作為C-末端部分的所述交配因子α原 膚變體融合的作為Ν-末端部分的前膚。
[0192] 21.根據(jù)實(shí)施方案20所述的方法，其中所述前膚來自酵母天冬氨酸蛋白酶3(ΥΑΡ3) 信號(hào)膚，來自釀酒酵母的MFal基因的α-因子信號(hào)或其變體。
[0193] 22.根據(jù)實(shí)施方案1-21中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酵母攜帶至少一個(gè)降低 其0-糖基化能力的遺傳修飾。
[0194] 23.根據(jù)實(shí)施方案22所述的方法，其中所述酵母攜帶ΡΜΤ1或ΡΜΤ2的基因內(nèi)的至少 一個(gè)降低其0-糖基化能力的遺傳修飾。
[01Μ] 24.根據(jù)實(shí)施方案22-23中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酵母攜帶至少一個(gè)如下 的遺傳修飾，與攜帶相應(yīng)未修飾的基因的酵母相比，該遺傳修飾降低其通過蛋白質(zhì)0-甘露 糖基轉(zhuǎn)移酶l(PMTl)對(duì)與α前導(dǎo)序列一起表達(dá)的多膚化P-1(7-37)[K34R]的0-糖基化的能 力。
[0196] 25.根據(jù)實(shí)施方案22-24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酵母攜帶至少一個(gè)如下 的遺傳修飾，與攜帶相應(yīng)未修飾的基因的酵母相比，該遺傳修飾降低其通過蛋白質(zhì)0-甘露 糖基轉(zhuǎn)移酶2(PMT2)對(duì)與α前導(dǎo)序列一起表達(dá)的多膚化P-1(7-37)[K34R]的0-糖基化的能 力。
[0197] 26.根據(jù)實(shí)施方案22-25中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述0-糖基化能力降低至少 2倍。
[0198] 27.根據(jù)實(shí)施方案22-26中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述0-糖基化能力降低至少 4倍。
[0199] 28.根據(jù)實(shí)施方案22-27中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一個(gè)遺傳修飾位于 PMT1或PMT2的編碼區(qū)。
[0200] 29.根據(jù)實(shí)施方案22-27中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述至少一個(gè)遺傳修飾位于 負(fù)責(zé)或參與PMT1或PMT2的表達(dá)和/或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的區(qū)域。
[0201] 30.根據(jù)實(shí)施方案22-27中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酵母中的PMT1基因缺 失。
[0202] 31.根據(jù)實(shí)施方案22-27中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酵母中的PMT1和PMT2基 因均缺失。
[0203] 32.根據(jù)實(shí)施方案1-31中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述多膚包含GLP-1膚。
[0204] 33.根據(jù)實(shí)施方案32所述的方法，其中所述多膚包含化P-1(9-37)[K34R]或化P-1 (9-37)比34R]。
[0205] 34.根據(jù)實(shí)施方案33所述的方法，其中所述多膚是化?-1(7-37)[1(341?]、化?-1(9- 37)比34R]或GLP-U9-37)比34R，G37K](沈Q ID N0:44)。
[0206] 35.根據(jù)實(shí)施方案32-34中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述多膚具有N-末端延伸。
[0207] 36.根據(jù)實(shí)施方案35所述的方法，其中所述N-末端延伸選自邸K、邸AEK、HK、EEAHK、 E(EA)2HK、E 化A)3HK、EEGHK、EHPK、邸GEPK、EEAHELK、EEAHEVK、EEAHEMK、EEAHEFK、EEAHEYK、 EEA 肥 WKEEGNTTPK 和邸 LDARLEALK。
[020引37.根據(jù)實(shí)施方案35所述的方法，其中所述N-末端延伸選自DV、DVKPGQPLA、 DVKPGQPEY、DVKPGEPLY、DVKPGQPLY、DVKPGQPLE、DVKPGQPMY和DVKPGQPMYD孤DK。
[0209] 38 .根據(jù)實(shí)施方案35所述的方法，其中所述N-末端延伸選自QPMYKR、GQPMYK、 PGQPMY、KPGQPM、LKPGQP、QLKPGQ、LQLKPG、WL化KP、HWL化K、WHWL化、AWHWLQ、EAWHWL、AEAWHW 和EAEAWH。
[0210] 39.交配因子α原膚變體，其在位置38-42處的VIG化序列中具有至少一個(gè)置換，從 而包含通式(I)的氨基酸序列：
[0別。Χ38-Χ39-Χ40-Χ4廣X42(SEQ ID Ν0:1) (I)
[0212] 其中
[0213] X38 是F、L、I或V;
[0214] X39是L、I、V或Μ;
[0215] Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[0216] Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0217] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[0218]條件為 X38-X42 不是 VIGYS。
[0219] 40.根據(jù)實(shí)施方案39所述的交配因子α原膚變體，其中X38-X42不是VIGYS、VIDYS、 VATYUVIGYR 或 AIGYL。
[0220] 41. GLP-1前體，其為一種融合多膚，其包含：
[0221] -前膚，
[0222] -交配因子α原膚變體，其在位置38-42處的VIG化序列中具
[0223] 有至少一個(gè)置換，從而包含通式(I)的氨基酸序列：
[0。4] X38-X39-X40-X41-X42(SEQ ID N0:1) (I)
[0225] 其中
[0226] X38 是F、L、I或V;
[0227] X39是L、I、V或Μ;
[0228] Χ40是4、6、5、6、9、￥、尸、胖、3、1(、山1^、1、￥或1;
[02 巧]Χ41是5、￥、尸、胖、1^、1、￥或1;
[0230] Χ42是Y、W、L、I、V、]\m!^S;
[02川條件為X38-X42不是VIGYS，
[0232] -任選的延伸膚，和
[0233] -GLP-1 膚。
[0234] 42.根據(jù)實(shí)施方案41所述的化P-1前體，其中所述化P-1前體所包含的膚按照它們 所列出的順序融合，即，前膚-交配因子α原膚變體，任選的延伸膚和GLP-1膚。
[0235] 43.編碼根據(jù)實(shí)施方案39-42中任意一項(xiàng)所述的多膚的DNA序列。
[0236] 44.包含根據(jù)實(shí)施方案43所述的DNA序列的表達(dá)載體。
[0237] 45.根據(jù)實(shí)施方案44所述的表達(dá)載體，其中編碼待表達(dá)的多膚的所述DNA序列與上 游啟動(dòng)子和下游終止子可操作地連接。
[023引46.包含根據(jù)實(shí)施方案44-45中任意一項(xiàng)所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0239] 47.根據(jù)實(shí)施方案46所述的宿主細(xì)胞，其選自酵母屬的種、畢赤酵母屬的種、漢遜 酵母屬的種、Arxula的種、克魯維酵母屬的種、耶氏酵母屬的種和裂殖酵母屬的種。
[0240] 本文中引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請(qǐng)和專利，均在此通過引用W其 全文并入本文，并且其程度如同單獨(dú)地且特別地指出每篇參考文獻(xiàn)均通過引用而并入且在 本文中W其全文進(jìn)行闡述(在法律允許的最大程度上）。本文中使用的所有標(biāo)題和小標(biāo)題僅 僅是為了方便起見，而不應(yīng)解釋為W任何方式限制本發(fā)明。除非另有聲明，否則任何和全部 實(shí)例或本文提供的示例性措辭(例如，"如"）的使用僅旨在更好地闡明本發(fā)明，并不造成對(duì) 本發(fā)明的范圍的限制。說明書中的任何措辭均不應(yīng)被解釋為表示任何未請(qǐng)求保護(hù)的要素對(duì) 本發(fā)明的實(shí)踐是必不可少的。本文中專利文件的引用和并入僅僅是為了方便而做出的，并 沒有反映關(guān)于運(yùn)些專利文件的有效性、可專利性和/或可執(zhí)行性的任何觀點(diǎn)。如由適用的法 律所允許的，本發(fā)明包括所附權(quán)利要求書中列舉的主題的所有修改和等同物。
[0241] 實(shí)施例
[0242] 實(shí)施例1-45
[0243] 我們構(gòu)建了一種質(zhì)粒，其含有TDH3啟動(dòng)子，編碼MFalpha前原膚的基因，編碼N-末 端延伸的化P-1 (DVKPGQPMY孤DDK-GLP-1 (7-37) [K34R])(沈Q ID NO:45)的基因，用于在酵 母中維持的最小2微米區(qū)域，和選擇性標(biāo)記，即來自粟酒裂殖酵母的TPI基因（參見圖1)。 [0244]在該質(zhì)粒背景中，我巧編碼MFalpha-原膚區(qū)域的位置38-42的區(qū)域中引入了各 種單突變，X38-X42 = VIG化序列（參見圖2)。使用野生型VIG化序列的實(shí)驗(yàn)是實(shí)施例1，參見表 1至表5。其他參考實(shí)驗(yàn)是實(shí)施例5-6、10-11、28-29、37-38和44-45。
[0245] 將運(yùn)些質(zhì)粒引入缺乏TPI1基因的釀酒酵母菌株中，W允許在含有葡萄糖作為唯一 碳源的培養(yǎng)基上選擇攜帶該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。此后將轉(zhuǎn)化體在搖瓶中的5ml相關(guān)培養(yǎng)基中培 養(yǎng)3天，并通過LCMS分析培養(yǎng)上清液中分泌的GLP-1膚的濃度和該膚的0-糖基化程度。表1至 表5中顯示了 X38-X42序列的野生型和單氨基酸殘基突變體(在每個(gè)位置上包括一對(duì)參考實(shí) 施例）的產(chǎn)率和0-糖基化程度。
[0246] 表1.在位置38(X38)上具有單氨基酸突變的交配因子α原膚突變體的控制下，N-末 端延伸的化Ρ-1的表達(dá)的數(shù)據(jù)。Ν-末端延伸的化Ρ-1和0-糖基化(0-glyco)雜質(zhì)的濃度針對(duì) 在具有野生型化1作為X38的交配因子α原膚的控制下來自相同表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
[0247]
[0248] 表2.在位置39(X39)上具有單氨基酸突變的交配因子α原膚突變體的控制下，N-末 端延伸的化P-1的表達(dá)的數(shù)據(jù)。N-末端延伸的化P-1和0-糖基化(0-glyco)雜質(zhì)的濃度針對(duì) 在具有野生型lie作為X39的交配因子α原膚的控制下來自相同表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
[0249]
[0250] 表3.在位置40(Χ40)上具有單氨基酸突變的交配因子α原膚突變體的控制下，Ν-末 端延伸的化Ρ-1的表達(dá)的數(shù)據(jù)。Ν-末端延伸的化Ρ-1和0-糖基化(0-glyco)雜質(zhì)的濃度針對(duì) 在具有野生型Gly作為X40的交配因子α原膚的控制下來自相同表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
[0251]
[0252] 表4.在位置41(X41)上具有單氨基酸突變的交配因子α原膚突變體的控制下，N-末 端延伸的化P-1的表達(dá)的數(shù)據(jù)。N-末端延伸的化P-1和0-糖基化(0-glyco)雜質(zhì)的濃度針對(duì) 在具有野生型Tyr作為X41的交配因子α原膚的控制下來自相同表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
[0 巧 3]
[ο 巧 4]
[0255]表5.在位置42(Χ42)上具有單氨基酸突變的交配因子α原膚突變體的控制下，Ν-末 端延伸的化Ρ-1的表達(dá)的數(shù)據(jù)。Ν-末端延伸的化Ρ-1和0-糖基化(0-glyco)雜質(zhì)的濃度針對(duì) 在具有野生型Leu作為X42的交配因子α原膚的控制下來自相同表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
[0 巧 6]
[0巧7] 實(shí)施例46.
[0258] 一種類似于實(shí)施例1-45中的質(zhì)粒的質(zhì)粒，其含有TDH3啟動(dòng)子，編碼MFalpha前原膚 的基因，編碼N-末端延伸的GLP-UDVKPGQPMY孤孤K-GLP-U7-37)比34R])的基因，用于在酵 母中維持的最小2微米區(qū)域，和選擇性標(biāo)記（圖1)，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至兩種不同的菌株背景 中--一種含有PMT1基因（PMT+)，另一種缺失PMT1基因（PMT-)。該P(yáng)MT1基因編碼參與0-糖 基化的蛋白質(zhì)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶。
[0259] 所述MFalpha原膚是野生型(40G)或突變的(G40R)。在連續(xù)培養(yǎng)中在相同的條件下 培養(yǎng)所述菌株，稀釋率= 0.1，并且pH 5.8。通過HPLC分析樣品W測定在用過的培養(yǎng)基中 GLP-1前體的濃度，并通過LCMS分析W則定0-糖基化的化P-1前體的比例。
[0260] 結(jié)果證明效應(yīng)的確是累加的。
[0261] G40R突變使0-糖基化減少大于80%dPMT1的缺失使0-糖基化進(jìn)一步減少大于 80%，在運(yùn)一情況下得到接近檢測限的0-糖基化水平。此外，在PMT+菌株W及pmtl缺失菌株 中，G40R突變均使N-末端延伸的GLP-1的產(chǎn)率與40G野生型形式相比有驚人的增長(參見表 6) 〇
[0262] 運(yùn)些結(jié)果表明，在MFal地a原膚中的有益突變例如G40R與PMT1缺失的宿主菌株的 結(jié)合導(dǎo)致0-糖基化的累加減少。
[0263] 表6.與相應(yīng)的野生型40G相比，當(dāng)使用40R突變的MFalpha原膚時(shí)，在連續(xù)培養(yǎng)中膚 DVKPGQPMY孤孤K-GLP-1 (7-37)比34R]的歸一化的最大濃度(產(chǎn)率）。
[0264]
[02化]實(shí)施例47.
[0266] 為了考察所述突變之一在其他化P-1膚的表達(dá)過程中的作用，我們構(gòu)建了質(zhì)粒，其 含有TDH3啟動(dòng)子，編碼野生型(40G)或40R突變形式的MFal地a前原膚的基因，編碼N-末端延 伸的化P-UDVKPGQPMY孤孤K-GLP-l(9-37)比：MR]或DVKPGQPMY孤孤K-GLP-l(9-37)比：MR， G37K])的基因，用于在酵母中維持的最小2微米區(qū)域，和選擇性標(biāo)記，即來自粟酒裂殖酵母 的TPI基因（參見圖1)。
[0267] 將運(yùn)些質(zhì)粒引入缺乏TPI1基因的釀酒酵母菌株中，W允許在含有葡萄糖作為唯一 碳源的培養(yǎng)基上選擇攜帶該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。此后將轉(zhuǎn)化體在搖瓶中的5ml相關(guān)培養(yǎng)基中培 養(yǎng)3天，并通過LCMS分析培養(yǎng)上清液中分泌的GLP-1膚的濃度和該膚的0-糖基化程度。表7顯 示了野生型(wt)和40R突變?cè)诒磉_(dá)時(shí)的結(jié)果，包括化P-1膚的產(chǎn)率和化P-1膚的0-糖基化程 度。
[0268] 表7.在位置40(X40)上具有或不具有到Arg的單氨基酸置換的交配因子α原膚突變 體的控制下，特異性Ν-末端延伸的化Ρ-1膚的表達(dá)的數(shù)據(jù)。Ν-末端延伸的化Ρ-1膚(產(chǎn)率)和 0-糖基化雜質(zhì)的濃度針對(duì)在具有野生型Gly作為Χ40的交配因子α原膚的控制下來自相同 GLP-1膚的表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。
[0269]
[0270] 抓^低于檢測限
[0271] 雖然本發(fā)明的某些特征已在本文中說明和描述，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)在將會(huì) 想到許多修改、替換、變化和等同物。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附的權(quán)利要求書旨在涵蓋落在本發(fā) 明的真正精神內(nèi)的所有運(yùn)些修改和變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于在酵母中重組表達(dá)包含GLP-1肽的多肽的方法，其包括培養(yǎng)包含編碼該多 肽上游的加工和分泌信號(hào)的DNA序列的酵母菌株，其中所述加工和分泌信號(hào)包含在位置38-42處的VIGYL序列中具有至少一個(gè)置換從而包含通式（I)的氨基酸序列的交配因子α原肽變 體： X38-X39-X40-X4i-X42(SEQ ID NO: 1) (I) 其中 Χ38是F、L、I或V; X39是L、I、V或Μ; Χ4〇是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、VSM; X41是s、y、f、w、l、i、vSm; X42是y、w、l、i、v、mSs; 條件為X38-X42不是VIGYS。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中 X38是F、L或 V; Χ39是L、I、V或M; X40是G或R; X41是3、￥、1^、1、￥或1并且 X42是Y、W、L、VSM。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中 X38是I或V; X39是L、I、V或M; Χ4〇是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、VSM; X4i是Y、F或W，并且 X42是L或I。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中 X38是V; X39是L、I、V或M; X40是G或R; X41是Y，并且 X42是 L。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中X4Q是R。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中與SEQ ID N0:2所示的交配因子α原 肽(氨基酸殘基20-85)相比，所述交配因子α原肽變體在Χ38_Χ 42序列之外具有少于10個(gè)氨基 酸殘基變化。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酵母攜帶至少一個(gè)降低其0-糖 基化能力的遺傳修飾。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述酵母中的ΡΜΤ1基因缺失。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽包含GLP-1 (9-37) [K34R]或 GLP-l(9-37)[K34R,G37K]〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽由GLP-1(9-37)[K34R]或 GLP-1 (9-37) [K34R]組成。11. 根據(jù)權(quán)利要求9-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽具有N-末端延伸。12. 交配因子α原肽變體，其在位置38-42處的VIGYL序列中具有至少一個(gè)置換，從而包 含通式(I)的氨基酸序列： X38-X39-X40-X4i-X42(SEQ ID NO: 1) (I) 其中 Χ38是F、L、I或V; X39是L、I、V或Μ; Χ4〇是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、VSM; X41是s、y、f、w、l、i、vSm; X42是y、w、l、i、v、mSs; 條件為 X38-X42 不是 VIGYS、VI2YS、VgYL、VIGY^^^IGYL。 13. GLP-1前體，其為一種融合多肽，其包含： -前肽， -交配因子α原肽變體，其在位置38-42處的VIGYL序列中具有至少一個(gè)置換，從而包含 通式(I)的氨基酸序列： X38-X39-X40-X4i-X42(SEQ ID NO: 1) (I) 其中 Χ38是F、L、I或V; X39是L、I、V或Μ; Χ4〇是A、G、S、E、Q、Y、F、W、R、K、H、L、I、VSM; X41是s、y、f、w、l、i、vSm; X42是y、w、l、i、v、mSs; 條件為X38-X42不是VIGYS， -任選的延伸肽，和 -GLP-1 肽。14. 表達(dá)載體，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求12-13中任意一項(xiàng)所述的多肽的DNA序列。15. 包含根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N15/00GK106029688SQ201580010737
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年3月2日
【發(fā)明人】P.諾加亞爾德
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