專利名稱：抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于預(yù)防和治療變異冠狀病毒(Coronavirus)或稱為非典(SARS)病毒感染的藥物制備方法，特別涉及一種采用非典病毒的特異性抗原免疫哺乳動物而制備的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子方法。
本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)移因子分子量小，無免疫原性，且在哺乳動物間無種屬性異性的免疫學(xué)原理。采用非典病毒提取的特異性抗原，免疫哺乳動物，取其脾臟、淋巴結(jié)組織，用分子篩過濾及透析方法提取有效成份，研制出抗非典病毒特異性轉(zhuǎn)移因子。因為人體抗病毒主要是通過細胞免疫和體液免疫的特異性免疫細胞及抗體識別，引起特異性的免疫反應(yīng)，從而殺滅及清除體內(nèi)病毒。轉(zhuǎn)移因子可以把通過特異性抗原免疫的具有針對病毒特異性的免疫信息傳遞給人體免疫細胞，從而引起人體特異和快速的免疫反應(yīng)，殺滅及清除病毒。另外，目前認為非典病毒主要是通過呼吸道傳播，呼吸道病毒侵害人體，一般是必須首先在上呼吸道找到合適的病毒受體，造成上皮細胞感染，然后侵入人體。
本發(fā)明的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子藥物的制備方法如下首先，制備非典病毒抗原。把從病人呼吸道分泌物中分離獲得的非典病毒，接種于已長成單層的Hep-2細胞、人胚腎細胞、人胚肺細胞或雞胚，37℃孵育，每天觀察細胞病變情況，當(dāng)CPE出現(xiàn)+++時或經(jīng)病毒抗原檢測陽性。收集細胞及上清，經(jīng)病毒滅活后超聲打碎，放冰箱冰凍保存。或按非典病毒基因序列用基因工程方法表達制備保護性抗原。
其次，以20％蔗糖沉層濃縮抗原或以不連續(xù)梯度密度離心純化病毒原抗原。將超聲打碎的抗原5000rpm離心20min，棄去沉渣留上清，裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000×g，3h，根據(jù)病毒的分子量確定該病毒所在離心管位置，吸出冰凍保存?zhèn)溆谩?br> 然后，用所提取的病毒抗原免疫動物。挑選健康哺乳動物(羊體重30kg～50kg，豬體重60kg～90kg)，取上述制備的病毒抗原，免疫動物，共免疫5～6次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內(nèi)或皮下多點注射免疫，第3次以后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾及淋巴結(jié)節(jié)組織，低溫冰凍保存?zhèn)溆谩?br> 最后，提取抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子。病毒免疫的動物脾及淋巴結(jié)組織，去其表面的筋膜、脂肪等組織，滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗，剪碎，經(jīng)組織勻漿機高速粉碎，反復(fù)凍融4～6次，每次融化后均再以組織勻漿機高速勻漿粉碎，然后以超濾或透析的方法提取。以透析方法提取時，透析液為0.9％生理鹽水，放4℃冰箱透析，放置24h后收集透析液，并以小于0.2μm的微孔濾膜過濾除菌，放冰箱冰凍保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子藥物通過增強呼吸道的免疫殺傷細胞特異性殺傷功能及調(diào)節(jié)粘膜免疫機制，能夠起到預(yù)防及治療上述病毒感染的作用。
具體實施例方式
以下結(jié)合發(fā)明人給出的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。
依照上述的技術(shù)方案，對于提取的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子藥物進行抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子的安全試驗。
抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子的安全試驗包括①熱原試驗取健康成年兔子5只，耳緣靜脈注射抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子2ml，分別于注射前、注射后30min、1h、2h，肛門測體溫，平均升溫，不超過0.5℃。
②急性毒性實驗取健康小白鼠5只尾靜脈注射抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子0.5ml，72h內(nèi)沒有死亡。
③過敏試驗取體重250g～350g健康豚鼠5只，連續(xù)3次隔日注射本品0.5ml，2周后，再自靜脈注射本品1ml，注射后15min內(nèi)，觀察動物沒有顯豎毛、呼吸困難、痙攣、虛脫及死亡等現(xiàn)象。
④無菌試驗將抗呼吸道病毒轉(zhuǎn)移因子，分別接種于需氧菌、厭氧菌及霉菌培養(yǎng)管內(nèi)，30℃～35℃培養(yǎng)5日內(nèi)沒有細菌生長。
⑤活性測定采用活性淋巴細胞E-玫瑰花試驗，本品的淋巴細胞花結(jié)百分率比對照管高30％以上。
按本發(fā)明方法提取的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子具有如下的理化性質(zhì)1.本發(fā)明因含有少量次黃嘌呤，對光檢查外觀為無色或呈微黃色液體。
2.PH值為7.0～7.2。
3.紫外吸收光譜是本品的一個重要特性，因含有核苷酸，多肽類小分子物質(zhì)成份，其中含有嘌呤及嘧呤鹼基都具有共軛的雙鍵結(jié)構(gòu)，能強烈吸收250nm～255nm波長的紫外光，其最大吸收波長在252±2nm。
4.本發(fā)明因不含大分子蛋白成份，以紫外吸收光譜OD值260nm/280nm≥2.0作為制劑的純度指標(biāo)。
5.多肽含量測定，按Lowry法進行(中國生物制品規(guī)程，1990年版第一部301頁)，多肽含量每ml≥500μg。
6.核糖含量測定(按中國生物制品規(guī)程1990年版第一部321頁)，核糖含量每ml≥50μg。
以下是發(fā)明人給出的具體實施例。
實施例1抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子霧化滴鼻液按上述方法制備的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子每ml加入8000單位慶大霉素或其他可局部應(yīng)用的廣譜抗生素。
因非典病毒主要是通過呼吸道傳播，呼吸道病毒感染首先是病毒感染呼吸道上皮細胞并在局部繁殖或其代謝產(chǎn)物擴散入血造成全身癥狀，同時破壞局部粘膜功能，造成局部菌群失調(diào)致病菌侵入，引起繼發(fā)感染?？狗堑洳《巨D(zhuǎn)移因子霧化滴鼻液所含的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子可起到特異性增強人體T淋巴細胞識別及殺滅病毒能力，阻止病毒在人體進一步擴散，同時所含的抗生素成份可抑制或殺滅局部致病菌的繁殖，防止繼發(fā)感染，減輕或消除臨床癥狀。
用法滴鼻成人每次4～5滴，小兒每次2～3滴，每日4～5次。
滴眼每次1～2滴，每日3～4次。
霧化每次2ml，每日1～2次(可與化痰藥物及抗生素聯(lián)用)。
貯藏及有效期冰凍保存(勿反復(fù)凍融)有效期30個月。每次用后放4℃冰箱。
實施例2抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子注射液上述方法制備的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子經(jīng)除菌過濾后，無菌分裝安瓿內(nèi)，每支2ml，火燃封口。
抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子注射液可直接將較大劑量的活性抗病毒轉(zhuǎn)移因子注入肌體內(nèi)，能快速高效調(diào)動人體免疫系統(tǒng)，增強非典抗病毒能力。
用法肌肉注射兒童每次1ml～2ml，成人每次2ml～4ml，每日或隔日注射一次。
貯藏及有效日期冰凍保存(勿反復(fù)凍融)有效期30個月。
權(quán)利要求
1.抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)制備非典病毒抗原將從病人呼吸道分泌物中分離獲得的非典病毒，接種于已長成單層的Hep-2細胞、人胚腎細胞、人胚肺細胞或雞胚，37℃孵育，每天觀察細胞病變情況，當(dāng)CPE出現(xiàn)+++時或經(jīng)病毒抗原檢測陽性；收集細胞及上清，經(jīng)病毒滅活后超聲打碎，放冰箱冰凍保存；或按非典病毒基因序列用基因工程方法表達制備保護性抗原；2)以蔗糖沉層濃縮，以不連續(xù)梯度密度離心純化病毒抗原將超聲打碎的抗原5000rpm離心20min，棄去沉渣留上清，裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000×g、3h，根據(jù)病毒的分子量確定該病毒所在離心管位置，吸出冰凍保存?zhèn)溆谩?)用所提取的病毒抗原免疫動物挑選健康哺乳動物，取上述制備的病毒抗原免疫動物，共免疫5～6次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機打勻，在動物皮內(nèi)或皮下多點注射免疫，第3次以后在動物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7天后取動物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測上述病毒的特異性抗體效價，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價后，宰殺動物，取脾及淋巴結(jié)節(jié)組織，低溫冰凍保存?zhèn)溆茫?)從免疫動物中提取抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子病毒免疫的動物脾及淋巴結(jié)組織，去其表面的筋膜、脂肪等組織，滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗，剪碎，經(jīng)組織勻漿機高速粉碎，反復(fù)凍融4～6次，每次融化后均再以組織勻漿機高速勻漿粉碎，然后以超濾或透析的方法提取抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法，其特征在于，所述以透析或超濾方法提取時，透析液為0.9％生理鹽水，放4℃冰箱透析，放置24h后收集透析液并以小于0.2μm的微孔濾膜過濾除菌即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子制備方法，首先，非典病毒經(jīng)Hep－2細胞、人胚腎細胞、人胚肺細胞或雞胚培養(yǎng)增殖，制備非典病毒抗原以及根據(jù)非典病毒的基因序列用基因工程方法表達制備的保護性抗原。其次，以不連續(xù)梯度密度離心純化病毒抗原，或以20％蔗糖沉層濃縮抗原。然后，用所提取的病毒抗原免疫動物。最后，從免疫動物中提取抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子。本發(fā)明的抗非典病毒轉(zhuǎn)移因子藥物通過增強呼吸道的免疫殺傷細胞特異性殺傷功能及調(diào)節(jié)粘膜免疫機制，能夠起到預(yù)防及治療上述病毒感染的作用，可以制備成注射液或滴鼻液藥物，具有既可預(yù)防，又可治療，標(biāo)本兼治的特點。
文檔編號C07K14/495GK1439424SQ0310800
公開日2003年9月3日 申請日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月30日
發(fā)明者許東亮, 張國成 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院