用于原位檢測核酸的超靈敏方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請的引用
[0002] 本申請是申請日為2011年10月21日，申請?zhí)枮?01180062037. 1，發(fā)明名稱為 "用于原位檢測核酸的超靈敏方法"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。本申請要求于2010 年10月21日提交的代理人卷號no. 12790-021-888的標(biāo)題為"用于原位檢測核酸的超 靈敏方法（ULTRASENSITIVEMETHODFORINSITUDETECTIONOFNUCLEICACIDS) " 的 美國臨時專利申請第61/405, 503號（Wu等人）和2010年11月10日提交的代理人卷號 no. 12790-022-888的標(biāo)題為"用于原位檢測核酸的超靈敏方法（ULTRASENSITIVEMETHOD FORINSITUDETECTIONOFNUCLEICACIDS)" 的美國臨時專利申請第 61/412, 276 號（Wu 等人）的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益。這些申請中的每一個均出于各種目的以其全部內(nèi)容以引用方式并 入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明總體上涉及核酸化學(xué)和生物化學(xué)測定。更具體地，本發(fā)明涉及用于原位檢 測樣品中核酸分析物的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 原位雜交（ISH)是一種允許檢測和定位保存形態(tài)的單個細(xì)胞、組織學(xué)組織切片或 染色體制備中的特定核酸分子的技術(shù)。在1969年首次描述了這種技術(shù)，并且該技術(shù)基于 核苷酸探針與細(xì)胞中DNA或RNA的特異性目標(biāo)序列的互補(bǔ)雜交。其可以是內(nèi)源DNA、信使 RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、病毒序列或細(xì)菌序列。用報告分子標(biāo)記所加入的探針，并且通 過熒光（熒光原位雜交，F(xiàn)ISH)或顯色（顯色原位雜交，CISH)使結(jié)合位點可見。
[0005] 在人類全基因組測序完成后，近年來在公共數(shù)據(jù)庫和非公共數(shù)據(jù)庫中已注釋了成 千上萬個新的人基因序列。由于它相對容易、快速并且廉價地設(shè)計并合成了用于檢測細(xì)胞 中任何新基因的特定序列的反義探針，因此這為ISH打開了新的大門。通過ISH可以獲得 基因的組織特異性和細(xì)胞類型特異性表達(dá)模式以及表達(dá)水平，這將為分析基因功能提供有 價值的信息。
[0006] 然而，由于ISH技術(shù)的靈敏度和特異性較差而不能檢測細(xì)胞中低拷貝數(shù)的DNA或 RNA靶標(biāo)，這會限制它們的應(yīng)用。將ISH應(yīng)用于臨床標(biāo)準(zhǔn)是特別困難的，其中使用福爾馬林 固定和石蠟包埋（FFPE)來保存臨床組織樣品是世界上最常使用的方法。FFPE法良好地保 存了組織形態(tài)，但是通過甲醛的交聯(lián)固定會導(dǎo)致目標(biāo)序列與檢測探針的可接近性較差，探 針分子與其他分子或結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)或物理相互作用較差，以及對核酸（尤其是mRNA)的 損傷。
[0007] 為了克服ISH的限制并擴(kuò)展它在診斷病理學(xué)中的應(yīng)用，已開發(fā)了幾種策略以改善 ISH的靈敏度。最近，AdvancedCellDiagnostics,Inc.開發(fā)出 了稱為RNAscope?的新 型ISH信號放大方法（美國專利第7, 709, 198號）。這種測定包括獨特設(shè)計的低聚捕獲探針 以及由預(yù)擴(kuò)增子（preamplifier)、擴(kuò)增子（amplifier)和標(biāo)記探針組成的信號放大系統(tǒng)， 從而使得能夠在不放大背景信號的情況下顯著放大信號，并能夠?qū)缀跞魏位蜻M(jìn)行單個RNA分子檢測。在圖1中示意地說明了RNAscope?技術(shù)的示例性實施方式并且將在本申 請的第二部分中詳細(xì)說明。
[0008] 在用于檢測目標(biāo)核酸的典型RNAscope?測定中，待檢測其表達(dá)的目標(biāo)mRNA從 細(xì)胞中釋放并被到固體表面（例如，微量滴定板的孔）上。還提供了一組兩個或更多個捕 獲探針和信號產(chǎn)生多聚體。所述捕獲探針與目標(biāo)核酸和信號產(chǎn)生多聚體兩者雜交，并因此 將信號產(chǎn)生多聚體捕獲至目標(biāo)核酸。所述信號產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針（LP)。但是更通常 地，除標(biāo)記探針外，所述信號產(chǎn)生多聚體包含預(yù)擴(kuò)增子和/或擴(kuò)增子。所述標(biāo)記探針能夠結(jié) 合至提供可檢測信號的標(biāo)記顆?；蚍肿印?biāo)記探針具有使得能夠連接多個標(biāo)記顆?；蚍肿?的較大分子結(jié)構(gòu)，其提供了比單個標(biāo)記顆?；蚍肿痈鼜?qiáng)的信號。因此，RNAscope?改善了 核酸檢測的靈敏度和特異性。
[0009] 然而，單獨利用RNAscope?仍不能可靠地檢測以往的其中RNA被顯著降解 的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE)的組織切片中的一些低拷貝基因。另外，使用當(dāng)前的 RNAscope?技術(shù)不能使單個RNA分子以40X放大顯象。期望進(jìn)一步增強(qiáng)檢測信號以使 得能夠更穩(wěn)健地檢測任何RNA分子，包括顯著降解的RNA分子，并允許對所檢測的RNA信號 以10X放大容易地顯像。
[0010] 在本申請中，我們描述了新型ISH信號放大測定以通過將兩種信號放大方法合并 到一個系統(tǒng)中來擴(kuò)展ISH在診斷病理學(xué)中的應(yīng)用。該系統(tǒng)具有三種形式：（1)RNAscope? 與生物素-(抗生蛋白鏈菌素）抗生物素蛋白組合，（2) RNAscope'?與抗體組合， (3) RNAscope?與酪胺信號放大（TSA)組合。所有這些方法能夠利用RNAscope?技術(shù) 優(yōu)越的特異性和三種放大方法的放大能力。我們出人意料地發(fā)現(xiàn)上述三種組合信號放大方 法能夠顯著放大與樣品中目標(biāo)核酸的存在有關(guān)的信號并同時具有優(yōu)異的信噪比。
[0011] 基于兩種分子對彼此具有非常高的親合力，并且一個抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈 菌素分子可以結(jié)合四個生物素分子這一事實，生物素-抗生物素蛋白（或生物素-抗生蛋 白鏈菌素）是一種公知的信號放大系統(tǒng)。抗體在免疫組織化學(xué)和ISH中被廣泛用于信號放 大。TSA基于通過過氧化物酶活性的多個半抗原酪胺分子的沉積。酪胺是酚類化合物。在 存在少量過氧化氫的情況下，固定化辣根過氧化物酶（HRP)將標(biāo)記的底物轉(zhuǎn)化為存活期短 的（short-lived)、反應(yīng)性極強(qiáng)的中間體。然后，在過氧化物酶結(jié)合位點處或附近，活化的底 物分子極快速地與蛋白質(zhì)的富電子部分（如酪氨酸）反應(yīng)并與其共價結(jié)合。以這種方式， 能夠在雜交位點原位引入結(jié)合至酪胺的大量額外的半抗原分子。隨后，可以直接或間接地 使沉積的酪胺-半抗原分子顯象。
[0012] 已在ISH中使用了所有這些信號放大方法并獲得了不同程度的成功，但是通常對 于日常診斷病理學(xué)而言，信號強(qiáng)度和/或信噪比還不夠好。就TSA而言，具體地，當(dāng)在ISH 中單獨使用時，產(chǎn)生了大量的背景噪聲。每一天和每個實驗室的一致性還達(dá)不到所期望的 要求。
[0013] 考慮到上述情況，需要以高強(qiáng)度和高特異性地放大核酸的方法。對于這種方法，還 需要其具有高度的一致性。本發(fā)明提供了這些和其他特征，可通過閱讀以下內(nèi)容顯而易見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明將RNAscope?的信號放大方法與常規(guī)ISH信號放大方法組合為超敏感 方法以檢測、定量和鑒別樣品中的一種或多種目標(biāo)核酸。由于其獨特的成對捕獲探針設(shè)計， RNAscope?測定提供了優(yōu)越的特異性。通過將常規(guī)ish信號放大方法（例如基于TSA的 信號放大）添加至RNAscope?測定，該組合方法實現(xiàn)了高信號強(qiáng)度和低背景值。本發(fā)明 所公開的信號放大方法和系統(tǒng)相對易于使用并且產(chǎn)生一致的結(jié)果。所要求保護(hù)的方法能夠 容易地適合于在常規(guī)臨床診斷程序中使用。
[0015] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，平衡了所公開的信號放大方法的特異性和靈敏 性。通過適度減小RNAscope?中信號放大的倍數(shù)實現(xiàn)了這種平衡。在本發(fā)明的一種實施 方式中，一個預(yù)擴(kuò)增子被設(shè)計為結(jié)合1至16個擴(kuò)增子。在一種優(yōu)選的實施方式中，一個預(yù) 擴(kuò)增子被設(shè)計為結(jié)合2至10個擴(kuò)增子。在另一種更優(yōu)選的實施方式中，一個預(yù)擴(kuò)增子被設(shè) 計為結(jié)合2至5個擴(kuò)增子。
[0016] 在檢測樣品中目標(biāo)核酸的優(yōu)選實施方式中，首先提供包含或懷疑包含所述目標(biāo)核 酸的樣品，以及能夠與所述目標(biāo)核酸雜交的至少一組兩個或更多個捕獲探針、能夠雜交至 該兩個或更多個捕獲探針的組的信號產(chǎn)生多聚體（其中所述信號產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探 針）、和能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的信號放大探針（其中所述信號放大探針包含標(biāo)記物）。 在所述方法中，首先將目標(biāo)核酸雜交至兩個或更多個捕獲探針的組，然后將所述信號產(chǎn)生 多聚體捕獲至所述兩個或更多個捕獲探針的組，并借此將所述信號產(chǎn)生多聚體捕獲至所述 目標(biāo)核酸。然后，將所述信號放大探針捕獲至所述標(biāo)記探針，并借此捕獲至所述信號產(chǎn)生多 聚體。在最后一步中，檢測信號放大探針中標(biāo)記物的存在、不存在或量。
[0017] 在一種實施方式中，所述信號放大探針包含：能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的生物素 分子，能夠結(jié)合至所述生物素分子的抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素分子，以及結(jié)合至辣 根過氧化物酶（HRP)、堿性磷酸酶（AP)或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合至抗生物素蛋白/抗生蛋白 鏈菌素分子的另外的生物素分子。
[0018] 在另一種實施方式中，所述信號放大探針包含：能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP、 AP、二硝基苯基（DNP)或熒光團(tuán)分子，能夠結(jié)合至所述HRP、AP、DNP或熒光團(tuán)分子的一種或 多種第一抗體，以及結(jié)合至HRP、聚合物-HRP、AP、聚合物-AP或熒光團(tuán)并且能夠結(jié)合所述一 種或多種第一抗體的一種或多種第二抗體。
[0019]在另一種實施方式中，所述信號放大探針包含：能夠結(jié)合至所述標(biāo)記探針的HRP分子、多個能夠與所述HRP分子反應(yīng)的酪胺-生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子、以及能夠可見地 檢測所述酪胺_生物素或酪胺-熒光團(tuán)分子的檢測標(biāo)記物。所述檢測標(biāo)記物是抗生物素蛋 白/抗生蛋白鏈菌素-HRP和顯色底物的組合或抗生物素蛋白/抗生蛋白鏈菌素-AP和顯 色底物的組合。所述顯色底物選自：二氨基聯(lián)苯胺（DAB)和固紅。
[0020] 在一種實施方式中，所述信號產(chǎn)生多聚體包含能夠雜交至兩個或更多個捕獲探針 的組的標(biāo)記探針。在另一種實施方式中，所述信號產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針和雜交至所述 標(biāo)記探針的擴(kuò)增子。所述擴(kuò)增子能夠雜交至所述兩個或更多個捕獲探針的組。在一種優(yōu)選 的實施方式中，所述信號產(chǎn)生多聚體包含標(biāo)記探針、雜交至所述標(biāo)記物的擴(kuò)增子和雜交至 一種或多種擴(kuò)增子的預(yù)擴(kuò)增子。所述預(yù)擴(kuò)增子能夠雜交至所述兩個或更多個捕獲探針的 組。
[0021] 所述目標(biāo)核酸可以是任何類型的，例如，DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA、miRNA、siRNA 和/或等等。
[0022] 在一種實施方式中，可以在進(jìn)行雜交之前在固體載體上發(fā)生放大。
[002