一種活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，本發(fā)明確認了活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源和最佳配伍比例。利用本發(fā)明中提供的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵控制工藝，能夠提高那西肽發(fā)酵單位，降低發(fā)酵成本，并且最大限度的降低原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應充足，實現(xiàn)那西肽穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。
【專利說明】
一種活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)酵技術領域，特別是涉及一種活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]那西肽又稱諾西肽，是一種抗生素，采用活躍鏈霉菌發(fā)酵模式生產(chǎn)，目前那西肽已被列入歐洲藥典以及日本飼料安全法，許多國家和地區(qū)都在使用那西肽。我國農(nóng)業(yè)部將那西肽列為可在飼料中長期添加的飼料添加劑。
[0003]目前，國內(nèi)相關文獻報道了那西肽生產(chǎn)工藝，其發(fā)酵模式分別為二級發(fā)酵或三級發(fā)酵。存在的問題是:
I工業(yè)化大生產(chǎn)發(fā)酵水平較低，其發(fā)酵水平維持在1500-1800ug/L左右。
[0004]2國內(nèi)缺少那西肽完整的發(fā)酵工藝文獻報道，并且相關的文獻報道以試驗為主，不能夠為大生產(chǎn)模式提供有效地技術支持。
[0005]3那西肽大生產(chǎn)發(fā)酵周期長，一般在240h左右，能耗高。
[0006]4那西肽發(fā)酵綜合生產(chǎn)成本較高，產(chǎn)品缺乏市場競爭力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種發(fā)酵工藝簡單，有效提高發(fā)酵單位，同時最大限度的降低原輔料對發(fā)酵單位的影響，降低生產(chǎn)成本，且原輔料來源不受環(huán)境影響，保證其供應充足，實現(xiàn)那西肽穩(wěn)定、高效生產(chǎn)的活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供利用上述培養(yǎng)基生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的所采取的技術方案為:
一種活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基，其特征在于包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中
所述種子培養(yǎng)基的組成為:
葡聚糖4?8g/L、糖原8?12g/L、麥芽汁6?10ml/L、魚粉9?13g/L、棉籽餅粉11?15g/L、玉米蛋白粉13?17g/L、硫酸錢0.04?0.088凡、輕質(zhì)碳酸|丐1?58凡；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:
葡聚糖6?10g/L、糖原10?14g/L、麥芽汁8?12ml/L、魚粉11?15g/L、棉籽餅粉13?17g/L、玉米蛋白粉14?18g/L、蠶蛹蛋白胨7?1]^凡、海藻粉4?88/1、硫酸錢0.06?0.8區(qū)/L、輕質(zhì)碳酸鈣I?5g/L、磷酸二氫鉀0.05?0.09g/L、硫酸鎂0.03?0.07g/L、硫酸鎳0.006?0.01g/L、氯化鈉0.02?0.06g/L、聚醚改性硅油0.5?0.9ml/L、液態(tài)烷烴0.3?0.7ml/L。
[0010]所述液態(tài)烷烴是指正十二烷和正十三烷油的混合物，其中正十二烷的含量為85-90%。
[0011]—種利用上述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為: 1)種子培養(yǎng):首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照2?3L/m3的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，至菌體濃度26?30%、培養(yǎng)時間40?45h移種；
2)發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，至菌體濃度38?42%、發(fā)酵周期不超過220h，化學效價>2300ug/ml終止發(fā)酵。
[0012]所述種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮>30mg/L、溶磷100?140ug/ml、月旨肪6?10g/L;
所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮>50mg/L、溶磷40?80ug/ml、脂肪12?16g/L0
[0013]所述培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:菌體濃度20?30%;鏡檢無雜菌。
[0014]所述種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:30?50m3/h;攪拌轉(zhuǎn)速60?80r/min。
[0015]所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在5?7; b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在100-120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:300?400m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧，
81?160h，溶氧控制在40%以上，
16 Ih?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0016]所述發(fā)酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補甘蔗糖蜜、補水、補硫酸銨，其中
a補甘鹿糖蜜工藝控制:
分別在發(fā)酵90h、150h補入甘蔗糖蜜，其加量為發(fā)酵液體積的0.2-0.3%; b補水工藝控制:
發(fā)酵前SOh不用進行補水，
發(fā)酵時間在81?100h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在40?45%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度，
發(fā)酵時間在1lh?發(fā)酵結束，當菌體濃度高于42%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在38?42%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；c補硫酸錢:
在發(fā)酵80h和120h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03%。本發(fā)明的技術優(yōu)勢體現(xiàn)在:
I本發(fā)明確認了活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源和最佳配伍比例。
[0017]2本發(fā)明對種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)的工藝進行了詳細的闡述，確認了那西肽最佳的發(fā)酵工藝和控制參數(shù)。通過本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)那西肽，其發(fā)酵單位達到2300ug/ml以上，同國內(nèi)技術相比，發(fā)酵單位提高了27%以上;發(fā)酵周期控制在220h以內(nèi)，降低了發(fā)酵能耗。
[0018]3本發(fā)明適用于工業(yè)化規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)那西肽。
[0019]具體實施方法
下面用實例予以說明本發(fā)明，應該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權利要求書加以確定。
[0020]下述實施例的菌種選用活躍鏈霉菌:生產(chǎn)使用的菌種來源為母瓶發(fā)酵液。母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:菌體濃度20?30%;鏡檢無雜菌。
[0021]實施例1
種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積I Om3。
[0022]葡聚糖40kg、糖原80kg、麥芽汁60L、魚粉90kg、棉籽餅粉110kg、玉米蛋白粉130kg、硫酸錢0.4kg、輕質(zhì)碳酸|丐I Okg ；
首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20 V，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮32mg/L、溶磷lOlug/ml、脂肪6.2g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照20L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?
0.06MPa ；罐溫28?29 °C ；空氣流量:30m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，至菌體濃度26%、培養(yǎng)時間40h移種。
[0023]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0024]葡聚糖600kg、糖原1000kg、麥芽汁800L、魚粉1100kg、棉籽餅粉1300kg、玉米蛋白粉1400kg、蠶蛹蛋白胨700kg、海藻粉400kg、硫酸錢6kg、輕質(zhì)碳酸I1^lOOkg、磷酸二氫鉀5kg、硫酸鎂3kg、硫酸鎳0.6kg、氯化鈉2kg、聚醚改性硅油50L、液態(tài)烷烴30L。
[0025]先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量為:氨基氮53mg/L、溶磷42ug/ml、脂肪12g/L。然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0026]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在5.0; b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在100r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:300m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧，
81?160h，溶氧控制在40%以上，
161?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度38%、發(fā)酵周期210h，化學效價2308ug/ml。
[0028]實施例2 種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積I Om3 ο
[0029]葡聚糖50kg、糖原90kg、麥芽汁70L、魚粉100kg、棉籽餅粉140kg、玉米蛋白粉140kg、硫酸錢0.5kg、輕質(zhì)碳酸I3^Okg;
首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至22 V，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮35mg/L、溶磷lllug/ml、脂肪7g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照22L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:35m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速65r/min，至菌體濃度27%、培養(yǎng)時間41h移種。
[0030]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0031]葡聚糖700kg、糖原1100kg、麥芽汁900L、魚粉1200kg、棉籽餅粉1400kg、玉米蛋白粉1500kg、蠶蛹蛋白胨800kg、海藻粉500kg、硫酸錢7kg、輕質(zhì)碳酸I3^OOkg、磷酸二氫鉀6kg、硫酸鎂4kg、硫酸鎳0.7kg、氯化鈉3kg、聚醚改性硅油60L、液態(tài)烷烴40L。
[0032]先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至22°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量為:氨基氮57mg/L、溶磷51ug/ml、脂肪13g/L。然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0033]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在5.5; b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在105r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:320m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧，
81?160h，溶氧控制在40%以上，
161?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0034]發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度39%、發(fā)酵周期212h，化學效價2374ug/ml。
[0035]實施例3
種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積I Om3。
[0036]葡聚糖60kg、糖原100kg、麥芽汁80L、魚粉110kg、棉籽餅粉150kg、玉米蛋白粉150kg、硫酸錢0.6kg、輕質(zhì)碳酸I3^Okg;
首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至23 V，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮39mg/L、溶磷122ug/ml、脂肪8g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照25L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?
0.06MPa ；罐溫28?29 °C ；空氣流量:40m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速70r/min，至菌體濃度28%、培養(yǎng)時間42h移種。
[0037]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0038]葡聚糖800kg、糖原1200kg、麥芽汁1000L、魚粉1300kg、棉籽餅粉1500kg、玉米蛋白粉1600kg、蠶蛹蛋白胨900kg、海藻粉600kg、硫酸錢8kg、輕質(zhì)碳酸I3^OOkg、磷酸二氫鉀7kg、硫酸鎂5kg、硫酸鎳0.8kg、氯化鈉4kg、聚醚改性硅油70L、液態(tài)烷烴50L。
[0039]先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至23°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量為:氨基氮62mg/L、溶磷60ug/ml、脂肪14g/L。然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0040]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6; b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在110r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:350m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧，
81?160h，溶氧控制在40%以上，
161?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0041 ]發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度40%、發(fā)酵周期215h，化學效價2468ug/ml。
[0042]實施例4
種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積I Om3。
[0043]葡聚糖70kg、糖原110kg、麥芽汁90L、魚粉120kg、棉籽餅粉160kg、玉米蛋白粉160kg、硫酸錢0.7kg、輕質(zhì)碳酸I3HOkg。
[0044]首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至24°C，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮43mg/L、溶磷131ug/ml、脂肪9g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照28L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:45m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速75r/min，至菌體濃度29%、培養(yǎng)時間43h移種。
[0045]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0046]葡聚糖900kg、糖原1300kg、麥芽汁1100L、魚粉1400kg、棉籽餅粉1600kg、玉米蛋白粉1700kg、蠶蛹蛋白胨1000kg、海藻粉700kg、硫酸錢9kg、輕質(zhì)碳酸I11HOOkg、磷酸二氫鉀8kg、硫酸鎂6kg、硫酸鎳0.9kg、氯化鈉5kg、聚醚改性硅油80L、液態(tài)烷烴60L。
[0047]先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至24°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量為:氨基氮66mg/L、溶磷71ug/ml、脂肪15g/L。然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0048]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6.5; b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在115r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:370m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧，
81?160h，溶氧控制在40%以上，
161?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0049]發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度41%、發(fā)酵周期217h，化學效價2390ug/ml。
[0050]實施例5
種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積I Om3。
[0051 ]葡聚糖80kg、糖原120kg、麥芽汁100L、魚粉130kg、棉籽餅粉150 kg、玉米蛋白粉170kg、硫酸錢0.8kg、輕質(zhì)碳酸I3^Okg。
[0052]首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮47mg/L、溶磷140ug/ml、脂肪10g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照30L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓
0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:50m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速80r/min，至菌體濃度30%、培養(yǎng)時間44h移種。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0054]葡聚糖1000kg、糖原1400kg、麥芽汁1200L、魚粉1500kg、棉籽餅粉1700kg、玉米蛋白粉1800kg、蠶蛹蛋白胨1100kg、海藻粉800kg、硫酸錢10kg、輕質(zhì)碳酸I丐500kg、磷酸二氫鉀9kg、硫酸鎂7kg、硫酸鎳I kg、氯化鈉6kg、聚醚改性娃油90L、液態(tài)燒經(jīng)7OL。
[0055]先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量為:氨基氮70mg/L、溶磷80ug/ml、脂肪16g/L。然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0056]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在7 b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:400m3/h， h溶氧控制:
發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧，
81?160h，溶氧控制在40%以上，
161?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。
[0057]發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度42%、發(fā)酵周期220h，化學效價2327ug/ml。
[0058]上述實施例1-5的發(fā)酵過程中，根據(jù)檢測情況，采用流加法進行補料，補料包括補甘蔗糖蜜、補水、補硫酸銨。
[0059]a補甘蔗糖蜜工藝控制:
分別在90h、150h補入甘蔗糖蜜，其加量為發(fā)酵液體積的0.2-0.3%。
[0060]b補水工藝控制:
發(fā)酵前SOh不用進行補水， 發(fā)酵時間在81?100h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在40?45%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度，
發(fā)酵時間在1lh?發(fā)酵結束，當菌體濃度高于42%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在38?42%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；c補硫酸錢:
在發(fā)酵80h和120h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03% ο[0061 ]對比實施例1(三級發(fā)酵模式)
一級種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積為Im3
可溶性淀粉7kg、葡萄糖10kg、黃豆粉12kg、蛋白胨I lkg、玉米楽；15kg、硫酸錢0.05kg、輕質(zhì)碳酸I11Hkgc3
[0062]首先將一級種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮3.4mg/L、溶磷12ug/ml、脂肪0.9g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照2L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:1m3A;攪拌轉(zhuǎn)速80r/min，至菌體濃度20%、培養(yǎng)時間40h移種。
[0063]二級種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積10m3。
[0064]可溶性淀粉80kg、葡萄糖120kg、黃豆粉130kg、蛋白胨150 kg、玉米楽170kg、酵母膏120kg、130硫酸錢0.8kg、輕質(zhì)碳酸I3^Okg。
[0065]首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮42mg/L、溶磷129ug/ml、脂肪8g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的一級種子液接入二級種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。二級種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ;空氣流量:50m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速80r/min，至菌體濃度30%、培養(yǎng)時間45h移種。
[0066]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0067 ] 可溶性1200kg、葡萄糖1600kg、、黃豆粉1700kg、蛋白胨900kg、玉米楽1400kg、酵母膏1100kg、甘氨酸100kg、硫酸銨9kg、輕質(zhì)碳酸鈣500kg、磷酸二氫鉀9kg、硫酸鎂7kg、硫酸亞鐵6kg、硫酸猛lkg、氯化鈉6kg。
[0068]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6-6.5， b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:500m3/h，
發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度38%、發(fā)酵周期240h，化學效價1735ug/ml。
[0069]對比實施例2(二級發(fā)酵模式)
種子培養(yǎng):培養(yǎng)基體積I Om3。
[0070]液化淀粉100kg、葡萄糖100kg、乳糖60kg、黃豆餅粉120kg、蛋白胨130 kg、玉米漿160kg、糊精120kg、硫酸錢0.9kg、輕質(zhì)碳酸I3Hokg。
[0071]首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至25°C，并用無菌空氣保壓，種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量:氨基氮36mg/L、溶磷131ug/ml、脂肪9g/L;然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照30L的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:40m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速80r/min，至菌體濃度35%、培養(yǎng)時間48h移種。
[0072]發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)基體積100m3。
[0073]液化淀粉1100kg、葡萄糖1300kg、乳糖400kg、黃豆餅粉1400kg、蛋白胨1000kg、玉米楽1300kg、糊精1300kg、谷氨酸80kg、甘氨酸100kg、半胱氨酸75kg、硫酸錢8kg、輕質(zhì)碳酸
I丐400kg、磷酸二氫鉀I Okg、硫酸鎂6kg、硫酸亞鐵7kg、硫酸猛0.8kg、氯化鈉5kg。
[0074]發(fā)酵培養(yǎng)條件為:
a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在6-6.5 b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7 ； f空氣流量:500m3/h，
發(fā)酵培養(yǎng)結束，菌體濃度40%、發(fā)酵周期240h，化學效價1513ug/ml。
【主權項】
1.一種活躍鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)基，其特征在于包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，其中 所述種子培養(yǎng)基的組成為: 葡聚糖4?8g/L、糖原8?12g/L、麥芽汁6?10ml/L、魚粉9?13g/L、棉籽餅粉11?15g/L、玉米蛋白粉13?17g/L、硫酸錢0.04?0.088凡、輕質(zhì)碳酸|丐1?58凡； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為: 葡聚糖6?10g/L、糖原10?14g/L、麥芽汁8?12ml/L、魚粉11?15g/L、棉籽餅粉13?17g/L、玉米蛋白粉14?18g/L、蠶蛹蛋白胨7?llg/L、海藻粉4?8g/L、硫酸錢0.06?0.8g/L、輕質(zhì)碳酸鈣I?5g/L、磷酸二氫鉀0.05?0.09g/L、硫酸鎂0.03?0.07g/L、硫酸鎳0.006?0.01g/L、氯化鈉0.02?0.06g/L、聚醚改性硅油0.5?0.9ml/L、液態(tài)烷烴0.3?0.7ml/L。2.按照權利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述液態(tài)烷烴是指正十二烷和正十三烷油的混合物，其中正十二烷的含量為85-90%。3.—種利用權利要求1或2所述培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的培養(yǎng)方法，其特征在于其工藝步驟為: 1)種子培養(yǎng):首先將種子培養(yǎng)基滅菌并冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經(jīng)培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液按照2?3L/m3的接種量接入種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，至菌體濃度26?30%、培養(yǎng)時間40?45h移種； 2)發(fā)酵培養(yǎng):先將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，冷卻至20?25°C，并用無菌空氣保壓，然后將培養(yǎng)好的種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)，至菌體濃度38?42%、發(fā)酵周期不超過220h，化學效價>2300ug/ml終止發(fā)酵。4.按照權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮>30mg/L、溶磷100?140ug/ml、脂肪6?10g/L; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后的質(zhì)量要求為:氨基氮>50mg/L、溶磷40?80ug/ml、脂肪12?16g/L05.按照權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)好的活躍鏈霉菌母瓶發(fā)酵液質(zhì)量要求為:菌體濃度20?30%;鏡檢無雜菌。6.按照權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)條件為:罐壓0.03?0.06MPa ；罐溫28?29°C ；空氣流量:30?50m3/h ；攪拌轉(zhuǎn)速60?80r/min。7.按照權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為: a培養(yǎng)基初始pH:發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后pH控制在5?7; b溫度:培養(yǎng)溫度28?29 °C， c攪拌轉(zhuǎn)速:轉(zhuǎn)速控制在100-120r/min， d壓力控制:罐壓0.05?0.06MPa; e pH控制:發(fā)酵過程中pH控制在5?7； f空氣流量:300?400m3/h， h溶氧控制: 發(fā)酵前80h內(nèi)，不控制溶氧， 81?160h，溶氧控制在40%以上， 161h?發(fā)酵結束:溶氧控制在30%以上。8.按照權利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述發(fā)酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補甘蔗糖蜜、補水、補硫酸銨，其中a補甘鹿糖蜜工藝控制: 分別在發(fā)酵90h、150h補入甘蔗糖蜜，其加量為發(fā)酵液體積的0.2-0.3%; b補水工藝控制: 發(fā)酵前SOh不用進行補水， 發(fā)酵時間在81?10h，當菌體濃度高于45%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在40?45%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度， 發(fā)酵時間在1lh?發(fā)酵結束，當菌體濃度高于42%，加入滅菌水，要求控制發(fā)酵液菌體濃度在38?42%，每隔6?8h檢測發(fā)酵液菌體濃度；c補硫酸錢: 在發(fā)酵80h和120h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發(fā)酵液體積的0.01?0.03% ο
【文檔編號】C12P21/02GK106047967SQ201610701929
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月23日
【發(fā)明人】任勇
【申請人】寧夏泰瑞制藥股份有限公司