一種預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的制劑及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的制劑及其制備方法，詳細(xì)的發(fā)明點(diǎn)在于多粘類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的菌懸液或者該菌代謝產(chǎn)物的提取物能夠用于預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病。該菌種于申請(qǐng)日前已被本領(lǐng)域技術(shù)人員保存于德國(guó)微生物保藏中心，保藏號(hào)為DSM 36。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的生物制劑及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘薦鳳梨病是甘薦種苗期發(fā)生的一種真菌病害，甘薦鳳梨病最明顯的特征是薦種 感病初期切口兩端變紅，并伴有渡蘿(鳳梨)的香味，隨之病薦內(nèi)部組織變紅。甘薦鳳梨病病 原菌為奇異根串珠霉。薦種一旦被病原菌感染就會(huì)造成種莖受害不能發(fā)芽，萌芽率降低，給 甘薦生產(chǎn)造成不同程度的損失。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)甘薦鳳梨病W化學(xué)藥物防治為主，例如生產(chǎn)上常使用多菌靈可濕性粉 劑1000倍稀釋液浸泡薦種進(jìn)行防治。其中常用粉劑還有精甲霜靈?咯菌臘?嚷蟲(chóng)嗦FS，SC 苯酸甲環(huán)挫.喀菌醋，阿米妙收懸浮劑，浸種靈，石灰水快速浸種，70%甲基托布津可濕性 粉劑，50%苯萊特，苯驕咪哇44號(hào)（多菌靈）、四氯苯獻(xiàn)、五氧吩嗦。多年來(lái)，甘薦鳳梨病防治 藥劑篩選較少，主要為化學(xué)藥劑。然而過(guò)度使用化學(xué)藥物不可避免的導(dǎo)致藥物殘留、病原菌 耐藥性W及環(huán)境污染等問(wèn)題。
[0004] 近年來(lái)，世界上普遍認(rèn)為生物防治是解決農(nóng)作物真菌病害最有希望的途徑之一， 所W迫切需要發(fā)明一種能夠有效防治甘薦鳳梨病的微生物制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種能夠有效防治甘薦鳳梨病的微生物制劑，可W避 免過(guò)度使用化學(xué)藥物導(dǎo)致農(nóng)藥殘留和病原菌耐藥性增加等問(wèn)題。具體技術(shù)方案為：
[0006] 選用多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的 菌懸液或者該菌代謝產(chǎn)物的提取物作為有效成分制成制劑，直接噴灑至需要預(yù)防或者治療 甘薦鳳梨病的甘薦表面，起到預(yù)防或者治療目的。
[0007] 其中，多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)，為現(xiàn)有微生 物，在本申請(qǐng)日之前已經(jīng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員保藏于德國(guó)微生物保藏中屯、，保藏號(hào)為DSM 36。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可聯(lián)系該保藏機(jī)構(gòu)獲得該菌種，聯(lián)系電話:+49(0)531-2616-0、傳真:+49 (0)531-2616-418、郵箱：E-mail: contact@dsmz . de ;其他事宜，可 W到其官網(wǎng)https : // WWW. dsmz. de/contact. htmlLeibniz-Institut查詢。
[000引上述制劑的提取及制備方式為取多粘類(lèi)芽抱桿菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的菌懸液離屯、后取 其上清液作為微生物制劑；
[0009] 上述制劑優(yōu)選的提取及制備方式為：
[0010] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌的菌懸液1體積份，其有效菌濃度為103-108c化/ml ,10000- 14000巧m離屯、8-12min后取上清；
[0011] 2)在離屯、上清液中加入乙醇，使得醇濃度為20%-90%，靜置后離屯、，取其沉淀，將 沉淀溶于所取菌懸液2-6倍體積份的無(wú)菌水中，既得一種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的 制劑。
[0012] 上述更優(yōu)選的提取及制備方式為：
[0013] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌的菌懸液1體積份，其有效菌濃度為106-107C化/ml ,1200化pm 離屯、lOmin后取上清；
[0014] 2)在離屯、上清液中加入乙醇，使得醇濃度為70%，于4攝氏度靜置2小時(shí)后5000rpm 離屯、lOmin，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液4倍體積份的無(wú)菌水中，即得。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)明點(diǎn)在于提供一種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑的制 備方法，所述制備方法如下：
[0016] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌懸液；
[0017] 2)上述菌懸液經(jīng)過(guò)離屯、處理后取上清液，既得。
[0018] 其中，優(yōu)選的制備方法如下：
[0019] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 LB液體培養(yǎng)基中30-35攝氏度，200-240rpm震蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)，得到有效菌濃度為103- 108c化/ml的菌懸液，其中有效菌濃度是指發(fā)酵液中的菌濃度；
[0020] 2)取上述菌懸液經(jīng)過(guò)離屯、處理后得到上清液，在上清液中加入乙醇，使得醇濃度 為20 %-90 %，靜置后離屯、，取其沉淀，將沉淀溶于無(wú)菌水中，即為預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病 的制劑。
[0021 ] 其中步驟1，優(yōu)選的方法為:取多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中33攝氏度，220rpm震蕩培養(yǎng)36小時(shí)，得到有效菌濃度 為106-107cfu/ml的菌懸液。
[0022] 其中步驟2,優(yōu)選的方法為:取1體積份步驟1中得到的菌懸液，10000-14000rpm離 屯、8-12min后，取上清液加入乙醇，使得醇濃度為60-80 %，低溫靜置1-3小時(shí)后2000- 700化pm離屯、5-15min，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液體積份2-6倍量的無(wú)菌水中，得到 多粘類(lèi)芽抱桿菌代謝產(chǎn)物的提取物，即為預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑。
[0023] 其中步驟2,更優(yōu)選的方法為：取1體積份步驟1中得到的菌懸液，12000rpm離屯、 lOmin后，取上清液加入乙醇，使得醇濃度為70 %，于4攝氏度靜置2小時(shí)后5000巧m離屯、 lOmin，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液體積份4倍量的無(wú)菌水中，即為預(yù)防或者治療甘薦 鳳梨病的制劑。
[0024] 上述用于培養(yǎng)多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的培 養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基。
[0025] 上述微生物制劑，對(duì)甘薦鳳梨病具有顯著的預(yù)防或者治療作用，由其對(duì)甘薦鳳梨 病病原菌奇異根串珠霉抑制效果顯著，同時(shí)對(duì)甘薦種苗的萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用。
[00%] 本發(fā)明所述的多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)是從 自然界中篩選分離獲得的，經(jīng)過(guò)與現(xiàn)有菌種的比對(duì)，確認(rèn)與德國(guó)微生物保藏中屯、，保藏號(hào)為 DSM 36的菌種(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)屬于同一菌種。
[0027]為獲得能夠有效防治甘薦鳳梨病的微生物制劑，本發(fā)明在研究過(guò)程中進(jìn)行了如下 實(shí)驗(yàn)：
[00%] -、有效微生物的發(fā)現(xiàn)和分離
[0029] 1、從宜州市龍江河沿岸采集±樣，利用濃度梯度稀釋分離法篩菌:稱(chēng)取±樣10邑， 加入裝有90ml無(wú)菌水的錐形瓶中制得±樣懸液，震蕩30min，從懸液中吸取10ml移入90ml無(wú) 菌水的錐形瓶中，依次稀釋到6個(gè)錐形瓶為止，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的稀 釋液。分別取lOOullO-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液涂布于LB培養(yǎng)基(蛋白腺lOg，酵母粉5g， NaC110g，瓊脂粉20g，蒸饋水1000ml，pH7.2~7.4)中，置于30度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4化后，挑取 形態(tài)特征相異的單菌落，經(jīng)培養(yǎng)純化后作為供試菌株，實(shí)驗(yàn)過(guò)程共分離出126個(gè)單菌株。
[0030] 2、將甘薦鳳梨病病原菌接種到馬下液體培養(yǎng)基化出K)4 lg，MgS0 ? 7出化0.5g，蛋 白腺5g，葡萄糖lOg，蒸饋水1000mL，pH7.2~7.4)中，ISOrpm培養(yǎng)4她得到指示菌懸液，制備 馬下固體化出P〇4 lg，MgS0- 7此化0.5g，蛋白腺5g，葡萄糖lOg，瓊脂粉20g，蒸饋水1000血， pH7.2~7.4)培養(yǎng)平板涂布指示菌，從培養(yǎng)好的供試菌平板上挖取供試菌(菌塊)放到剛制 備好的指示菌平板上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，觀察供試菌(菌塊)周?chē)袩o(wú)抑菌圈及 抑菌圈大小。步驟1中分離得到的126個(gè)單菌株，均進(jìn)行了 3次試驗(yàn)重復(fù)篩選，最終鎖定了一 株目標(biāo)菌株，其在培養(yǎng)過(guò)程中抑菌活性穩(wěn)定，抑菌活力最強(qiáng)，該菌株抑菌圈達(dá)到27.8mm。 [0031 ] 3、上述方法分離得到的目標(biāo)菌株的主要形態(tài)和生物學(xué)特征為:細(xì)胞呈桿狀，革蘭 氏染色呈陽(yáng)性（詳見(jiàn)附圖1)，有芽抱，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上無(wú)可溶性色素，菌落薄而粘，表面無(wú)光 澤，半透明，生長(zhǎng)最適溫度為33 °C，生長(zhǎng)最適PH為7.2。
[0032] 4、目標(biāo)菌株鑒定:上述目標(biāo)菌株經(jīng)leSrDNA測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié) 果與化en化acillus polymyxa S化ain DSM 36(該菌株目前保藏于德國(guó)微生物保藏中屯、， 保藏號(hào)為DSM 36)同源，屬于同一菌種，故篩出的菌株為多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)。
[0033] 二、多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)對(duì)甘薦鳳梨病病 原菌的括抗活性
[0034] 本試驗(yàn)W甘薦鳳梨病病原菌為指示菌，從培養(yǎng)好的多粘類(lèi)芽抱桿菌供試菌平板上 挖取供試菌塊放到制備好的指示菌平板上(甘薦鳳梨病病原菌），正置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)2天，其對(duì)鳳梨病病原菌的括抗結(jié)果如圖2
[00；3日]S、多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)抑菌活性成分研 究
[0036] 通過(guò)管碟法分別測(cè)定多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的菌懸液、離屯、上清液、無(wú)菌濾液、細(xì)胞破碎液和熱處理上清液共5種溶液的抑菌活性， 每種溶液設(shè)=個(gè)平行試驗(yàn)，所述5種溶液的具體制備方法如下：
[0037] (1)菌懸液制備：挖取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)菌塊接種于液體LB培養(yǎng)基中，33°C22化pm震蕩培養(yǎng)36h，得到菌懸液(有效菌濃度lO6- l〇7cfu/ml);
[0038] (2)離屯、上清液制備：菌懸液1200化pm離屯、lOmin后取上清；
[0039] (3)無(wú)菌濾液制備：取上述步驟2離屯、后的上清液，用0.22um微孔濾膜過(guò)濾得無(wú)菌 濾液；
[0040] (4)細(xì)胞破碎液:取上述步驟2離屯、后的菌體沉淀加入適量無(wú)菌水冰浴，超聲破碎 細(xì)胞得到菌體細(xì)胞破碎液；
[0041] (5)熱處理上清液:取上述步驟2離屯、后的上清液分裝于試管中，100°C水浴化；
[0042] 上述5份供試樣品處理完畢后，準(zhǔn)備含有指示菌(甘薦鳳梨病病原菌)的培養(yǎng)平板， 每個(gè)培養(yǎng)皿中放置3個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中分別加入30ul上述實(shí)驗(yàn)步驟所獲得的菌懸液、 離屯、上清液、無(wú)菌濾液、細(xì)胞破碎液和熱處理上清液，在28°C條件下培養(yǎng)4她，觀察抑菌圈的 有無(wú)及大小。
[0043] 表1多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)不同處理液對(duì)甘 薦鳳梨病病原菌的括抗活性
[0044]
[i
[0046] 上述結(jié)果表明：菌懸液和離屯、上清液的抑菌效果相當(dāng)，而無(wú)菌濾液和菌體細(xì)胞破 碎液無(wú)抑菌活性，從而顯示多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)產(chǎn) 生的抑菌活性物質(zhì)是菌體分泌物，而非菌體胞內(nèi)物質(zhì)，且該抑菌活性物質(zhì)分子量較大或W 分子聚集體的形式存在，不能透過(guò)〇.22um微孔濾膜;經(jīng)熱處理后的離屯、上清液失去抑菌活 性，運(yùn)表明該抑菌活性物質(zhì)不耐高溫，在高溫條件下易失活。
[0047] 四、多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)抑菌成分的提取
[004引 乙醇沉淀法：在多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)離屯、 液中加入無(wú)水乙醇使乙醇的終濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%， 于4°C靜置化，50(K)rpm離屯、lOmin，將沉淀溶于無(wú)菌水中，所得溶液即為多粘類(lèi)芽抱桿菌代 謝產(chǎn)物的（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)蛋白粗提物，用上述實(shí)驗(yàn)S的方法測(cè) 定不同濃度乙醇沉淀蛋白粗提物的抑菌活性。
[0049]表2不同醇濃度提取物質(zhì)的抑菌活性
[(K)加]
[0051]表2結(jié)果顯示乙醇濃度為70%時(shí)提取的蛋白粗提物抑菌活性最大
[0化2] 五、多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)田間防治甘薦鳳 梨病效果實(shí)驗(yàn)
[0化3] 多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)田間防治甘薦鳳梨 病效果實(shí)驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)菌懸 液1000倍稀釋液，有效菌濃度為l〇4c化/ml (制備方法參見(jiàn)本申請(qǐng)實(shí)施例1);Paenibaci 1 lus polymyxa s化ain DSM 36菌懸液醇提取液(其制備方法參見(jiàn)本申請(qǐng)實(shí)施例7);多菌靈可濕 性粉劑(購(gòu)于四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司）1000倍稀釋液;無(wú)菌水空白對(duì)照。將長(zhǎng)度為20cm 薦種于3%石灰水中浸泡化后拱出整齊堆放，薦種的切口置于同一個(gè)平面上，在切口上分別 噴涂上述4種待測(cè)樣品后，將薦種種植在耕地上，每個(gè)處理100株；1個(gè)月甘薦齊苗后調(diào)查萌 芽率，然后從各試驗(yàn)處理區(qū)隨機(jī)挖取40個(gè)雙芽苗，并用刀將每一條薦種莖作縱剖，調(diào)查每條 甘薦種莖鳳梨病發(fā)病情況，并計(jì)算發(fā)病率及防治效果，其結(jié)果見(jiàn)下表：
[0054]表3各處理防治甘薦鳳梨病的效果
[0化5]
[0化6]
[0057]不同處理方式的甘薦萌芽率，鳳梨病發(fā)病率，防效結(jié)果(見(jiàn)表3)顯示：多粘類(lèi)芽抱 桿菌(DSM 36)對(duì)甘薦鳳梨病有較好的防治效果，其防效為91.3%，多菌靈可濕性粉劑1000 倍稀釋液的防效為52.2%，DSM 36的防效顯著高于多菌靈可濕性粉劑1000倍稀釋液的防 效。并且對(duì)薦種的萌芽有明顯的促進(jìn)作用。
[005引本發(fā)明的有益效果為：
[0059] 1、經(jīng)過(guò)對(duì)自然界中存在的微生物的篩選獲得能夠生物防治甘薦鳳梨病的菌種、審U 劑及其制備方法，解決了農(nóng)藥殘留、病原菌耐藥性和環(huán)境污染等問(wèn)題。
[0060] 2、本發(fā)明所述制劑不僅能夠預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病，還能對(duì)薦種的萌芽起到明 顯的促進(jìn)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0061 ] 圖1是本申請(qǐng)分離出的菌株即化en;Lbacillus polymyxa strain DSM 36的革蘭氏 染色圖片；
[0062] 圖2是化en;Lbacillus polymyxa strain DSM 36對(duì)鳳梨病病原菌的括抗活性試驗(yàn) 結(jié)果圖片；
【具體實(shí)施方式】
[0063] 實(shí)施例1
[0064] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[00化]1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌懸液；
[0066] 2)上述菌懸液直接分裝，既得。
[0067] 實(shí)施例2
[0068] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[0069] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)，的菌種接種于 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到菌懸液；
[0070] 2)上述菌懸液經(jīng)過(guò)離屯、處理后取上清液，既得。
[0071] 實(shí)施例3
[0072] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[0073] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 LB液體培養(yǎng)基中30攝氏度，200rpm震蕩培養(yǎng)24小時(shí)，得到有效菌濃度為103c化/ml的菌懸 液；
[0074] 2)取上述菌懸液經(jīng)過(guò)離屯、處理后得到上清液，在上清液中加入乙醇，使得醇濃度 為20%，靜置后離屯、，取其沉淀，將沉淀溶于無(wú)菌水中，即為預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制 劑。
[0075] 所制備的制劑，用
【發(fā)明內(nèi)容】
部分試驗(yàn)=所述方法，進(jìn)行效果試驗(yàn)，其抑菌圈大小為 25.6mm〇
[0076] 實(shí)施例4
[0077] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[0078] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 LB液體培養(yǎng)基中35攝氏度，240rpm震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，得到有效菌濃度為108c化/ml的菌懸 液；
[0079] 2)取上述菌懸液經(jīng)過(guò)離屯、處理后得到上清液，在上清液中加入乙醇，使得醇濃度 為90%，靜置后離屯、，取其沉淀，將沉淀溶于無(wú)菌水中，即為預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制 劑。
[0080] 所制備的制劑，用
【發(fā)明內(nèi)容】
部分試驗(yàn)=所述方法，進(jìn)行效果試驗(yàn)，其抑菌圈大小為 27.4mm〇
[0081 ] 實(shí)施例5
[0082] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[0083] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 LB液體培養(yǎng)基中33攝氏度，220rpm震蕩培養(yǎng)36小時(shí)，得到有效菌濃度為106c化/ml的菌懸 液。
[0084] 2)取1體積份步驟1中得到的菌懸液，10000離屯、8min后，取上清液加入乙醇，使得 醇濃度為60%，低溫靜置1小時(shí)后2000離屯、5,取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液體積份2倍 量的無(wú)菌水中，得到多粘類(lèi)芽抱桿菌代謝產(chǎn)物的提取物，即為預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的 制劑。
[0085] 所制備的制劑，用
【發(fā)明內(nèi)容】
部分試驗(yàn)=所述方法，進(jìn)行抑菌效果試驗(yàn)，其抑菌圈大 小為 26.9mm。
[00化]實(shí)施例6
[0087] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[0088] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 LB液體培養(yǎng)基中33攝氏度，220rpm震蕩培養(yǎng)36小時(shí)，得到有效菌濃度為107c化/ml的菌懸 液。
[0089] 2)取1體積份步驟1中得到的菌懸液，14000巧m離屯、12min后，取上清液加入乙醇， 使得醇濃度為80 %，低溫靜置3小時(shí)后7000巧m離屯、15min，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸 液體積份6倍量的無(wú)菌水中，得到多粘類(lèi)芽抱桿菌代謝產(chǎn)物的提取物，即為預(yù)防或者治療甘 薦鳳梨病的制劑。
[0090] 所制備的制劑，用
【發(fā)明內(nèi)容】
部分試驗(yàn)=所述方法，進(jìn)行效果試驗(yàn)，其抑菌圈大小為 2 T. 3inm 〇
[0091 ] 實(shí)施例7
[0092] -種用于預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑，其制備方法如下：
[0093] 1)取多粘類(lèi)芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa shain DSM 36)的菌種接種于 LB液體培養(yǎng)基中33攝氏度，220rpm震蕩培養(yǎng)36小時(shí)，得到有效菌濃度為106-107c化/ml的菌 懸液。
[0094] 2)取1體積份步驟1中得到的菌懸液，12000巧m離屯、1 Omin后，取上清液加入乙醇， 使得醇濃度為70%，于4攝氏度靜置2小時(shí)后5000rpm離屯、lOmin，取其沉淀，將沉淀溶于所取 菌懸液體積份4倍量的無(wú)菌水中，即為預(yù)防或者治療甘薦鳳梨病的制劑。
[0095] 所制備的制劑，用
【發(fā)明內(nèi)容】
部分試驗(yàn)=所述方法，進(jìn)行效果試驗(yàn)，其抑菌圈大小為
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的制劑，其特征在于，該制劑由有效成分為多粘 類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)經(jīng)培養(yǎng)后的菌懸液或者該菌代謝 產(chǎn)物的提取物制成。2. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述提取及制備方式為:將多粘類(lèi)芽孢桿菌 經(jīng)培養(yǎng)后的菌懸液經(jīng)過(guò)離心取其上清液，既得。3. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述提取及制備方式為： 1) 取多粘類(lèi)芽孢桿菌經(jīng)培養(yǎng)后的菌懸液1體積份，其有效菌濃度為l〇3_l〇8cfu/ml， 10000-14000rpm 離心 8_12min 后，取上清； 2) 在離心上清液中加入乙醇，使得醇濃度為20 %-90 %，靜置后離心，取其沉淀，將沉淀 溶于所取菌懸液2-6倍體積份的無(wú)菌水中，既得。4. 如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，所述提取及制備方式為： 1) 取多粘類(lèi)芽孢桿菌經(jīng)培養(yǎng)后的菌懸液1體積份，其有效菌濃度為l〇6_l〇7cfu/ml， 12000rpm離心10min后取上清； 2) 在離心上清液中加入乙醇，使得醇濃度為70%，于4攝氏度靜置2小時(shí)后5000rpm離心 lOmin，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液4倍體積份的無(wú)菌水中，即得。5. 如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制劑，其特征在于，所述制劑能夠用于預(yù)防或者治療甘 鹿鳳梨病。6. -種用于預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的制劑的制備方法，其特征在于，所述制備方法 如下： 1) 取多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的菌種接種于培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，得到菌懸液； 2) 上述菌懸液經(jīng)過(guò)離心處理后取上清液，既得。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法如下： 1) 取多粘類(lèi)芽抱桿菌(Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的菌種接種于LB液 體培養(yǎng)基中30-35攝氏度，200-240rpm震蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)，得到有效菌濃度為10 3-108cfu/ ml的菌懸液； 2) 取上述菌懸液經(jīng)過(guò)離心處理后得到上清液，在上清液中加入乙醇，使得醇濃度為 20%-90%，靜置后離心，取其沉淀，將沉淀溶于無(wú)菌水中，即為預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的 制劑。8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1為：取多粘類(lèi)芽孢桿菌 (Paenibacillus polymyxa strain DSM 36)的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中33攝氏度， 220rpm震蕩培養(yǎng)36小時(shí)，得到有效菌濃度為106-10 7cfu/ml的菌懸液。9. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2為:取1體積份步驟1中得到的 菌懸液，10000-14000rpm離心8-12min后，取上清液加入乙醇，使得醇濃度為60-80%，低溫 靜置1-3小時(shí)后2000-7000rpm離心5-15min，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液體積份2-6倍 量的無(wú)菌水中，得到多粘類(lèi)芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的提取物，即為預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的 制劑。10. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2為:取1體積份步驟1中得到 的菌懸液，12000rpm離心10min后，取上清液加入乙醇，使得醇濃度為70%，于4攝氏度靜置2 小時(shí)后5000rpm離心10min，取其沉淀，將沉淀溶于所取菌懸液體積份4倍量的無(wú)菌水中，即 為預(yù)防或者治療甘蔗鳳梨病的制劑。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK106047965SQ201610424369
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】李夢(mèng)茜, 張振旺, 覃擁靈, 楊曉英
【申請(qǐng)人】河池學(xué)院