L?纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及用其生產(chǎn)l?纈氨酸的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種工藝簡單、生產(chǎn)成本低、提高L?纈氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的適合用于工業(yè)化生產(chǎn)的L?纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及用其生產(chǎn)L?纈氨酸的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分包括：甘蔗糖蜜、玉米漿、硫酸銨、氨水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、維生素H和維生素B1。本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基以甘蔗糖蜜為碳源，以玉米漿、硫酸銨和氨水為氮源，結(jié)合補(bǔ)料工藝和分段控制溶氧的方式進(jìn)行L?纈氨酸發(fā)酵，得到L?纈氨酸的發(fā)酵單位能達(dá)到93g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率40.35%，明顯提高了L?纈氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。
【專利說明】
L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及用其生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及用其生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1^-結(jié)|氨酸(1^-￥&1;[116)于1901年從酪朊蛋白中發(fā)現(xiàn)，化學(xué)名稱L-α-氨基異戊酸，分子式為C5H11NO2，相對(duì)分子質(zhì)量117.15，呈白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味苦。L-纈氨酸屬于支鏈氨基酸，是人體八種必須氨基酸之一，具有多種生理功能，L-纈氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單元，是動(dòng)物營養(yǎng)必須的氨基酸之一，也是機(jī)體抗體、激素和酶等合成的基本原料，在人體內(nèi)發(fā)揮著特殊的生理功能，作為轉(zhuǎn)化成ATP的重要物質(zhì)以維持生命特征。L-纈氨酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及調(diào)味劑、動(dòng)物飼料和化妝品的制造，尤其是在醫(yī)學(xué)研究和治療中的作用，日益受到重視。2014年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示纈氨酸產(chǎn)量已達(dá)到1000噸以上，其中日本是主要的生產(chǎn)國，國內(nèi)還需要進(jìn)口以滿足國內(nèi)需求。
[0003]目前，L-纈氨酸的生產(chǎn)方法主要有提取法、合成法和發(fā)酵法，其中利用微生物發(fā)酵法，具有原材料成本低，反應(yīng)條件溫和及易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是目前最廣泛采用的生產(chǎn)方法。而以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸，國內(nèi)生產(chǎn)水平和糖酸轉(zhuǎn)化率都比較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)市場(chǎng)的需求。例如專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010527435的專利《一種高效生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵工藝》中提到了一種發(fā)酵工藝，發(fā)酵60h，L-纈氨酸的產(chǎn)量為59g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為27%。又如公開號(hào)為CN1019796226A的中國發(fā)明專利公開了一種提高L-纈氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率和糖酸轉(zhuǎn)化率的方法，其根據(jù)調(diào)整細(xì)胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽的方法，使L-纈氨酸的產(chǎn)量達(dá)到61.2g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.3g/L。在菌株生產(chǎn)L-纈氨酸的過程中，糖酸轉(zhuǎn)化率不是很高，因此轉(zhuǎn)化率的提高，對(duì)于節(jié)約生產(chǎn)成本，意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單、生產(chǎn)成本低、提高L-纈氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的適合用于工業(yè)化生產(chǎn)的L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基及用其生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法。
[0005]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的采用的技術(shù)方案為:L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分包括:甘蔗糖蜜、玉米漿、硫酸銨、氨水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、維生素H和維生素BI。
[0006]進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的濃度為:甘蔗糖蜜10?60g/L、玉米漿20?50g/L、硫酸銨10?20 g/L、磷酸二氫鉀卜5 8/1、硫酸鎂0.5~2 g/L、硫酸亞鐵0.01?0.05 g/L、硫酸錳0.01?0.05 g/L、維生素H 0.0002-0.001 g/L、維生素BI 0.0002-0.001 g/L，用氨水使發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6.7-7.00
[0007]進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分按重量份數(shù)比包括:甘蔗糖蜜30?40g/L、玉米漿25?40 g/L、硫酸銨14?18 g/L、磷酸二氫鉀2?3 8/1、硫酸鎂1~1.5 g/L、硫酸亞鐵0.02?
0.03 g/L、硫酸錳0.02?0.03 g/L、維生素H 0.0005-0.0008 g/L、維生素BI 0.0005-0.0008g/L，用氨水使發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6.7-7.00
[0008]利用L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法，包括如下步驟:
a、按照配比，將各組分稱量好，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基；
b、將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，溫度為115?125°C;
c、接入L-纈氨酸的產(chǎn)生菌-谷氨酸棒狀桿菌種子培養(yǎng)物，控制培養(yǎng)基中溶氧量和殘?zhí)橇浚?br> d、在罐壓0.01-0.05Mpa、轉(zhuǎn)速200rpm、pH6.7-7.0,溫度25?38°C的條件下，發(fā)酵時(shí)間65?75h，即得L-結(jié)I氨酸。
[0009 ]進(jìn)一步地，所述谷氨酸棒狀桿菌種子培養(yǎng)物的接入量為培養(yǎng)基體積的1?18%。
[0010]進(jìn)一步地，所述c步驟中控制培養(yǎng)基中溶氧量的方法為，采用分階段控制溶氧:0_36h的溶氧量為20%，36-70h溶氧量為5%。
[0011]進(jìn)一步地，所述c步驟中控制殘?zhí)橇康姆椒?向培養(yǎng)基中加濃度為80%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛康臐舛葹?0?25g/L。
[0012]進(jìn)一步地，所述d步驟中罐壓為0.02Mpa、溫度為32°C、發(fā)酵時(shí)間為70h。
[0013]本發(fā)明獲得的有益效果為:本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基以甘蔗糖蜜為碳源，以玉米漿、硫酸銨和氨水為氮源，結(jié)合補(bǔ)料工藝和分段控制溶氧的方式進(jìn)行L-纈氨酸發(fā)酵，得到L-纈氨酸的發(fā)酵單位能達(dá)到93g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率40.35%，明顯提高了 L-纈氨酸的產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。
[0014]本發(fā)酵方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要增加額外設(shè)備和人力投入，整個(gè)發(fā)酵過程工藝簡單、生產(chǎn)成本低，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0016]實(shí)施例1:
稱取甘蔗糖蜜20g，玉米漿40g，硫酸銨20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂l.0g，硫酸亞鐵
0.02g，硫酸錳0.02g，維生素H 0.0004g，維生素BI 0.0004g，飲用水定容至2L，加入5L發(fā)酵罐中，115 °C滅菌后，接入種子培養(yǎng)物，接種量為10%，罐壓0.0 IMPa，轉(zhuǎn)速200rpm，pH6.7，溫度25°C。根據(jù)殘?zhí)橇苛骷?0%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛吭?0-25g/L。發(fā)酵過程中通過氨水控制pH6.7-7.0之間。分階段控制溶氧:0-36h為20%，36-70h為5%。發(fā)酵70h放罐，檢測(cè)到L-纈氨酸發(fā)酵單位為77g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率33.6%。
[0017]實(shí)施例2:
稱取甘蔗糖蜜120g，玉米漿10g，硫酸銨40g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂4g，硫酸亞鐵
0.1g,硫酸錳0.1g，維生素H 0.002g，維生素BI 0.002g，飲用水定容至2L，加入5L發(fā)酵罐中，125°C滅菌后，接入種子培養(yǎng)物，接種量為18%，罐壓0.05MPa，轉(zhuǎn)速200rpm，pH7.0，溫度38°C。根據(jù)殘?zhí)橇苛骷?0%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛吭?0-25g/L。發(fā)酵過程中通過氨水控制pH6.7-7.0之間。分階段控制溶氧:0-36h為20%，36-70h為5%。發(fā)酵70h放罐，檢測(cè)到L-纈氨酸發(fā)酵單位為81 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率36.08% ο
[0018]實(shí)施例3:
稱取甘蔗糖蜜56g，玉米漿50g，硫酸銨24g，磷酸二氫鉀6g，硫酸鎂1.6g，硫酸亞鐵0.08g，硫酸錳0.08g，維生素H 0.0014g，維生素BI 0.0014g，飲用水定容至2L，加入5L發(fā)酵罐中，121°C滅菌后，接入種子培養(yǎng)物，接種量為15%，罐壓0.02MPa，轉(zhuǎn)速200rpm，pH6.7，溫度32°C。根據(jù)殘?zhí)橇苛骷?0%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛吭?0-25g/L。發(fā)酵過程中通過氨水控制pH6.7-7.0之間；分階段控制溶氧:0-36h為20%，36-70h為5%;發(fā)酵70h放罐，檢測(cè)到L-纈氨酸發(fā)酵單位為80g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率35.21%。
[0019]實(shí)施例4:
稱取甘蔗糖蜜70g，玉米漿70g，硫酸銨30g，磷酸二氫鉀7g，硫酸鎂2g，硫酸亞鐵0.07g，硫酸錳0.07g，維生素H 0.0008g，維生素BI 0.0008g，飲用水定容至2L，加入5L發(fā)酵罐中，121°C滅菌后，接入種子培養(yǎng)物，接種量為15%，罐壓0.03MPa，轉(zhuǎn)速200rpm，pH6.8，溫度32°C。根據(jù)殘?zhí)橇苛骷?0%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛吭?0-25g/L。發(fā)酵過程中通過氨水控制pH6.7-7.0之間。分階段控制溶氧:0-36h為20%，36-70h為5%。發(fā)酵70h放罐，檢測(cè)到L-纈氨酸發(fā)酵單位為93g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率40.35%。
[0020]實(shí)施例5:
稱取甘蔗糖蜜SOg，玉米漿SOg，硫酸銨32g，磷酸二氫鉀7g，硫酸鎂1.6g，硫酸亞鐵0.08g，硫酸錳0.08g，維生素H 0.0014g，維生素BI 0.0014g，飲用水定容至2L，加入5L發(fā)酵罐中，121°C滅菌后，接入L-纈氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸棒狀桿菌的種子培養(yǎng)物，接種量為15%，罐壓0.02MPa，轉(zhuǎn)速200rpm，pH6.7-7.0，溫度32 °C。根據(jù)殘?zhí)橇苛骷?0%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛吭?0-25g/L。發(fā)酵過程中通過氨水控制pH6.7-7.0之間。分階段控制溶氧:0_36h為20%，36-70h為5%。發(fā)酵70h放罐，檢測(cè)到L-纈氨酸發(fā)酵單位為85g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率37.1%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分包括:甘蔗糖蜜、玉米漿、硫酸銨、氨水、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、維生素H和維生素BI。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分的濃度為:甘蔗糖蜜10?60 g/L、玉米漿20?50 g/L、硫酸銨10?20 g/L、磷酸二氫鉀I?5 g/L、硫酸鎂0.5?2 g/L、硫酸亞鐵0.01?0.05 g/L、硫酸錳0.01?0.05 g/L、維生素H 0.0002-0.001g/L、維生素BI 0.0002-0.001 g/L，用氨水使發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6.7-7.003.根據(jù)權(quán)利要求2所述L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分按重量份數(shù)比包括:甘蔗糖蜜30?40 g/L、玉米漿25?40 g/L、硫酸銨14?18 g/L、磷酸二氫鉀2?3 g/L、硫酸鎂I?1.5 g/L、硫酸亞鐵0.02?0.03 g/L、硫酸錳0.02?0.03 g/L、維生素H.0.0005?0.0008 g/L、維生素BI 0.0005-0.0008 g/L，用氨水使發(fā)酵培養(yǎng)基pH 6.7-7.004.利用權(quán)利要求1或2或3L-纈氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:包括如下步驟: a、按照配比，將各組分稱量好，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基； b、將發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌，溫度為115?125°C ; c、接入L-纈氨酸的產(chǎn)生菌-谷氨酸棒狀桿菌種子培養(yǎng)物，控制培養(yǎng)基中溶氧量和殘?zhí)橇浚? d、在罐壓0.01?0.05Mpa、轉(zhuǎn)速200rpm、pH6.7?7.0、溫度25?38°C的條件下，發(fā)酵時(shí)間65?75h，即得L-結(jié)I氨酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述谷氨酸棒狀桿菌種子培養(yǎng)物的接入量為培養(yǎng)基體積的10?18%。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述c步驟中控制培養(yǎng)基中溶氧量的方法為，采用分階段控制溶氧:0-36h的溶氧量為20%，36-70h溶氧量為5%。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述c步驟中控制殘?zhí)橇康姆椒?向培養(yǎng)基中加濃度為80%的葡萄糖溶液，控制殘?zhí)呛康臐舛葹?0?25g/L。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵方法，其特征在于:所述d步驟中罐壓為.0.02Mpa、溫度為32°C、發(fā)酵時(shí)間為70h。
【文檔編號(hào)】C12R1/15GK106086099SQ201610732888
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月27日
【發(fā)明人】李猛, 王婷, 魏偉, 林青
【申請(qǐng)人】河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司