本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，更具體地，涉及一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、ano3是哺乳動(dòng)物anoctiamin蛋白家族的成員，其是一種ca2+依賴的磷脂促翻轉(zhuǎn)酶。人類anoctiamin家族蛋白具有一系列分子功能，在參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、磷脂翻轉(zhuǎn)和調(diào)節(jié)其他膜蛋白起著重要作用。內(nèi)源性ano3是位于細(xì)胞膜及胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白，能夠發(fā)揮ca2+依賴的磷脂促翻轉(zhuǎn)酶和調(diào)節(jié)離子通道的作用。

2、ano3主要表達(dá)在神經(jīng)組織中，尤其是神經(jīng)元細(xì)胞中。其主要存在于紋狀體、海馬、皮層、背根神經(jīng)節(jié)等。ano3可與離子通道相互作用，參與調(diào)控神經(jīng)元興奮性。ano3蛋白能夠與鈉激活的鉀通道(kcnt1)直接相互作用，參與靜息膜電位的維持，因此ano3蛋白通過提高鈉離子通道的敏感性來抑制興奮性，從而參與調(diào)控神經(jīng)元的興奮性。其次ano3蛋白具有磷脂促翻轉(zhuǎn)酶，它能使磷脂在質(zhì)膜上的不對(duì)稱分布消失，以響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的小幅升高。功能研究已表明ano3具有鈣離子激活的磷脂促翻轉(zhuǎn)酶活性而缺少離子通道活性。ano3基因是熱性驚厥、肌張力障礙等的重要致病基因。如何快速高效地構(gòu)建ano3基因敲除小鼠動(dòng)物模型，以促進(jìn)相關(guān)疾病的研究，是目前亟待解決的問題。

3、因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供了一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型。

2、在本發(fā)明的第一方面提供了一種試劑，包括：

3、(a)基因編輯蛋白或其表達(dá)載體，所述基因編輯蛋白選自下組：casrx、cpf1、cas9、cas13a、cas13b、cas13c、或其組合；和

4、(b)sgrna或其表達(dá)載體，其中所述sgrna是引導(dǎo)所述基因編輯蛋白特異性結(jié)合ano3基因的rna。

5、另一優(yōu)選例中，所述sgrna包括sgrna1和/或sgrna2，所述sgrna1的靶向核酸序列如seq?id?no:1所示，所述sgrna2的靶向核酸序列如seq?idno:2所示。

6、在另一優(yōu)選例中，所述sgrna引導(dǎo)基因編輯蛋白特異性結(jié)合于ano3基因的核苷酸序列。

7、在另一優(yōu)選例中，所述組分(a)和/或(b)中的所述表達(dá)載體包括病毒載體。

8、在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體選自下組：腺相關(guān)病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、sv40、痘病毒、或其組合。

9、在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體選自下組：慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、或其組合，較佳地，所述載體為腺相關(guān)病毒(aav)。

10、在另一優(yōu)選例中，所述試劑的劑型選自下組：凍干制劑、液體制劑、或其組合。

11、在另一優(yōu)選例中，所述試劑的劑型為液體制劑。

12、在另一優(yōu)選例中，所述試劑的劑型為注射劑型。

13、在另一優(yōu)選例中，所述基因編輯蛋白的表達(dá)載體和sgrna的表達(dá)載體為同一載體或不同載體。

14、在另一優(yōu)選例中，所述組分(a)與組分(b)的重量比為100:1-0.01:1，較佳地，10:1-0.1:1，更佳地，2:1-0.5:1。

15、在另一優(yōu)選例中，所述組合物中，所述組分(a)的含量為0.0001-99wt％，較佳地，0.1-90wt％，更佳地，1-70wt％。

16、在另一優(yōu)選例中，所述組合物中，所述組分(b)的含量為0.0001-99wt％，較佳地，0.01-90wt％，更佳地，0.1-70wt％。

17、在另一優(yōu)選例中，所述組合物中，所述組分(a)和組分(b)占所述組合物總重的0.01-99.99wt％，較佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

18、在本發(fā)明的第二方面提供了一種分離的細(xì)胞，所述的細(xì)胞經(jīng)如第一方面所述的試劑處理，且所述細(xì)胞中ano3蛋白失活。

19、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞的基因組中ano3基因轉(zhuǎn)錄本的第1個(gè)外顯子至第13個(gè)外顯子切除。

20、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞包括體細(xì)胞、生殖細(xì)胞和/或胚胎干細(xì)胞。

21、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞選自人、和/或非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。

22、在另一優(yōu)選例中，所述胚胎干細(xì)胞還包括少于14天的胚胎、和/或受精卵。

23、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞選自嚙齒動(dòng)物，如小鼠、和/或大鼠。

24、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞為小鼠的受精卵。

25、在本發(fā)明的第三方面提供了一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物的制備方法，包括以下步驟：

26、(m1)提供一種非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，將所述細(xì)胞中ano3基因轉(zhuǎn)錄本的第1個(gè)外顯子至第13個(gè)外顯子切除，得到ano3蛋白失活的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和

27、(m2)利用步驟(m1)中得到的ano3蛋白失活的細(xì)胞，制備得到ano3蛋白失活的非人哺乳動(dòng)物。

28、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞包括體細(xì)胞、生殖細(xì)胞和/或胚胎干細(xì)胞。

29、在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞包括如第二方面所述的細(xì)胞和/或使用如第一方面所述的試劑處理的細(xì)胞。

30、在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物，如小鼠、和/或大鼠。

31、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：(m3)對(duì)步驟(m2)獲得的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行雜交，通過基因型鑒定，從而獲得ano3蛋白失活的純合子代。

32、在另一優(yōu)選例中，所述鑒定的引物對(duì)包括wt-f和/或wt-r和/或mut-r引物對(duì)，所述wt-f的核苷酸序列如seq?id?no:3所示：gtcaggacagatgccagcttcacc；所述wt-r的核苷酸序列如seq?id?no:4所示：gatgcagagcgggatgtggtgc；所述mut-r的核苷酸序列如seq?idno:5所示：ggggtattgcttaaggacatccacttcc。

33、在本發(fā)明的第四方面提供了一種ano3基因敲除的非人哺乳動(dòng)物模型，其特征在于，所述非人哺乳動(dòng)物模型利用如本發(fā)明第三方面所述的方法制備。

34、在另一優(yōu)選例中，所述非人哺乳動(dòng)物選自下組：嚙齒動(dòng)物(如小鼠、大鼠)。

35、在本發(fā)明的第五方面提供了一種用本發(fā)明第三方面所述的構(gòu)建方法制備的非人哺乳動(dòng)物模型或本發(fā)明第四方面所述的非人哺乳動(dòng)物模型的用途，其特征在于，可用于篩選，以確定用于治療或緩解熱性驚厥、肌張力障礙相關(guān)疾病的潛在治療劑。

36、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

38、本發(fā)明提供了特異性靶向ano3基因的兩條sgrna，利用cas9蛋白將ano3基因的exon?1-exon13敲除，所敲區(qū)域序列為非3倍數(shù)，造成移碼突變，且敲除區(qū)域包含該基因編碼區(qū)的70.59％，從而達(dá)到將該基因敲除的目的。使用crispr/cas9系統(tǒng)構(gòu)建ano3基因敲除小鼠模型方法簡單易行，周期短，拿到陽性小鼠的概率高，利用該小鼠模型可以用于研究多種疾病的致病機(jī)理，并為進(jìn)一步開發(fā)此類疾病的治療方式提供服務(wù)。