本發(fā)明屬于生物可降解塑料合成和廢物資源回收，具體涉及一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝。

背景技術(shù)：

1、pha是一類在碳源充足，氮、磷等其他條件受限條件下，細(xì)胞體內(nèi)合成的能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)，具有與傳統(tǒng)石油基塑料相似的物理性能，具有出色的熱加工性、生物降解性和生物相容性，因此它有望替代傳統(tǒng)的化學(xué)合成塑料，減輕日益嚴(yán)重的“白色污染”問(wèn)題。環(huán)境中存在大量廢棄碳源，對(duì)廢棄碳源的資源化利用成為環(huán)境領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展的方向之一，科學(xué)合理利用廢棄碳源合成pha，成為減碳降碳的重要手段。當(dāng)前，pha的商業(yè)化推廣主要以純菌為主，通過(guò)工程化改造的微生物可實(shí)現(xiàn)pha的快速合成。然而，純菌發(fā)酵具有較高的原料費(fèi)用、滅菌費(fèi)用、基因改造費(fèi)用等成本，使得最終pha產(chǎn)品價(jià)格較高，嚴(yán)重制約了pha的大規(guī)模應(yīng)用。而混合菌群生產(chǎn)pha工藝則以現(xiàn)有的微生物菌群為篩選對(duì)象，完全開(kāi)放體系，無(wú)需滅菌操作，同時(shí)可充分利用污泥發(fā)酵液、餐廚垃圾發(fā)酵液、廢棄動(dòng)植物油等為底物，實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化利用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2、混合菌群系統(tǒng)在富集階段常以低負(fù)荷(1000-4000mg?cod/l)運(yùn)行，篩選出可合成pha的菌種，但低負(fù)荷造成了生物量增長(zhǎng)緩慢的問(wèn)題，若采用高負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)失衡，最終導(dǎo)致富集系統(tǒng)崩潰。較低的生物量成為pha合成段產(chǎn)率較低的重要原因之一，極大地制約了混合菌群和pha的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。同時(shí)，在傳統(tǒng)工藝中將菌群增殖過(guò)程和pha合成過(guò)程分離，使生產(chǎn)流程復(fù)雜化。因此，若能快速提高產(chǎn)pha菌的生物量并同時(shí)實(shí)現(xiàn)pha合成，將大大提高混菌合成pha的產(chǎn)率，并降低生產(chǎn)成本，這對(duì)推動(dòng)混合菌群pha合成實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決混合菌群生物量低制約pha產(chǎn)量，同時(shí)生物量增長(zhǎng)和pha合成段相分離的問(wèn)題，提供一種一步發(fā)酵中同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的方法，從而實(shí)現(xiàn)混合菌群pha合成工藝總體產(chǎn)量的提升。

2、本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，所述方法包括如下步驟：

4、步驟一、建立高密度發(fā)酵系統(tǒng)：如圖1所示，所述高密度發(fā)酵系統(tǒng)包括發(fā)酵罐(可采用玻璃、不銹鋼等材質(zhì))、攪拌裝置、溫控裝置(可采用水浴、電溫控等方式)、曝氣裝置、采樣口、補(bǔ)料口、排氣閥；

5、步驟二、收集產(chǎn)pha混合菌富集反應(yīng)器中菌液，進(jìn)行曝氣，確保其中碳源、氮源被充分消耗，時(shí)間通常為12-36h，得到種泥；

6、步驟三、將種泥和發(fā)酵液置于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵罐體積不限，以1l實(shí)際體積，工作體積0.8l為例，發(fā)酵過(guò)程曝氣量為1.5-3l/min，溶解氧濃度為大于該溫度下水中飽和溶解氧濃度的30％-50％，發(fā)酵罐保持壓力在0-0.025mpa，發(fā)酵過(guò)程溫度控制在25±5℃，攪拌轉(zhuǎn)速為500-800rpm。發(fā)酵罐的壓力通過(guò)調(diào)節(jié)曝氣量調(diào)節(jié)。

7、進(jìn)一步地，步驟二中，富集反應(yīng)器中mlvss為3-5g/l。

8、進(jìn)一步地，步驟二中，產(chǎn)pha菌富集反應(yīng)器及種泥中混合菌群包含的優(yōu)勢(shì)菌為陶厄氏菌屬(thauera)、副球菌屬(paracoccus)、鹽單胞菌(halomonas)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、變形菌屬(amaricoccus)。

9、進(jìn)一步地，步驟二中，所述產(chǎn)pha混合菌富集反應(yīng)器為經(jīng)鹽度馴化(0％-1.8％鹽度)的耐鹽體系或未經(jīng)鹽度馴化的產(chǎn)pha菌富集體系。

10、進(jìn)一步地，步驟三中，所述發(fā)酵液為人工配置的以小分子揮發(fā)酸為主，包括碳源如葡萄糖、甘油、蛋白質(zhì)、乙醇等，或來(lái)自于實(shí)際厭氧發(fā)酵的產(chǎn)酸液，底物濃度為10000±100mgcod/l-30000±100mg?cod/l。

11、進(jìn)一步地，所述小分子揮發(fā)酸為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸中的一種或多種。

12、進(jìn)一步地，所述發(fā)酵液鹽度為0％-2.8％，初始ph為6.0-8.0；發(fā)酵液中補(bǔ)充氯化銨和磷酸二氫鉀為氮源和磷源，使底物中c/n/p＝100：5～10：1～1.5，一定量的礦物鹽溶液用于提供微量元素。

13、進(jìn)一步地，步驟三中，所述種泥接種量為發(fā)酵液總體積的10±1％～20±1％。

14、進(jìn)一步地，步驟三中，發(fā)酵時(shí)間為18～20小時(shí)，此時(shí)微生物中所含pha含量達(dá)到最大。

15、進(jìn)一步地，所述工藝還包括步驟四，高密度發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)離心、過(guò)濾等除去細(xì)菌的剩余發(fā)酵液用作前端產(chǎn)pha菌富集反應(yīng)器的底物。

16、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

17、1、本發(fā)明提出的混菌高密度發(fā)酵工藝可在一步發(fā)酵中在產(chǎn)pha菌生物量快速增長(zhǎng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)pha的合成；

18、2、本發(fā)明提出的混菌高密度發(fā)酵工藝將產(chǎn)pha菌擴(kuò)大培養(yǎng)段與pha合成段相結(jié)合，嵌入傳統(tǒng)三段式工藝后可顯著提高整個(gè)工藝流程pha產(chǎn)量，在接種相同體積(或質(zhì)量)種泥條件下，其pha產(chǎn)率(g?pha/g種泥)約為原工藝的8-9倍；

19、3、從工藝整體來(lái)看，本發(fā)明提出的高密度發(fā)酵工藝可利用高cod碳源(10000±100mg?cod/l-30000±100mg?cod/l)為底物，可使菌群在高有機(jī)負(fù)荷下穩(wěn)定運(yùn)行，并實(shí)現(xiàn)生物量增長(zhǎng)和pha合成同步進(jìn)行，與原工藝較低有機(jī)負(fù)荷(富集段為1000-4000mg?cod/l，pha合成段為3000-6000mg?cod/l)相比，高密度發(fā)酵工藝將大幅度提高菌體生長(zhǎng)密度并大大降低稀釋底物所帶來(lái)的成本；

20、4、本發(fā)明中所用到的底物碳源可以是缺氮或無(wú)氮的高濃度有機(jī)廢棄碳源，諸如糖蜜廢水酸化液、剩余污泥厭氧發(fā)酵酸化液以及餐廚垃圾厭氧發(fā)酵酸化液等，在利用廢棄碳源實(shí)現(xiàn)資源回收的同時(shí)，也能夠通過(guò)削減生化需氧量帶來(lái)一定的環(huán)境效益。

技術(shù)特征：

1.一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：步驟二中，富集反應(yīng)器中mlvss為3-5g/l。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：步驟二中，產(chǎn)pha菌富集反應(yīng)器及種泥中混合菌群包含的優(yōu)勢(shì)菌為陶厄氏菌屬、副球菌屬、鹽單胞菌、棒狀桿菌屬、變形菌屬。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：步驟二中，所述產(chǎn)pha混合菌富集反應(yīng)器為經(jīng)鹽度馴化(0％-1.8％鹽度)的耐鹽體系或未經(jīng)鹽度馴化的產(chǎn)pha菌富集體系。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：步驟三中，所述發(fā)酵液為以小分子揮發(fā)酸為主，包括碳源如葡萄糖、甘油、蛋白質(zhì)、乙醇等，或來(lái)自于實(shí)際厭氧發(fā)酵的產(chǎn)酸液，底物濃度為10000±100mgcod/l-30000±100mg?cod/l。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：所述小分子揮發(fā)酸為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸中的一種或多種。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：所述發(fā)酵液鹽度為0％-2.8％，初始ph為6.0-8.0；發(fā)酵液中補(bǔ)充氯化銨和磷酸二氫鉀為氮源和磷源，使底物中c/n/p＝100：5～10：1～1.5，一定量的礦物鹽溶液用于提供微量元素。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：步驟三中，所述種泥接種量為發(fā)酵液總體積的10±1％～20±1％。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：步驟三中，發(fā)酵時(shí)間為18～20小時(shí)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)所述的一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量pha合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，其特征在于：所述工藝還包括步驟四，高密度發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)離心、過(guò)濾等除去細(xì)菌的剩余發(fā)酵液用作前端產(chǎn)pha菌富集反應(yīng)器的底物。

技術(shù)總結(jié)
一種同步實(shí)現(xiàn)生物量快速增長(zhǎng)和高含量PHA合成的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，所述工藝以產(chǎn)PHA菌富集段SBR反應(yīng)器排出的菌泥為接種底泥，以高COD廢水為底物，實(shí)現(xiàn)了一次發(fā)酵中生物量快速增長(zhǎng)和高含量PHA合成同步進(jìn)行。本發(fā)明提出的混合菌群高密度發(fā)酵工藝，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)PHA混合菌群的快速增殖并保持其高的PHA合成能力，實(shí)現(xiàn)PHA產(chǎn)量的大幅提升。該工藝可在高有機(jī)負(fù)荷下穩(wěn)定運(yùn)行，能利用高濃度有機(jī)廢水，降低了廢水稀釋的成本，有效降低混合菌群生產(chǎn)PHA的成本。本發(fā)明提出的混菌高密度發(fā)酵工藝PHA體積生產(chǎn)率達(dá)4.968±0.048g/L·d，嵌入傳統(tǒng)三段式PHA合成工藝后可顯著提高工藝整體的PHA產(chǎn)率，最終可達(dá)5.39g?PHA/g種泥，是傳統(tǒng)批次工藝產(chǎn)率的8?9倍。

技術(shù)研發(fā)人員：溫沁雪,黃浩龍,王子凡,陳志強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/26