本發(fā)明屬于微小核酸類標志物檢測，具體涉及一種檢測腫瘤微小核酸標志物的熒光-sers雙模傳感器及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤標志物是指腫瘤細胞發(fā)生、增值、轉(zhuǎn)移或復發(fā)過程中異常變化的一類物質(zhì)，可以反映腫瘤的存在和生長情況。微小核酸類標志物(mirna)是常用的一類腫瘤標志物，mirna在正常細胞和腫瘤細胞中存在著廣泛的表達差異，其表達水平的分析檢測在腫瘤的早期診斷中有著突出的研究價值。因此，準確、快速、靈敏的定量或定性檢測核酸標志物對于腫瘤早期的診斷、治療和發(fā)病機制有著非常重要的意義。

2、在檢測mirna等生物標志物時，熒光和表面增強拉曼散射(surface-enhancedraman?scattering，簡稱sers)等的光學檢測技術(shù)由于具有較高的靈敏度和檢測效率受到廣泛關(guān)注。熒光技術(shù)具有高分辨率、高選擇性以及無創(chuàng)傷等優(yōu)點，熒光檢測工作原理是光譜儀產(chǎn)生一種有特定頻率的輻射，稱為“激發(fā)源”，這種輻射能量傳遞到被檢測的物質(zhì)，物質(zhì)中的熒光分子在受到足夠的能量吸收之后，發(fā)出熒光信號，光譜儀可以檢測整個熒光信號的頻率和強度，用來檢測復雜混合物中的微量成分。sers技術(shù)因出色的靈敏度、固有的化學指紋信息等優(yōu)點，是一種極具潛力的分子檢測技術(shù)。sers技術(shù)是利用金屬結(jié)構(gòu)表面的增強效應，分子吸附在金屬膠體納米顆粒或粗糙的金屬表面上時會經(jīng)歷更高的散射效率，因此待測分子的拉曼信號會放大百萬倍甚至更高，從而實現(xiàn)高靈敏度檢測的光學檢測技術(shù)。目前已有廣泛的研究證實了sers技術(shù)在mirna檢測中的可行性。

3、但是，當前sers技術(shù)在mirna檢測中通常采用單一檢測模式，單一檢測模式容易受到復雜的實驗條件的干擾，產(chǎn)生假陽性或假陰性信號的機會增加，且靈敏度也會受到影響。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測腫瘤微小核酸標志物的熒光-sers雙模傳感器及其制備方法和應用，以解決現(xiàn)有的單一檢測模式的檢測靈敏度低以及易出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

3、本發(fā)明公開的一種檢測腫瘤微小核酸標志物的熒光-sers雙模傳感器，所述熒光-sers雙模傳感器包括sers檢測芯片和熒光-sers雙功能標簽；

4、所述sers檢測芯片為表面特異性抗體修飾的金納米顆粒組裝結(jié)構(gòu)sers基底；

5、所述熒光-sers雙功能標簽為表面修飾有能識別目標核酸的dna單鏈h1、與dna單鏈h1互補并標記有熒光探針分子cy5的dna單鏈h2、拉曼探針分子的金納米顆粒。

6、優(yōu)選地，所述特異性抗體修飾采用抗dna-rna雜交單克隆抗體s9.6修飾，能高特異性地識別dna-rna雜合雙鏈結(jié)構(gòu)，不識別單鏈或dna雙鏈。

7、優(yōu)選地，所述sers基底為界面自組裝方法制備的有序致密排列的金納米顆粒單層膜結(jié)構(gòu)；

8、優(yōu)選地，所述dna單鏈h1和dna單鏈h2的序列根據(jù)目標核酸的序列變化而進行合成設計；

9、進一步優(yōu)選地，所述單鏈h1的堿基序列如seq?id?no：1所示，具體為：

10、5’-tcaacatcagtctgataagctattttttttt-(ch2)6-sh-3’；

11、進一步優(yōu)選地，所述dna單鏈h2的堿基序列如seq?id?no：2所示，具體為：5’-cy5-tag?ctt?atc?aga-3’；

12、進一步優(yōu)選地，所述目標mirna-21(t)的核酸堿基序列如seq?id?no：3所示，具體為：5’-uag?cuu?auc?aga?cug?aug?uuga-3’。

13、優(yōu)選地，所述拉曼探針分子為在拉曼靜默區(qū)(1800～2800cm-1)處存在特征峰的拉曼分子。

14、進一步優(yōu)選地，所述拉曼探針分子包括但不限于4-巰基苯甲腈、普魯士藍、聚二乙炔等。

15、本發(fā)明還公開了上述的檢測腫瘤微小核酸標志物的熒光-sers雙模傳感器的制備方法，包括以下步驟：

16、步驟一：sers檢測芯片的制備：

17、1)通過種子介導的生長方法合成十六烷基三甲基溴化銨(ctab)修飾的金納米顆粒；

18、2)然后在快速攪拌的條件下加入聚乙烯吡咯烷酮(pvp)乙醇溶液混合共培養(yǎng)，乙醇洗一次后濃縮10倍將沉淀分散到乙醇中，從而將金納米顆粒的配體ctab替換為pvp；

19、3)隨后將pvp修飾的金納米顆粒在二氯甲烷和水混合溶液中劇烈攪拌，轉(zhuǎn)移到疏水的聚四氟乙烯樣品槽后添加正己烷，待正己烷揮發(fā)后，用硅片撈出組裝在界面上的有序致密排列的金納米顆粒單層膜；

20、4)在金納米單層膜表面修飾巰基乙酸并用enc/nhs活化其上的羧基，接著在37℃下高濕度孵育s9.6抗體，最后浸泡乙醇胺以阻斷非特異性結(jié)合，得到sers檢測芯片。

21、步驟二：熒光-sers雙功能標簽的制備

22、1)采用檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒；

23、2)將dna單鏈h1與dna單鏈h2退火處理形成h1-h2雙鏈，隨后將h1-h2雙鏈與tcep溶液混合以還原巰基被空氣氧化形成的二硫鍵，之后將h1-h2雙鏈與金納米顆粒混合并共培養(yǎng)，h1-h2雙鏈通過巰基與金形成au-s鍵修飾在金納米顆粒表面；

24、3)加入拉曼探針分子共培養(yǎng)，最后得到熒光-sers雙功能標簽。

25、步驟三：使用時，在腫瘤微小核酸標志物存在的情況下，先加入熒光-sers雙功能標簽共同培養(yǎng)，然后加入sers檢測芯片，反應后分別進行熒光和sers檢測，發(fā)揮熒光-sers雙模傳感器作用。

26、其中，在腫瘤微小核酸標志物存在的情況下，熒光-sers雙功能標簽上的dna單鏈h2被該核酸標志物t通過粘性末端介導的鏈置換反應取代，使得dna單鏈h1與t形成h1-t雙鏈；將上述溶液加入sers檢測芯片后，s9.6抗體高特異性地識別h1-t雙鏈結(jié)構(gòu)，因此將帶有拉曼探針分子信號的sers標簽結(jié)合到sers基底上，形成三明治結(jié)構(gòu)，使得拉曼探針分子的sers信號增強，sers檢測可以通過檢測拉曼探針分子的sers強度值來實現(xiàn)；將上述溶液離心，其上清液含有被取代下來的dna單鏈h2，cy5靠近金納米顆粒被猝滅的熒光信號由于脫離金納米顆粒而得以恢復，熒光檢測可以通過檢測cy5的熒光信號來實現(xiàn)。

27、本發(fā)明還公開了上述檢測腫瘤微小核酸標志物的熒光-sers雙模傳感器用于檢測mirna-21的應用。

28、優(yōu)選地，使用時：將熒光-sers雙功能標簽與含有不同濃度的目標mirna-21的樣品溶液共培養(yǎng)；得到的混合樣品離心濃縮后，將其加入sers檢測芯片，清洗后進行sers檢測，得到不同濃度目標mirna-21共培養(yǎng)后芯片的sers光譜及相應拉曼探針分子特征峰的sers強度值，以目標mirna-21濃度的對數(shù)為橫坐標，拉曼探針分子特征峰的sers強度值為縱坐標，做出sers傳感的工作曲線，根據(jù)工作曲線計算傳感器的sers傳感檢出限。

29、取混合樣品離心后的上清液進行熒光檢測，得到不同濃度目標mirna-21的熒光光譜，以目標mirna-21濃度的對數(shù)為橫坐標，cy5的熒光強度為縱坐標，做出熒光傳感的工作曲線，根據(jù)工作曲線計算傳感器的熒光傳感檢出限。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

31、本發(fā)明公開的檢測腫瘤微小核酸標志物的熒光-sers雙模傳感器，結(jié)合自組裝結(jié)構(gòu)的sers檢測芯片和熒光-sers雙功能標簽，形成熒光-sers雙模式檢測，結(jié)合了兩個信號的優(yōu)點，可以相互檢測形成協(xié)同驗證的檢測策略，因而能夠提高傳感器的靈敏度和可靠性。具體優(yōu)勢體現(xiàn)在：

32、1、靈敏度高，本發(fā)明采用具有高靈敏度的sers方法，通過制備自組裝貴金屬納米間隙單層膜結(jié)構(gòu)，獲得均勻分布的“熱點”區(qū)域，同時提高檢測的靈敏度和均勻性；

33、2、特異性強，本發(fā)明是基于核酸分子之間堿基互補配對原則而構(gòu)建的生物傳感器，待測液中的干擾物質(zhì)并不能與dna單鏈h1結(jié)合，dna單鏈h1與dna單鏈h2的雙鏈結(jié)構(gòu)不能被打開，因此干擾物質(zhì)無法和信號單元中的dna單鏈h1雜交，也就不能產(chǎn)生sers信號，dna單鏈h2沒有游離出來，也就不能產(chǎn)生熒光信號；

34、3、抗干擾性強，所選拉曼探針分子在1800～2800cm-1處存在特征信號峰，是生物分子拉曼靜默區(qū)，也可避免與其他拉曼分子或熒光分子的信號產(chǎn)生干擾；

35、4、準確性高，本發(fā)明通過將sers方法與熒光光譜技術(shù)結(jié)合，形成協(xié)同驗證的雙模態(tài)檢測策略，提升檢測的準確性，因此能夠有效解決現(xiàn)有的單一檢測模式的檢測靈敏度低以及易出現(xiàn)假陽性或假陰性的問題；

36、5、具有普適性，只需針對目標mirna的序列，變更相應的h1、h2序列，即可實現(xiàn)對不同種mirna的檢測。