本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在次生代謝產(chǎn)物合成過程中具有聚酮合酶功能的新型基因。

背景技術(shù)：

次生代謝產(chǎn)物是由次生代謝產(chǎn)生，以初級代謝產(chǎn)物為前體的一類細胞生命活動生長發(fā)育正常運行非必需的小分子有機化合物。微生物次生代謝產(chǎn)物因其結(jié)構(gòu)與活性的多樣性在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛的用途。

聚酮類化合物(Polyketides)是一類具有多種結(jié)構(gòu)以及不同生物活性的次級代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的藥理學(xué)特性，包括抗菌，抑制真菌，抗寄生蟲，抗氧化和抗癌等。該類化合物由聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)通過縮合一系列?；鵆oA后環(huán)化修飾而成。聚酮合酶(PKS)廣泛存在于植物、真菌和細菌之中，是一類與次級代謝有著密切關(guān)系的酶類，催化合成結(jié)構(gòu)多樣的天然代謝產(chǎn)物。

耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)是一類具有超強電離輻射抗性，UV輻射抗性以及抗氧化，抗干燥等非生物脅迫抗性的微生物。1999年完成了耐輻射異常球菌的全基因組測序與基因注釋，其基因組全長約3.28Mbp，包含兩條染色體，長度分別為2,648,638bp和412,348bp，以及一個長度為177,466bp的大質(zhì)粒和長度為45,704bp的小質(zhì)粒。整個基因組的G+C％含量約為66.6％，共包含3,187個開放閱讀框架(ORF)，其中次生代謝產(chǎn)物合成基因占整個基因組的3％。Dr_A0326預(yù)測為III型聚酮合酶基因，具有典型的αβαβα折疊結(jié)構(gòu)，與擬南芥III型聚酮合酶查爾酮合成酶(Arabidopsis thaliana TT4CHS)的一致性僅為為33.06％。

細菌III型聚酮合酶的深入研究將有助于進行基因工程、代謝工程的遺傳操作以及新型化合物的合成與應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是從耐輻射異常球菌Deinococcus radiodurans中發(fā)現(xiàn)一種用于聚酮類化合物合成的聚酮合酶基因。

本發(fā)明通過如下研究，首次發(fā)現(xiàn)耐輻射異常球菌DrA0326基因(GeneID：1798062；ProteinID：NP_285650.1)可用于微生物化合物生物合成。具體研究工作如下：

1、獲得含有Dr_A0326基因的重組工程菌株

1)通過PCR從耐輻射異常球菌基因組擴增出DrA0326基因，基因序列號為：GeneID：1798062。其大小為1317bp，該基因編碼438個氨基酸，將其克隆于載體pJET上，構(gòu)建了含有完整DrA0326基因的重組質(zhì)粒pJET-A0326；

2)將DrA0326基因連接于pT7-FLAG^TM-3穿梭質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含有能在大腸桿菌中都起作用的T7啟動子，構(gòu)建含有T7啟動子的完整Dr2091基因重組質(zhì)粒pT7-FLAG-A0326；

3)將導(dǎo)入DrA0326基因的重組質(zhì)粒pT7-FLAG-A0326轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌JM109中，獲得工程菌株JM-A0326(詳見實施例1)；

2、含有DrA0326基因重組工程菌株的化合物合成檢測實驗

實驗證實，DrA0326基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達，含有耐輻射異常球菌DrA0326基因的JM-A0326重組菌株能夠合成三酮吡喃酮。

此實驗表明：耐輻射異常球菌DrA0326基因具有在微生物中催化小分子化合物發(fā)生脫羧縮合反應(yīng)合成三酮吡喃酮的聚酮合酶功能。

序列表信息

SEQ ID NO.1：DrA0326基因的DNA序列。

SEQ ID NO.2：DrA0326的氨基酸序列。

附圖說明

圖1工程菌株JM-A0326與對照菌株JM-F3的產(chǎn)物化合物的HPLC分析。

圖2底物化合物和DrA0326編碼的酶催化反應(yīng)產(chǎn)物—1號化合物質(zhì)譜解析圖；

具體實施方式

以下實施例中所舉的質(zhì)粒、菌株以及微生物催化羥基化的對象只用于對本發(fā)明作進一步詳細說明，并不對本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容加以限制。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所舉的質(zhì)粒、菌株來源如下：

克隆載體pJET：為ThermoFisher公司市售產(chǎn)品；

表達質(zhì)粒pT7-FLAG^TM-3：為Sigma-Aldrich公司市售產(chǎn)品；

大腸桿菌JM 109：為北京全式金公司市售產(chǎn)品。

實施例1耐輻射異常球菌DrA0326基因序列在大腸桿菌中的表達

一、實驗方法

1.根據(jù)已公布的耐輻射異常球菌基因組中的DrA0326基因序列設(shè)計1對PCR特異性引物：

A0326-F：5′CTTGCGGCCGCGATGGCCACCGGTAGGACC 3′

A0326-R：5′ATCTAGATCTGCCTATTCACTCGCCCCCAC 3′

2.通過PCR方法從耐輻射異常球菌基因組DNA中擴增出目的基因序列。

反應(yīng)條件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]35個循環(huán)，72℃10min。

3. PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆于載體pJET上，命名為pJET-A0326，并測序驗證；然后通過NotI/BglII雙酶切獲得含有粘性末端的DrA0326基因及含有T7啟動子的pT7-FLAG^TM-3載體，將DrA0326基因連接于pT7-FLAG^TM-3載體上，構(gòu)建大腸桿菌表達載體pT7-FLAG-A0326。

4.將該表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR、酶切，測序驗證插入序列正確，將該菌株命名為JM-A0326。含有pT7-FLAG^TM-3對照空質(zhì)粒的E.coli JM109命名為JM-F3。

二、實驗結(jié)果

成功構(gòu)建了表達DrA0326的重組大腸桿菌工程菌株。

實施例2含耐輻射異常球菌菌株DrA0326基因重組工程菌株的催化活性實驗

一、實驗材料

重組工程菌株：實施例1得到的含有DrA0326基因的JM-A0326菌株

對照菌株：實施例1所述含空質(zhì)粒的JM-F3菌株。

二、實驗方法

1.將對照菌株和重組工程菌株在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線活化；

2.挑取單菌落接種于添加有相應(yīng)抗生素的100mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6。

3.向培養(yǎng)基中加入終濃度0.5mM的蛋白表達誘導(dǎo)物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和終濃度0.1mM的延伸底物丙二酰輔酶A，20℃繼續(xù)培養(yǎng)20小時。

4.用6N HCl調(diào)節(jié)菌液的pH至5.0，加入100mL乙酸乙酯，旋轉(zhuǎn)混勻提取約10min，室溫下離心10分鐘，收集上層液體。

5.向管中加入3mL無菌水，洗滌菌體。轉(zhuǎn)移菌體至15mL離心管中。4℃，離心10min；棄去上清。

6.將上層液體轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，真空低溫(30℃)蒸餾，除去乙酸乙酯。加1mL甲醇重新溶解提取物。離心10min，取20μL上樣HPLC分析或-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

7.HPLC分析條件。條件為：流動相：H₂O/乙腈；0min，H₂O:乙腈＝100:0；30min，H₂O:乙腈＝0:100；45min，H₂O:乙腈＝0:100。流速0.8mL/min，分析波長主要有300nm，280nm，254nm

8.對HPLC分析所得的1號主峰化合物(即1號產(chǎn)物)進行液相色譜-質(zhì)譜分析(LC-MS)和核磁共振(1H-NMR和13C-NMR)分析。

三、產(chǎn)物分析

HPLC分析結(jié)果如圖1顯示，表達耐輻射異常球菌菌株DrA0326基因重組工程菌株JM-A0326與含有空質(zhì)粒的對照菌株JM-F3的產(chǎn)物峰型顯著不同。圖1中重組工程菌株JM-A0326在保留時間30分鐘處，出現(xiàn)一系列產(chǎn)物峰。

HPLC分析所得1號產(chǎn)物的液相色譜-質(zhì)譜分析(LC-MS)結(jié)果如圖2顯示，該化合物分子量為336。

利用核磁共振方法(1H-NMR和13C-NMR)對1號產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了解析，確認(rèn)該產(chǎn)物是4-羥基-6-(十五烷-2’-羥基-8’-烯基)-2-吡喃酮，是一種聚酮類化合物(表1，圖2)。

表1產(chǎn)物1的核磁共振數(shù)據(jù)

說明：在上述實驗中：

1、IPTG是誘導(dǎo)重組菌株表達DrA0326蛋白的誘導(dǎo)物，并非催化反應(yīng)的底物；

2、反應(yīng)的起始底物源自菌株內(nèi)，是細胞內(nèi)代謝物。從產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)推測出，該起始底物應(yīng)該是一種長鏈脂肪酰輔酶A。

2、丙二酰輔酶A是另一種反應(yīng)底物，即延伸底物

DrA0326編碼的酶催化的反應(yīng)方程式如下：

上述實驗表明，DrA0326能夠以細胞內(nèi)代謝物的長鏈脂肪酰輔酶A為起始底物，以丙二酰輔酶A為延伸底物合成聚酮類化合物。

四、實驗結(jié)論

耐輻射異常球菌DrA0326基因編碼的DrA0326的蛋白能夠作為聚酮合酶，催化微生物中小分子化合物發(fā)生脫羧縮合反應(yīng)，合成吡喃酮類化合物。已有證明，該蛋白為細菌III型聚酮合酶，在醫(yī)藥、工業(yè)和農(nóng)業(yè)的化合物生物合成上具有重要的應(yīng)用潛力。