一種替度魯肽的純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥工藝領(lǐng)域，公開了一種替度魯肽的純化方法。該方法將替度魯肽粗品用乙腈醋酸混合水溶液溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為10%-30%，再用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫，分離出純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份再次進(jìn)行洗脫，混合在95%以上的替度魯肽流份調(diào)整乙腈體積百分比低于15%、pH值為6-7后析晶，離心后所得固體為純品。本發(fā)明用醋酸乙腈混合溶解體系對(duì)替度魯肽粗品前處理，而后以適宜的流動(dòng)相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，最后通過鹽析和脫鹽純化出品質(zhì)較高的替度魯肽純品，與現(xiàn)有RP-HPLC純化方法相比，提高了純化效率和收率。
【專利說明】一種替度魯肽的純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥工藝領(lǐng)域，具體的說是涉及一種替度魯肽的純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]替度魯肽，英文名為Teduglutide，一種胰高血糖素樣肽2 (GLP-2)類似物，一種天然生成的激素，可減少胃排空和分泌，并調(diào)節(jié)小腸內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和修復(fù)。該藥增加了這些細(xì)胞的數(shù)量，后者可增加小腸吸收、減少腹瀉。歐洲商品名為Revestive，在美國商品名為Gattex。在臨床上用于治療成人短腸綜合征，該藥成為首個(gè)被推薦應(yīng)用于這種罕見卻使患者極其虛弱疾病的藥物。
[0003]有關(guān)替度魯肽的現(xiàn)有技術(shù)多為其合成方法，而專門針對(duì)替度魯肽純化方面的報(bào)道極少，基本上都是作為合成中的一步簡(jiǎn)單提及，且多為采用液相色譜法進(jìn)行純化。如申請(qǐng)?zhí)枮?00910126363的中國專利公開了 “胰高血糖素樣肽_2類似物及其制備方法和用途”，其中在制備的最后涉及到替度魯肽的純化步驟，其是采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，最終收率為20%，純度為98.5%。從該專利記載的內(nèi)容能夠看出，其純化方法得到的替度魯肽收率很低，并且在臨床上替度魯肽是以其醋酸鹽形式使用的，現(xiàn)有專利如果轉(zhuǎn)醋酸鹽，其收率勢(shì)必會(huì)因?yàn)閾p耗而進(jìn)一步降低。此外，該專利采用的純化方法只適用于純度較高的替度魯肽粗品，一旦純度降低如只有20%-40%，如果將較低純度的粗品純化到較高的純度就需要進(jìn)行多次的RP-HPLC純化，然而RP-HPLC純化成本是較為昂貴的，這會(huì)造成投入和收益失衡，純化效率低下。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種替度魯肽的純化方法，使得該純化方法能夠提高替度魯肽的收率和純化效率。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]一種替度魯肽的純化方法，包括以下步驟:
[0007]步驟1、將替度魯肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為10%_30%，得到替度魯肽粗品溶液；
[0008]步驟2、將替度魯肽粗品溶液用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫20_40min，從替度魯肽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽主峰結(jié)束分10-20次收集替度魯肽流份，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份進(jìn)行下步純化；
[0009]其中，所述梯度洗脫以pH值為5.5-6.5的硫酸-高氯酸混合水溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，乙腈梯度以體積百分比計(jì)從25%升至45% ；
[0010]步驟3、將步驟2收集的替度魯肽純度在90%_95%的流份再次按照步驟2的方法進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用；
[0011]步驟4、混合步驟2和步驟3分離的替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份，調(diào)整替度魯肽流份中乙腈體積百分比低于15%、pH值為6-7后靜置析晶，離心后所得固體即為替度魯妝純品。
[0012]針對(duì)現(xiàn)有替度魯肽純化方法純化效率、收率和純度都不高的缺陷，本發(fā)明采用適宜的RP-HPLC方法以及通過調(diào)節(jié)乙腈濃度和pH的方法析晶，提高了替度魯肽的純度和收率，而且針對(duì)純度較低的替度魯肽粗品的純化能夠一次純化到位，提高了純化效率。
[0013]作為優(yōu)選，步驟I所述乙腈-醋酸混合水溶液由體積百分比為30%_60%的醋酸、5%-20%乙腈和余量水組成，更優(yōu)選地，所述乙腈-醋酸混合水溶液由體積百分比為40%的醋酸、15%乙腈和余量水組成。
[0014]申請(qǐng)?zhí)枮?00910126363的專利采用水作為溶劑，其溶解體積很大，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的反相純化過程體積過載，無法進(jìn)行有效分離。而本發(fā)明選擇體積比30%-60%的醋酸和5%-20%的乙腈水溶液混合溶劑系統(tǒng)是和本發(fā)明整套純化方法向配套的，能夠保證替度魯肽的溶解體積不會(huì)過載，提高純化效率，不在該濃度的溶劑溶解的濃度會(huì)變低，導(dǎo)致樣品溶解體積過大，不利于反相色譜的處理(會(huì)導(dǎo)致體積過載，純化效率低)。
[0015]作為優(yōu)選，步驟I所述替度魯肽粗品和乙腈-醋酸混合水溶液的質(zhì)量體積比為20g-50g: 1L。將制備的粗肽的濃度控制在20g/L-50g/L有利于本發(fā)明所述方法的純化效率，高于50g/L會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化時(shí)不掛色譜柱，低于20g/L會(huì)使純化效率低下。
[0016]在本發(fā)明步驟I中，用水將醋酸與乙腈的體積之和的體積比例稀釋到10%_30%，當(dāng)醋酸和乙腈的比例高于30%此范圍的溶劑會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化時(shí)不掛色譜柱，當(dāng)醋酸和乙腈的比例低于10%會(huì)使樣品析出，導(dǎo)致后續(xù)的反相色譜純化無法進(jìn)行。
[0017]作為優(yōu)選，步驟2所述硫酸-高氯酸混合水溶液由體積百分比為0.1%-0.4%的硫酸、0.1%-0.4%高氯酸和余量水組成，更優(yōu)選為由體積百分比為0.3%的硫酸、0.2%高氯酸和余量水組成。優(yōu)選地，步驟2所述pH值用氨水調(diào)節(jié)，流動(dòng)相A的pH值為6.0，所述梯度洗脫采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。
[0018]本發(fā)明步驟2選擇0.1%-0.4%的硫酸和0.1%-0.4%高氯酸兩種酸用氨水調(diào)節(jié)后生成兩種緩沖鹽的A相是優(yōu)化選擇的結(jié)果，較現(xiàn)有技術(shù)(200910126363專利)采用0.1%TFA具有更好的分離效果。流動(dòng)相A中緩沖鹽的濃度低于所限定的范圍使流動(dòng)相緩沖能力變?nèi)酰瑢?dǎo)致樣品不能完全洗脫且譜圖變形達(dá)不到分離的要求。大于此范圍，流動(dòng)相A中緩沖鹽的濃度過高對(duì)色譜系統(tǒng)損傷較大，甚至?xí)糠之a(chǎn)生鹽析，導(dǎo)致無法純化。另外，流動(dòng)相A的pH值也非常重要，不在5.5-6.5范圍達(dá)不到分離效果。洗脫系統(tǒng)中A相和B相的比例是影響本發(fā)明所述方法純化效果的因素之一，B%低于25%樣品不能沖洗下色譜柱，B%大于45%樣品會(huì)提前沖出，都不能進(jìn)行純化。采用該溶劑系統(tǒng)純化，分離效果較現(xiàn)有技術(shù)會(huì)大幅提高，本步的收率90%左右，所得樣品的純度在98%以上，大大提高收率和純度，降低了生產(chǎn)成本。
[0019]作為優(yōu)選,步驟4所述pH值用氨水調(diào)節(jié),更優(yōu)選為用體積百分比為20%的稀氨水調(diào)節(jié)，所述靜置析晶優(yōu)選為放置到2V -8°C下2h以上析晶。
[0020]本發(fā)明步驟4可以通過常溫旋蒸的方法將乙腈的比例降至15%以下，再將其pH值用20%的稀氨水調(diào)至6.0-7.0后放置到2-8攝氏度2小時(shí)以上，使替度魯肽析出。通過對(duì)乙腈濃度以及PH值的合理調(diào)節(jié)，本發(fā)明能夠?qū)㈦s質(zhì)溶解于溶液中，而通過鹽析的方法將替度魯肽析出，配合前述的RP-HPLC的純化效果，能夠保證純化出的替度魯肽達(dá)到較高的品質(zhì)。
[0021]鑒于替度魯肽在臨床應(yīng)用中本身不太穩(wěn)定，需要以替度魯肽醋酸鹽形式存在，故本發(fā)明還包括將替度魯肽純品用RP-HPLC轉(zhuǎn)醋酸鹽步驟，具體為:
[0022]用磷酸水溶液溶解替度魯肽純品，然后加水稀釋一倍后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，先以乙腈為流動(dòng)相B、以體積百分比為0.1%-0.8%的醋酸銨溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行進(jìn)行沖洗，然后再以乙腈為流動(dòng)相B、醋酸水溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫15min-30min，收集從替度魯肽醋酸鹽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽醋酸鹽主峰結(jié)束之間的流份，濃縮、冷凍干燥后即為替度魯肽醋酸鹽純品。
[0023]其中作為優(yōu)選，所述磷酸水溶液中磷酸的體積半分比為60%_100%，所述沖洗時(shí)間為 15min_30mino
[0024]優(yōu)選地，所述沖洗中乙腈終濃度為醋酸銨溶液和乙腈體積之和的3%_15%。
[0025]優(yōu)選地，所述梯度洗脫中醋酸水溶液中的醋酸體積百分比為0.1%-0.4%，乙腈的濃度以體積百分比計(jì)從10%升至55%，更優(yōu)選地，醋酸水溶液中的醋酸體積百分比為0.1%，乙腈的濃度以體積百分比計(jì)從20%升至50%。
[0026]以不同純度的替度魯肽粗品(20%_90%)按照本發(fā)明的純化方法進(jìn)行純化，結(jié)果顯示，替度魯肽收率可達(dá)到80%以上，純度達(dá)到99%以上，明顯優(yōu)于申請(qǐng)?zhí)枮?00910126363的現(xiàn)有專利技術(shù)。此外，本發(fā)明同樣采用20%-40%濃度的替度魯肽粗品，按照上述專利純化方法進(jìn)行純化，結(jié)果需要純化5-6次方能達(dá)到95%以上純度，且收率在20%以下。同時(shí)，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，以本發(fā)明所述純化方法為基礎(chǔ)，改變其中某一個(gè)條件參數(shù)，結(jié)果顯示純化大多無法進(jìn)行或者效率低下，無法達(dá)到本發(fā)明所述方法的純化效果。
[0027]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過醋酸-乙腈混合溶解體系對(duì)替度魯肽粗品前處理，而后以適宜的流動(dòng)相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，最后通過控制乙腈濃度和pH值純化出品質(zhì)較高的替度魯肽純品，與現(xiàn)有單純采用RP-HPLC純化方法相比，節(jié)省了成本，提高了純化效率和收率。

【具體實(shí)施方式】
[0028]本發(fā)明實(shí)施例公開了一種替度魯肽的純化方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0029]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種替度魯肽的純化方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0030]實(shí)施例1:純化純度為20%的替度魯肽粗品
[0031 ] 將純度為20%的替度魯肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(體積百分比，乙腈10%，醋酸40%)溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為15%，得到替度魯肽粗品溶液；
[0032]將替度魯肽粗品溶液用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫20min，從替度魯肽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽主峰結(jié)束分10次收集替度魯肽流份，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份進(jìn)行下步純化；其中，所述梯度洗脫以pH值為5.5 (用氨水調(diào)節(jié))的硫酸-高氯酸混合水溶液(體積百分比，硫酸0.3%，高氯酸
0.1%)為流動(dòng)A相，以乙腈為流動(dòng)B相，乙腈梯度以體積百分比計(jì)從25%至45%，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，規(guī)格為30cmX25cm ；
[0033]將上述收集的替度魯肽純度在90%_95%的流份再次按照上述的方法進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用；
[0034]混合所有分離的替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份，通過常溫旋蒸的方法將替度魯肽流份中乙腈體積百分比降至15%以下，同時(shí)用體積百分比為20%的稀氨水調(diào)節(jié)PH值為6后放置到2-8攝氏度下2小時(shí)以上析晶，然后離心處理，所得固體即為替度魯肽純品，收率為84%，純度為96.1% ；
[0035]用60%磷酸水溶液溶解替度魯肽純品，然后加注射用水稀釋一倍后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，先以乙腈為流動(dòng)相B、以體積百分比為0.4%的醋酸銨溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行進(jìn)行沖洗20min，然后再以乙腈為流動(dòng)B相、醋酸水溶液為流動(dòng)A相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫20min，收集從替度魯肽醋酸鹽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽醋酸鹽主峰結(jié)束之間的流份，濃縮、冷凍干燥后即為替度魯肽醋酸鹽純品，收率為94%，純度為99.2% ;其中，所述沖洗中乙腈終濃度為醋酸銨溶液和乙腈體積之和的5%，所述梯度洗脫中醋酸水溶液中醋酸體積百分比為0.1%，乙腈的濃度為從20%升至50%。
[0036]實(shí)施例2:純化純度為50%的替度魯肽粗品
[0037]將純度為50%的替度魯肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(體積百分比，乙腈15%，醋酸30%)溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為20%，得到替度魯肽粗品溶液；
[0038]將替度魯肽粗品溶液用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫20min，從替度魯肽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽主峰結(jié)束分10次收集替度魯肽流份，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份進(jìn)行下步純化；其中，所述梯度洗脫以pH值為5.5 (用氨水調(diào)節(jié))的硫酸-高氯酸混合水溶液(體積百分比，硫酸0.4%，高氯酸
0.1%)為流動(dòng)A相，以乙腈為流動(dòng)B相，乙腈梯度以體積百分比計(jì)從25%至45%，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，規(guī)格為30cmX25cm ；
[0039]將上述收集的替度魯肽純度在90%_95%的流份再次按照上述的方法進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用；
[0040]混合所有分離的替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份，通過常溫旋蒸的方法將替度魯肽流份中乙腈體積百分比降至15%以下，同時(shí)用體積百分比為20%的稀氨水調(diào)節(jié)PH值為6后放置到2-8攝氏度下2小時(shí)以上析晶，然后離心處理，所得固體即為替度魯肽純品，收率為89%，純度為97.3% ；
[0041]用65%磷酸水溶液溶解替度魯肽純品，然后加注射用水稀釋一倍后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，先以乙腈為流動(dòng)相B、以體積百分比為0.3%的醋酸銨溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行進(jìn)行沖洗20min，然后再以乙腈為流動(dòng)B相、醋酸水溶液為流動(dòng)A相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫20min，收集從替度魯肽醋酸鹽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽醋酸鹽主峰結(jié)束之間的流份，濃縮、冷凍干燥后即為替度魯肽醋酸鹽純品，收率為88%，純度為99.3% ;其中，所述沖洗中乙腈終濃度為醋酸銨溶液和乙腈體積之和的8%，所述梯度洗脫中醋酸水溶液中醋酸體積百分比為0.15%，乙腈的濃度為從22%升至52%。
[0042]實(shí)施例3:純化純度為80%的替度魯肽粗品
[0043]將純度為80%的替度魯肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(體積百分比，乙腈20%，醋酸35%)溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為25 %，得到替度魯肽粗品溶液；
[0044]將替度魯肽粗品溶液用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫20min，從替度魯肽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽主峰結(jié)束分10次收集替度魯肽流份，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份進(jìn)行下步純化；其中，所述梯度洗脫以pH值為5.5 (用氨水調(diào)節(jié))的硫酸-高氯酸混合水溶液(體積百分比，硫酸0.25%，高氯酸
0.2%)為流動(dòng)A相，以乙腈為流動(dòng)B相，乙腈梯度以體積百分比計(jì)從25%至45%，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，規(guī)格為30cmX25cm ；
[0045]將上述收集的替度魯肽純度在90%_95%的流份再次按照上述的方法進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用；
[0046]混合所有分離的替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份，通過常溫旋蒸的方法將替度魯肽流份中乙腈體積百分比降至15%以下，同時(shí)用體積百分比為20%的稀氨水調(diào)節(jié)PH值為6后放置到2-8攝氏度下2小時(shí)以上析晶，然后離心處理，所得固體即為替度魯肽純品，收率為94.5%，純度為98.1% ；
[0047]用70%磷酸水溶液溶解替度魯肽純品，然后加注射用水稀釋一倍后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，先以乙腈為流動(dòng)相B、以體積百分比為0.35%的醋酸銨溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行進(jìn)行沖洗20min，然后再以乙腈為流動(dòng)B相、醋酸水溶液為流動(dòng)A相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫20min，收集從替度魯肽醋酸鹽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽醋酸鹽主峰結(jié)束之間的流份，濃縮、冷凍干燥后即為替度魯肽醋酸鹽純品，收率為92%，純度為99.5% ;其中，所述沖洗中乙腈終濃度為醋酸銨溶液和乙腈體積之和的8%，所述梯度洗脫中醋酸水溶液中醋酸體積百分比為0.2%，乙腈的濃度為從18%升至48%。
[0048]實(shí)施例4:純化純度為90%的替度魯肽粗品
[0049]將純度為90%的替度魯肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液(體積百分比，乙腈5%，醋酸30%)溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為12%，得到替度魯肽粗品溶液；
[0050]將替度魯肽粗品溶液用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫20min，從替度魯肽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽主峰結(jié)束分10次收集替度魯肽流份，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份進(jìn)行下步純化；其中，所述梯度洗脫以pH值為5.5 (用氨水調(diào)節(jié))的硫酸-高氯酸混合水溶液(體積百分比，硫酸0.4%，高氯酸
0.1%)為流動(dòng)A相，以乙腈為流動(dòng)B相，乙腈梯度以體積百分比計(jì)從25%至45%，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，規(guī)格為30cmX25cm ；
[0051 ] 將上述收集的替度魯肽純度在90%_95%的流份再次按照上述的方法進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用；
[0052]混合所有分離的替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份，通過常溫旋蒸的方法將替度魯肽流份中乙腈體積百分比降至15%以下，同時(shí)用體積百分比為20%的稀氨水調(diào)節(jié)PH值為6后放置到2-8攝氏度下2小時(shí)以上析晶，然后離心處理，所得固體即為替度魯肽純品，收率為93.8%，純度為98.3% ；
[0053]用68%磷酸水溶液溶解替度魯肽純品，然后加注射用水稀釋一倍后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，先以乙腈為流動(dòng)相B、以體積百分比為0.3%的醋酸銨溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行進(jìn)行沖洗20min，然后再以乙腈為流動(dòng)B相、醋酸水溶液為流動(dòng)A相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫20min，收集從替度魯肽醋酸鹽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽醋酸鹽主峰結(jié)束之間的流份，濃縮、冷凍干燥后即為替度魯肽醋酸鹽純品，收率為92.9%，純度為99.4% ;其中，所述沖洗中乙腈終濃度為醋酸銨溶液和乙腈體積之和的9%，所述梯度洗脫中醋酸水溶液中醋酸體積百分比為0.2%，乙腈的濃度為從20%升至50%。
[0054]實(shí)施例5:對(duì)比試驗(yàn)
[0055]1、純化效率對(duì)比試驗(yàn)
[0056]采用本發(fā)明實(shí)施例1-4方法和申請(qǐng)?zhí)枮?00910126363的現(xiàn)有專利技術(shù)純化純度為20%的替度魯肽粗品(轉(zhuǎn)醋酸鹽步驟采用本發(fā)明轉(zhuǎn)醋酸鹽步驟)，統(tǒng)計(jì)純化次數(shù)以及純度、收率，結(jié)果見表1.
[0057]表1純化效率試驗(yàn)對(duì)比結(jié)果
[0058]

【權(quán)利要求】
1.一種替度魯肽的純化方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1、將替度魯肽粗品用乙腈-醋酸混合水溶液溶解，然后加水稀釋至乙腈和醋酸的體積百分比之和為10%-30%，得到替度魯肽粗品溶液； 步驟2、將替度魯肽粗品溶液用RP-HPLC進(jìn)行梯度洗脫20-40min，從替度魯肽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽主峰結(jié)束分10-20次收集替度魯肽流份，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用，分離出純度在90%-95%的替度魯肽流份進(jìn)行下步純化； 其中，所述梯度洗脫以PH值為5.5-6.5的硫酸-高氯酸混合水溶液為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，乙腈濃度以體積百分比計(jì)從25%升至45% ； 步驟3、將步驟2收集的替度魯肽純度在90%-95%的流份再次按照步驟2的方法進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫，分離出替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份備用； 步驟4、混合步驟2和步驟3分離的替度魯肽純度在95%以上的替度魯肽流份，調(diào)整替度魯肽流份中乙腈體積百分比低于15%、pH值為6-7后靜置析晶，離心后所得固體即為替度魯妝純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述乙腈-醋酸混合水溶液由體積百分比為30%-60%的醋酸、5%-20%乙腈和余量水組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述替度魯肽粗品和乙腈-醋酸混合水溶液的質(zhì)量體積比為20g-50g: 1L。
4.根據(jù)權(quán)利要求 1所述方法，其特征在于，步驟2所述硫酸-高氯酸混合水溶液由體積百分比為0.1%-0.4%的硫酸、0.1%-0.4%高氯酸和余量水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2和步驟4所述pH值用氨水調(diào)節(jié)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟4所述靜置析晶為放置到2°C_8°C下2h以上析晶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述梯度洗脫采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，還包括將替度魯肽純品用RP-HPLC轉(zhuǎn)醋酸鹽步驟，具體為: 用磷酸水溶液溶解替度魯肽純品，然后加水稀釋一倍后，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，先以乙腈為流動(dòng)相B、以體積百分比為0.1%-0.8%的醋酸銨溶液為流動(dòng)相A進(jìn)行進(jìn)行沖洗，然后再以乙腈為流動(dòng)B相、醋酸水溶液為流動(dòng)A相進(jìn)行RP-HPLC梯度洗脫15min-30min，收集從替度魯肽醋酸鹽主峰出現(xiàn)開始至替度魯肽醋酸鹽主峰結(jié)束之間的流份，濃縮、冷凍干燥后即為替度魯肽醋酸鹽純品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述沖洗中乙腈終濃度為醋酸銨溶液和乙腈體積之和的3%-15%。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述梯度洗脫中醋酸水溶液中的醋酸體積百分比為0.1%-0.4%，乙腈的濃度以體積百分比計(jì)從10%升至55%。
【文檔編號(hào)】C07K14/605GK104045707SQ201310080960
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月14日
【發(fā)明者】趙忠衛(wèi), 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司