一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，分離純化過程為：將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1∶8?12g/ml的料液比加入NaOH溶液超聲浸提30?50min，之后加入HC1溶液調(diào)pH<2，室溫靜置,離心收集得到膠狀沉淀；純化過程為：將收集到的膠狀沉淀懸浮于15?25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2?4h，冷卻后離心收集固體顆粒；將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行多次沉淀，得到黑色素顆粒。所述分離純化方法操作簡(jiǎn)單，黎豆種皮黑色素的分離純化量高并且純度高，黑色素氧化程度低，分離純化周期短，此外成本低廉，適合用于進(jìn)行黎豆種皮黑色素的大規(guī)模分離純化，提高了黎豆的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，拓寬了黎豆的應(yīng)用領(lǐng)域。
【專利說明】
一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分離純化工藝技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黑色素是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的棕黑到黑色難溶性色素的總稱，具有重要的生理特征。在動(dòng)植物體內(nèi)黑色素具有防御、保護(hù)的功能?，F(xiàn)有資料表明，黑色素一般為兩種類型，即H引噪型(Eumelanin)和鄰苯二酸型(Pheomelanin)。認(rèn)為動(dòng)物黑色素多屬口引噪型(Eumelanin)，而植物源黑色素多屬鄰苯二酸型(Pheomelanin)。
[0003]黑色素可為生物體提供結(jié)構(gòu)性強(qiáng)度或保護(hù)生物免紫外線、電離輻射、重金屬污染、低溫和高溫等環(huán)境脅迫的傷害。它不僅是一類光保護(hù)劑、抗輻射劑、螯合劑、生物抗氧化劑和免疫促進(jìn)劑，而且還是一類生物半導(dǎo)體材料。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)，黑色素具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒復(fù)制、治療帕金森癥等作用，具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用潛力。在食品方面的開發(fā)利用最為常見，可以將黑色素制成的食品添加劑，不僅無毒無害，還能對(duì)人體其保健作用。在保健功能食品上，可利用黑色素的功效成分生產(chǎn)口服液、營(yíng)養(yǎng)保健片、多維膠囊等。
[0004]黎豆(Stizolobium capitatum Kuntze)又名貓貓豆、毛毛豆、龍爪豆、毛狗豆、小狗豆、狗爪豆、貍豆、虎豆、八升豆，是豆科黎豆屬一年生草本植物。原產(chǎn)亞洲南部，分布于熱帶和亞熱帶(美洲除外)，我國(guó)四川、云南、廣西、貴州、湖南、湖北、安徽等省均有栽培，日本也廣為栽培。我國(guó)對(duì)黎豆種皮黑色素的研究開發(fā)尚未見報(bào)道，目前常用的分離純化工藝無法從黎豆種皮中有效分離純化黑色素。
[0005]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于進(jìn)一步改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明在于提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，旨在解決目前無相應(yīng)技術(shù)能從黎豆種皮中有效分離純化黑色素的問題。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，所述方法為:
提取過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:8-12g/ml的料液比加入NaOH溶液超聲浸提30_50min，之后加入HCl溶液調(diào)pH〈2，室溫靜置，離心收集得到膠狀沉淀；
純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15-25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2-4h，冷卻后離心收集固體顆粒；
將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行多次沉淀，得到黑色素顆粒。
[0008]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中按照1:10g/ml的料液比加入NaOH溶液。
[0009]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，所用NaOH溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。
[0010]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中浸提時(shí)間為40min。
[0011]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中浸提溫度條件為60°C。
[0012]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，提取過程中利用濃度為0.5mol/LHCl溶液調(diào)pH為I。
[0013]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，純化過程中將收集的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的HCl溶液中水解。
[0014]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，純化過程中沸水浴中水解并冷卻后在4000-5000r/min離心1min后，收集固體顆粒。
[0015]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，將純化過程中對(duì)固體顆粒的洗滌方法為:依次用固體顆粒質(zhì)量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進(jìn)行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0016]所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其中，所述利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行多次沉淀具體為:將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH I?2，沉淀I?2 h后離心，然后再次加入NaOH調(diào)節(jié)至pH 11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復(fù)沉淀。
[0017]有益效果:本發(fā)明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，所述分離純化方法操作簡(jiǎn)單，黎豆種皮黑色素的分離純化量高并且純度高，黑色素氧化程度低，分離純化周期短，此外成本低廉，適合用于進(jìn)行黎豆種皮黑色素的大規(guī)模分離純化，提高了黎豆的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，拓寬了黎豆的應(yīng)用領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0019]本發(fā)明提供一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，所述分離純化方法為:
分離純化過程包括如下步驟:
S1:將黎豆種皮進(jìn)行水煮除雜:稱取黎豆種皮，將其放入錐形瓶中，加入蒸餾水煮沸15min后過濾，以除去水溶性雜質(zhì)和排除材料中的氣體，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0020]S 2:按照質(zhì)量比1: 8 -12 g /m I的料液比向溶液中加入Na OH溶液，并超聲浸提3 O -50mino
[0021]由于黑色素具有溶于堿性溶液而在酸性溶液中沉淀的性質(zhì)，并且堿液對(duì)黑色素的選擇性高，溶解力強(qiáng)，萃取率也高，因此堿溶酸沉法是黎豆種皮黑色素的有效分離純化方法。而堿液中，NaOH溶液的堿性強(qiáng)，對(duì)黑色素的溶解力更強(qiáng)，分離純化效果好。當(dāng)NaOH溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，黑色素的溶解力最強(qiáng)，分離純化效率最高。
[0022]在一定范圍內(nèi)，黎豆種皮黑色素的分離純化量隨NaOH溶液的量增加而提高，但是當(dāng)NaOH溶液的量過多時(shí)，黎豆種皮黑色素的分離純化量基本不再改變，此時(shí)過多的NaOH溶液會(huì)提高分離純化的成本，造成浪費(fèi)。當(dāng)按照質(zhì)量比1: 8-12g/ml的料液比向溶液中加入NaOH溶液時(shí)，黎豆種皮黑色素的分離純化效率高，成本較低。優(yōu)選地，當(dāng)料液比為比I: 1g/ml時(shí)，黎豆種皮黑色素的分離純化量達(dá)到最高，并且消耗NaOH溶液的量最少。
[0023]浸提的時(shí)間越長(zhǎng)，黑色素分離純化的量越多，但是時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，容易由于微生物的滋生而污染分離純化物。當(dāng)浸提時(shí)間控制在30-50min，黑色素分離純化效率高，并且品質(zhì)好。優(yōu)選地實(shí)施例中，在分離純化過程中浸提時(shí)間為40min，此時(shí)能保證最大程度地分離純化黎豆種皮黑色素。
[0024]由于隨著分離純化溫度的升高，黑色素得率不斷上升。但是60°C后，黑色素的氧化程度進(jìn)一步加深，抗氧化能力不斷降低，黑色素含量明顯呈下降趨勢(shì)，粗提物中雜質(zhì)含量提高，黑色素含量下降，，這將對(duì)下一步的純化帶來不便，因此，在分離純化過程中，浸提溫度條件為60°C時(shí)，黑色素的分離純化率最高，有利于后續(xù)的純化。
[0025]S3:向溶液中加入HCl溶液直至將溶液的pH〈2.0，收集得到膠狀沉淀。當(dāng)溶液的PH調(diào)為小于2時(shí)，溶液中黑色素溶解度低，極易沉淀下來。優(yōu)選地，分離純化過程中利用濃度為
0.5mol/L HCl溶液調(diào)PH為I，溶液中黎豆種皮黑色素溶解度達(dá)到最低，分離純化量最高。
[0026]純化方法包括以下步驟:
S4:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15-25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2_4 h，冷卻后離心收集固體顆粒。這能有效分離膠狀沉淀與黑色素結(jié)合的雜質(zhì)，并去除一部分能溶于酸的雜質(zhì)。
[0027]由于HCl濃度越大，黑色素純度越高，當(dāng)HCl濃度過高時(shí)，黎豆黑色素的生物活性會(huì)受到破壞，而且還會(huì)帶來不必要的能源損耗，提高成本。優(yōu)選地，所用HCl溶液濃度為1.5mol/L，此種條件下分離和溶解雜質(zhì)的效果最好。
[0028]優(yōu)選地，純化過程中將收集的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的HCl溶液中水解，此種條件下分離和溶解雜質(zhì)的效果最好。
[0029]優(yōu)選地，純化過程中沸水浴中水解并冷卻后在4000-5000r/min離心1min后，收集固體顆粒。此種條件下獲得的固體顆粒的得率最高。
[0030]S5:將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌。這個(gè)步驟是用于高效去除固體顆粒中的脂溶性雜質(zhì)。
[0031]具體地，將純化過程中對(duì)固體顆粒的洗滌方法為:依次用固體顆粒質(zhì)量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進(jìn)行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。這種條件下，洗滌效果最好，去除脂溶性雜質(zhì)效率最尚O
[0032]S6:并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行多次沉淀，得到黑色素顆粒。
[0033]上述步驟具體為:將洗滌后的固體顆粒首先用0.5mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH I?2，沉淀I?2 h后離心，然后再次加入NaOH調(diào)節(jié)至pH 11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復(fù)沉淀。
[0034]由于黎豆種皮黑色素在pHI?2的環(huán)境下溶解度最低，以沉淀形式最大程度地析出，而在pH 11時(shí)溶解度最高，溶解在溶液上清中。因此，采用上述的條件利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行反復(fù)沉淀，能最大程度的去除黎豆種皮黑色素中的剩余雜質(zhì)，獲得高純度的黎豆種皮黑色素。
[0035]在純化后，還可對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行以下的處理，進(jìn)一步提高產(chǎn)物的品質(zhì)。
[0036]S7:將得到的黑色素顆粒進(jìn)行冷凍，得到的冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl一定性檢測(cè)為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。由于多次沉淀，獲得的黑色素顆粒中存在Cl—，為避免Cl 一影響黎豆種皮黑色素的純度及品質(zhì)，需要蒸餾水洗滌沉淀去除Cl—雜質(zhì)。
[0037]為了更詳盡的描述本發(fā)明的制備方法，以下列舉幾個(gè)實(shí)施例更進(jìn)一步的說明。
[0038]實(shí)施例1
本發(fā)明提供的黎豆種皮黑色素的分離純化方法如下:
分離純化過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:10g/ml的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，60°C條件下超聲浸提40min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)PH為I，離心收集得到膠狀沉淀。
[0039]純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解2 h，冷卻后在5000r/min條件下離心1min后，收集固體顆粒。
[0040]依次用固體顆粒質(zhì)量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進(jìn)行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0041 ]將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH I，沉淀Ih后離心，然后再次加入NaOH調(diào)節(jié)至pH11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復(fù)沉淀，最后得到黑色素顆粒。
[0042]將得到的黑色素顆粒冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl 一定性檢測(cè)為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黎豆種皮黑色素的得率有3.2%，黑色素含量純度為89%。
[0044]實(shí)施例2
本發(fā)明提供的黎豆種皮黑色素的分離純化方法如下:
分離純化過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照I: 8g/ml的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，50°C條件下超聲浸提30min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)PH為I，離心收集得到膠狀沉淀。
[0045]純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于20倍體積的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解3 h，冷卻后在4000r/min條件下離心1min后，收集固體顆粒。
[0046]依次用固體顆粒質(zhì)量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進(jìn)行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0047]將洗滌后的固體顆粒首先用0.5mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH I，沉淀Ih后離心，然后再次加入NaOH調(diào)節(jié)至pH11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復(fù)沉淀，最后得到黑色素顆粒。
[0048]將得到的黑色素顆粒冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl 一定性檢測(cè)為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。
[0049]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黎豆種皮黑色素的得率有3.0%，黑色素含量純度為85%。
[0050]實(shí)施例3
本發(fā)明提供的黎豆種皮黑色素的分離純化方法如下:
分離純化過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:12g/ml的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，70°C條件下超聲浸提50min，再加入0.5 mol/L的HCl溶液調(diào)PH為2，離心收集得到膠狀沉淀。[0051 ]純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于25倍體積的1.5mol/L的HCl溶液，在沸水浴中水解4h，冷卻后在5000r/min條件下離心1min后，收集固體顆粒。
[0052]依次用固體顆粒質(zhì)量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進(jìn)行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。
[0053]將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH I，沉淀Ih后離心，然后再次加入NaOH調(diào)節(jié)至pH11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復(fù)沉淀，最后得到黑色素顆粒。
[0054]將得到的黑色素顆粒冷凍后在室溫下解凍，用蒸餾水洗滌沉淀，至離心上清液Cl 一定性檢測(cè)為陰性后，在室溫下真空干燥至恒重，得到黑色素純品。
[0055]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黎豆種皮黑色素的得率有3.15%，黑色素含量純度為86%。
[0056]本發(fā)明提供的一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法不僅操作簡(jiǎn)單，黎豆種皮黑色素的分離純化量高并且純度高，黑色素氧化程度低，分離純化周期短，此外成本低廉，適合用于進(jìn)行黎豆種皮黑色素的大規(guī)模分離純化，提高了黎豆的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，拓寬了黎豆的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0057]應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，所述方法為: 提取過程:將黎豆種皮通過水煮除雜后，按照1:8-12g/ml的料液比加入NaOH溶液超聲浸提30_50min，之后加入HCl溶液調(diào)pH〈2，室溫靜置，離心收集得到膠狀沉淀； 純化過程:將收集到的膠狀沉淀懸浮于15-25倍體積的HCl溶液，在沸水浴中水解2 -4h，冷卻后離心收集固體顆粒； 將收集的固體顆粒依次用乙醇、乙酸乙酯、丙酮洗滌，并在之后利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行多次沉淀，得到黑色素顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中按照1:10g/ml的料液比加入NaOH溶液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，所用NaOH溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中浸提時(shí)間為40min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中浸提溫度條件為60°C。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，提取過程中利用濃度為0.5mol/L HCl溶液調(diào)pH為I。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，純化過程中將收集的膠狀沉淀懸浮于15倍體積的HCl溶液中水解。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，純化過程中沸水浴中水解并冷卻后在4000-5000r/min離心1min后，收集固體顆粒。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，將純化過程中對(duì)固體顆粒的洗滌方法為:依次用固體顆粒質(zhì)量的50倍體積的乙醇洗滌3次、乙酸乙酯洗滌2次、丙酮洗滌I次，每次洗滌過程中進(jìn)行混合并震蕩30min，然后4000r/min離心分離lOmin。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黎豆種皮黑色素的分離純化方法，其特征在于，所述利用NaOH溶液和HCL溶液進(jìn)行多次沉淀具體為:將洗滌后的固體顆粒首先用0.5 mol/L NaOH在超聲波輔助下溶解30 min，離心除去未溶解部分，然后用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH I?2，沉淀I?2 h后離心，然后再次加入NaOH調(diào)節(jié)至pH 11使固體顆粒溶解，離心取上清液酸化使之沉淀，如此反復(fù)沉淀。
【文檔編號(hào)】C09B67/54GK106009768SQ201610411427
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】董華強(qiáng), 麥釗鍵
【申請(qǐng)人】佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院