EB病毒編碼的microRNA BART6-3p在制備胃癌細胞抑制劑上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用EB病毒編碼的microRNA BART6-3p制備胃癌細胞抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] EB病毒(^Epstein Barr virus, EBV)是一種普遍存在的人類皰疹病毒，可以感染全 球95 %左右的成人人口，除偶爾有一小部分人會引起傳染性的單核細胞增多癥外，大部分 被感染者不會出現(xiàn)任何的臨床癥狀，絕大多數(shù)情況下EBV可以在宿主體內(nèi)長期潛伏感染。 然而，在某些情況下潛伏感染的EBV會導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，包括B細胞來源的伯基特和何 杰金氏淋巴瘤，以及上皮細胞來源鼻咽癌和胃癌等。EBV導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的機制目前尚未 完全明了，可能與EBV本身編碼一系列基因的表達有關(guān)，如EBV編碼的潛伏膜蛋白1 (Latent Membrane Proteinl，LMPl)作為一種致瘤蛋白，能激活許多宿主細胞內(nèi)癌基因的表達，抑制 抑瘤基因的結(jié)構(gòu)和功能。
[0003] EBV作為雙鏈DNA病毒其基因組大小約為170kb，除了可轉(zhuǎn)錄一系列蛋白編碼基 因外，最近還發(fā)現(xiàn)EBV也可編碼一類微小RNA(microRNA，miRNA)分子。miRNA是一種長約 20~25nt的調(diào)控型非編碼RNA，與mRNA不同，miRNA不是DNA和蛋白質(zhì)之間的"橋梁"，而 是通過與目的基因靶向結(jié)合，調(diào)控基因的表達水平。EBV是第一個被發(fā)現(xiàn)可編碼miRNA的病 毒，進入宿主后EBV即開始表達產(chǎn)生miRNA，發(fā)揮生物學(xué)作用。目前已發(fā)現(xiàn)EBV可編碼25個 miRNAs前體，加工成44個成熟的miRNAs，且EBV編碼的miRNAs在EBV基因組上成簇分布， 可以分為BART和BHRF1兩組。EBV編碼的miRNAs可能通過調(diào)控EBV本身編碼的基因或者 宿主細胞內(nèi)的基因，從而參與了 EBV介導(dǎo)的腫瘤惡性轉(zhuǎn)化，影響包括鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤 等在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而目前對于EBV編碼miRNAs的研究還不是很透徹，44個 成熟的EBV miRNAs中大部分還沒有功能研究的報道，比如有關(guān)EBV編碼的miRNA BART6-3p 的作用及機制的研究就很少。迄今為止有關(guān)BART6-3p在鼻咽癌、胃癌等實體瘤發(fā)生發(fā)展中 的作用的關(guān)系及其在實體瘤病人的早期篩查、輔助診斷或者療效預(yù)測等方面均沒有文獻報 道。
[0004] 我們通過研究表明，BART6-3P在鼻咽癌和胃癌組織中的表達均顯著升高，但是非 常有意思的是在鼻咽癌和胃癌組織中BART6-3p的表達水平與鼻咽癌和胃癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn) 移呈負相關(guān)關(guān)系，低表達BART6-3p的患者比高表達BART6-3p的患者更容易發(fā)生復(fù)發(fā)和 轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。這表明盡管EBV是比較明確的致瘤性病毒，但并非EBV編碼的基因全部 都具有促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，部分基因，包括BART6-3p可能具有抑瘤功能，這也表明 EBV miRNAs的表達水平與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)后等臨床表型的關(guān)系不能推測，只能通過具體 而細致的實驗研究才能確定。因此，針對BART6-3p設(shè)計專用原位雜交探針及檢測試劑盒， 或者利用BART6-3p特異性引物進行實時熒光定量PCR等技術(shù)檢測鼻咽癌和胃癌組織中 BART6-3p的表達水平有望為臨床上對腫瘤進行復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)測提供參考。
[0005] 我們在鼻咽癌及胃癌細胞中轉(zhuǎn)染人工合成的BART6-3p，證實在EBV陰性的鼻咽癌 和胃癌細胞中表達BART6-3p可以明顯抑制腫瘤細胞的生長增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此， BART6-3p又可以用于制備抑制腫瘤細胞生長、增殖和預(yù)防腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的制劑。
[0006] 我們還設(shè)計了一系列的實驗檢測了 BART6-3P在鼻咽癌和胃癌細胞中發(fā)揮生物學(xué) 功能的分子機制，我們發(fā)現(xiàn)BART6-3p可抑制細胞內(nèi)一個長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，IncRNA)基因 L0C553103 的表達（Reference Sequence :NR_110997)，我們設(shè)計了針對 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)轉(zhuǎn)染鼻咽癌和胃癌細胞，抑制L0C553103的表達后，細 胞出現(xiàn)類似轉(zhuǎn)染BART6-3p的細胞生物學(xué)表型，即抑制腫瘤細胞生長和增殖以及抑制腫瘤 細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力。因此，針對L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)也可以用于制備抑 制腫瘤細胞生長、增殖和預(yù)防腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的制劑。此前，有關(guān)L0C553103的功能未見 任何文獻報道。
[0007] 細胞骨架是真核細胞中由微管、微絲和中間纖維三種蛋白纖維搭建而成的存在于 胞漿內(nèi)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，三種成分高度協(xié)調(diào)分布，將胞核、質(zhì)膜、各細胞器連在一起，構(gòu)成了細胞 形態(tài)維持和運動協(xié)調(diào)的支持系統(tǒng)。近年來的研究表明腫瘤細胞運動迀移和侵襲能力與細胞 骨架的動態(tài)調(diào)控密切相關(guān)，靶向細胞骨架的藥物也可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤細胞的 增殖。我們通過系列實驗證實了 BART6-3p可通過靶向抑制宿主細胞中L0C553103的表達， 影響腫瘤細胞中微管微絲的組裝，調(diào)控細胞骨架的重構(gòu)，最終導(dǎo)致腫瘤細胞生長、增殖、侵 襲、轉(zhuǎn)移等表型的變化。因此，BART6-3p和針對L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)還可 以用于制備抑制腫瘤細胞骨架組裝和重構(gòu)的制劑。
[0008] 另外，我們又在鼻咽癌和胃癌的臨床樣本中檢測L0C553103的表達狀況，發(fā)現(xiàn)其 在癌旁對照組織中高表達，而在大部分腫瘤組織中低表達，且與BART6-3p的表達呈負相 關(guān)，L0C553103的表達可以作為患者預(yù)后的指標，因此，針對L0C553103設(shè)計專用的實時熒 光定量PCR引物及檢測試劑盒或原位雜交探針及檢測試劑盒，用于檢測鼻咽癌和胃癌組織 L0C553103的表達水平有望為臨床上對這兩種腫瘤進行復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后預(yù)測提供參考。
[0009] 總之，我們的研究揭示了 BART6-3p及一個新的IncRNA基因 L0C553103在鼻咽癌 和胃癌等惡性腫瘤發(fā)病過程中的功能，為BART6-3p和L0C553103的應(yīng)用方法提供了實證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種EB病毒編碼的microRNA BART6-3P的應(yīng)用方法，具體 是利用BART6-3p的序列制備用于抑制胃癌細胞的制劑。
[0011] EBV編碼microRNA BART6-3P在制備胃癌細胞抑制劑上的應(yīng)用，microRNA BART6-3p用于制備抑制胃癌細胞生長、增殖和預(yù)防腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的制劑；microRNA BART6-3p 的序列：CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA。microRNA BART6-3p 進一步用于制備抑制胃 癌細胞骨架組裝和重構(gòu)的制劑。
[0012] 本發(fā)明探討了 BART6-3p抑制腫瘤細胞生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的具體機制， 發(fā)現(xiàn)表達BART6-3p可以改變腫瘤細胞中細胞骨架的完整性，而細胞骨架的動態(tài)組裝是腫 瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，細胞骨架完整性的破壞可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡抑制腫瘤細胞增 殖，這就可以解釋BART6-3p為什么具有抑制腫瘤惡性表型（生長、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移）的能 力。本發(fā)明為胃癌的輔助治療提供了強有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠的臨床意義和重 要的推廣應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0013] 圖1為實時熒光定量PCR技術(shù)檢測BART6-3p在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表達 情況，
[0014] BART6-3p在鼻咽癌（T)中的表達比正常鼻咽上皮（N)中顯著提高（Ρ〈0·001)。
[0015] 圖2為原位雜交檢測BART6-3p在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況，
[0016] 左邊為一例鼻咽癌活檢標本，BART6-3p在癌組織中高表達，而在癌旁 (Adjacency)正常鼻咽上皮中低表達；右邊為另一例癌芳正常鼻咽上皮標本，BART6_3p在 癌旁組織中基本檢測不到。
[0017] 圖3為鼻咽癌及癌旁上皮中BART6-3p原位雜交數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果，
[0018] 在40例鼻咽癌癌旁正常上皮（Adjacency of NPC)中有34例BART6_3p的表達低， 甚至基本檢測不到（negative)，而在115例鼻咽癌（NPC)中57例檢測到有BART6-3p的高 表達（high)，其余58例為低表達（low)，Ρ〈0· 001 〇
[0019] 圖4為BART6-3p的表達與鼻咽癌遠處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，
[0020] 在115例鼻咽癌標本中，92例發(fā)生了復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中31例為原位復(fù)發(fā)（local relapse)，61例為遠處轉(zhuǎn)移（distance Metastasis)，從統(tǒng)計結(jié)果中可以看出遠處轉(zhuǎn)移的患 者中BART6-3p高表達的比例更低（P〈0. 05)，表明BART6-3p的表達與腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈負相 關(guān)。
[0021] 圖5為BART6-3p的表達與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系，
[0022] 鼻咽癌中BART6-3p的表達與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，即BART6-3p高表達 (High)的患者生存時間要明顯長于BART6-3p低表達（Low)的患者（Ρ〈0·05)。
[0023] 圖6為原位雜交檢測BART6-3p在胃癌及癌旁上皮中的表達情況，
[0024] 左邊為一例胃癌活檢標本，BART6-3p在癌組織中高表達；右邊為癌旁正常組織標 本，BART6-3p在癌旁組織中基本檢測不到。
[0025] 圖7為BART6-3p的表達與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，
[0026] BART6-3p的表達與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，即BART6-3p高表達（High)的患者 生存時間要明顯長于BART6-3p低表達（Low)的患者（P = 0· 04)。
[0027] 圖8為在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡 核苷酸序列，BART6-3p在腫瘤細胞中的表達顯著升高，
[0028] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡核苷酸 序列后，實時熒光定量PCR方法檢測了腫瘤細胞中BART6-3p的表達情況，BART6-3p的表達 顯著升高。陰性對照（NC)為導(dǎo)入scramble序列。
[0029] 圖9為在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡 核苷酸序列后細胞的增殖能力降低，生長速度減慢。
[0030] 圖10為在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡 核苷酸序列后細胞迀移能力降低，
[0031] 細胞劃痕實驗證實，在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入 BART6-3p寡核苷酸序列，人為促進BART6-3p的表達后，腫瘤細胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀 移速度明顯減慢，劃痕愈合的時間延長，表明細胞運動迀移能力降低，陰性對照（NC)為導(dǎo) 入scramble序列。
[0032] 圖11為在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡 核苷酸序列后細胞的侵襲能力降低，
[0033] 細胞穿膜（transwell)實驗證實，在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細 胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡核苷酸序列，人為促進BART6-3p的表達后，能穿過基質(zhì)膠膜的腫 瘤細胞數(shù)目顯著減少，表明細胞侵襲能力降低，陰性對照（NC)為導(dǎo)入scramble序列。
[0034] 圖12為BART6-3p可下調(diào)細胞中IncRNA基因 L0C553103的表達，
[0035] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導(dǎo)入BART6-3p寡核苷酸 序列后實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)IncRNA基因 L0C553103的表達均顯著下調(diào)（P〈0. 05)。
[0036] 圖13為特異性針對Inc