一種泛三甲基化抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種泛三甲基化抗體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]賴氨酸可發(fā)生甲基化修飾，包括一，二，三甲基化修飾，過去的研究更多得是關(guān)注組蛋白的賴氨酸甲基化修飾。但是最近越來越多的證據(jù)表明，非組蛋白上的賴氨酸也可以發(fā)生甲基化修飾，并且這些甲基化修飾在疾病的發(fā)生與發(fā)展中也起著重要作用，因此鑒定非組蛋白上的賴氨酸甲基化修飾也顯得至關(guān)重要，這需要有效的方法富集甲基化的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，其中最主要的方法是用抗體富集。
[0003]目前，世界上還沒有特異性很好的泛三甲基化抗體。因此，研發(fā)新型的泛三甲基化抗體顯得至關(guān)重要。本發(fā)明采用一種全新的泛三甲基化抗體制備方式，并且用多個甲基化的組蛋白多肽進(jìn)行了驗(yàn)證，均發(fā)現(xiàn)了良好的特異性識別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種新型的泛三甲基化抗體及其制備方法，以解決目前沒有特異性識別三甲基化蛋白抗體的問題。
[0005]常規(guī)的抗體制備方法都是把抗原偶聯(lián)到載體蛋白，如牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin , BSA)或卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)或血藍(lán)蛋白(Keyhole LimpetHemocyanin, KLH)或牛甲狀腺球蛋白(Bovine Thyroglobulin, THY)，再以這個偶聯(lián)蛋白作為免疫底物免疫兔子得到抗體血清。本發(fā)明提供的新型的泛三甲基化抗體的制備方法，直接用多肽偶聯(lián)載體蛋白，如牛血清白蛋白或卵清蛋白或血藍(lán)蛋白或牛甲狀腺球蛋白，作為免疫抗原前提底物，用烷基化試劑(2-溴乙基)-三甲基溴化銨((2-&01110&1^1)trimethylammonium bromide))通過化學(xué)修飾的方法把載體蛋白中的半胱氨酸進(jìn)行燒基化修飾模擬成三甲基化修飾賴氨酸(記為Kc [me3])(如圖1)，再以這個富含模擬的三甲基化修飾賴氨酸的載體蛋白(Kc[me3])作為免疫抗原底物，免疫兔子，得到特異性識別三甲基化蛋白抗體。具體操作流程如下:
(1)稱取10-50mg載體蛋白溶解到烷基化試劑(其主要成分:4_羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、鹽酸狐(Guanidinium chloride)、L-甲硫氨酸(D/L-meth1nine));
(2)向上述載體蛋白溶液中加入1-1Omg二硫蘇糖醇(DTT)，進(jìn)行反應(yīng)；
(3)再加入1倍載體蛋白量(S卩100-1OOOmg)的(2-溴乙基)-三甲基溴化銨，進(jìn)行烷基化反應(yīng)；
(4)補(bǔ)加1-1Omg二硫蘇糖醇(DTT)，繼續(xù)避光烷基化反應(yīng)；
(5 )再加入20-1 OOuI 14.2M的巰基乙醇(BME)終止反應(yīng)，得到模擬三甲基化修飾的載體蛋白(Kc[me3])；
(6)取0.1-1mg經(jīng)上述步驟處理的載體蛋白(Kc[me3])免疫兔子，得到血清抗體，即泛三甲基化抗體。
[0006]用該泛三甲基化抗體與多個組蛋白甲基化修飾的多肽進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(Immunoprecipitat1n, IP)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(Western Blot, WB)檢測，結(jié)果顯示得到的血清抗體可以特異得識別三甲基化修飾的組蛋白多肽而幾乎不識別零甲基化，一甲基化或者二甲基化修飾的組蛋白多肽(如圖2和圖3)。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是該抗體可以特異地識別三甲基化修飾的組蛋白多肽，而對零甲基化修飾，一甲基化修飾和二甲基化修飾的組蛋白多肽幾乎不識別，如圖2和圖3所示。
[0008]同時，該泛三甲基化抗體也可以特異識別泛三甲基化修飾的非組蛋白。
【附圖說明】
[0009]圖1為烷基化試劑(2-溴乙基)_三甲基溴化銨烷基化修飾半胱氨酸得到模擬修飾的三甲基化修飾賴氨酸的原理。
[0010]圖2和圖3為免疫兔子得到的泛三甲基化抗體，用多個組蛋白修飾的多肽和與該泛三甲基化抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(IP)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測。結(jié)果顯示得到的血清抗體可以特異識別三甲基化修飾的組蛋白多肽，而幾乎不識別零甲基化，一甲基化或者二甲基化修飾的組蛋白多肽。
【具體實(shí)施方式】
[0011 ]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0012]實(shí)施例1
1:稱取1mg載體蛋白(牛血清白蛋白BSA)溶解到980ul烷基化試劑(1M 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，PH7.8; 4M鹽酸胍1mM L-甲硫氨酸);
2:加入20ul IM的二硫蘇糖醇(DTT)，37°C反應(yīng)I小時；
3:加入10mg (2-溴乙基)-三甲基溴化銨，50°C，避光進(jìn)行烷基化反應(yīng)2.5小時；
4:加入1ul IM的二硫蘇糖醇(DTT) ,50°C,繼續(xù)避光烷基化反應(yīng)2.5小時；
5:加入50ul 14.2M巰基乙醇(BME)終止反應(yīng)得到模擬三甲基化修飾的牛血清白蛋白BSA(Kc[me3])；
6:取0.5mg牛血清白蛋白BSA(Kc[me3])免疫兔子，每一個半月免疫一次，6個月后得到血清抗體免疫兔子得到血清抗體，即泛三甲基化抗體；
7:用該泛三甲基化抗體與多個組蛋白甲基化修飾的多肽進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(IP)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測，結(jié)果顯示，得到的泛三甲基化抗體可以特異得識別三甲基化修飾的組蛋白多肽而幾乎不識別零甲基化，一甲基化或者二甲基化修飾的組蛋白多肽(如圖2)。
[0013]實(shí)施例2
1:稱取1mg載體蛋白(血藍(lán)蛋白KLH)溶解到980ul烷基化試劑(1M 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，ΡΗ7.8; 4Μ鹽酸胍1mM L-甲硫氨酸);
2:加入20ul IM的二硫蘇糖醇(DTT)，37°C反應(yīng)I小時；
3:加入10mg (2-溴乙基)-三甲基溴化銨，50°C，避光進(jìn)行烷基化反應(yīng)2.5小時；
4:加入1ul IM的二硫蘇糖醇(DTT) ,50°C,繼續(xù)避光烷基化反應(yīng)2.5小時；
5:加入50ul 14.2M巰基乙醇(BME)終止反應(yīng)得到模擬三甲基化修飾的血藍(lán)蛋白KLH(Kc[me3])；
6:取0.5mg血藍(lán)蛋白KLH (Kc[me3])免疫兔子，每一個半月免疫一次，6個月后得到血清抗體免疫兔子得到血清抗體，即泛三甲基化抗體；
7:用該泛三甲基化抗體與多個組蛋白甲基化修飾的多肽進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(IP)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡(WB)檢測，結(jié)果顯示，得到的三甲基化抗體可以特異得識別三甲基化修飾的組蛋白多肽而幾乎不識別零甲基化，一甲基化或者二甲基化修飾的組蛋白多肽(如圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種泛三甲基化抗體的制備方法，其特征在于具體步驟為: 直接用免疫抗原偶聯(lián)載體蛋白，包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或牛甲狀腺球蛋白，作為免疫抗原前提底物，用烷基化試劑(2-溴乙基)-三甲基溴化銨通過化學(xué)修飾把載體蛋白中的半胱氨酸進(jìn)行烷基化修飾模擬成三甲基化修飾賴氨酸，記為Kc[me3]; 再以這個富含模擬的三甲基化修飾賴氨酸的載體蛋白Kc[me3]作為免疫抗原，免疫兔子，得到特異識別三甲基化蛋白的血清抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的泛三甲基化抗體的制備方法，其特征在于具體操作流程如下: (1)取10-50mg載體蛋白溶解到烷基化試劑中，烷基化試劑的主要成分為:4-羥乙基哌嗪乙磺酸、鹽酸胍、L-甲硫氨酸； (2)加入1-1Omg二硫蘇糖醇，進(jìn)行反應(yīng)； (3)加入10倍載體蛋白量的(2-溴乙基)-三甲基溴化銨，進(jìn)行烷基化反應(yīng)； (4)補(bǔ)加1-1Omg二硫蘇糖醇，繼續(xù)避光燒基化反應(yīng)； (5)加入20-100ul14.2M巰基乙醇終止反應(yīng)，得到模擬三甲基化修飾的載體蛋白Kc[me3]； (6 )取0.1-1mg載體蛋白Kc [me3 ]免疫兔子，得到血清抗體，即泛三甲基化抗體。3.由權(quán)利要求1或2所述制備方法得到的泛三甲基化抗體。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種泛三甲基化抗體及其制備方法。本發(fā)明直接用免疫抗原偶聯(lián)載體蛋白，如牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或牛甲狀腺球蛋白作為免疫抗原前提底物，用烷基化試劑(2?溴乙基)?三甲基溴化銨通過化學(xué)修飾的方法把前提底物中的半胱氨酸進(jìn)行烷基化修飾模擬成三甲基化修飾賴氨酸(Kc[me3])；再以這個載體蛋白Kc[me3]作為免疫抗原，免疫兔子，得到特異性識別三甲基化蛋白的血清抗體，即泛三甲基化抗體。用該泛三甲基化抗體與多個組蛋白甲基化修飾的多肽進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測，結(jié)果顯示，得到的血清抗體可以特異識別三甲基化修飾的組蛋白多肽而幾乎不識別零甲基化、一甲基化或者二甲基化修飾的組蛋白多肽。
【IPC分類】C07K16/18, C07K16/06
【公開號】CN105713090
【申請?zhí)枴緾N201610166901
【發(fā)明人】藍(lán)斐, 沈宏杰, 徐文綺
【申請人】復(fù)旦大學(xué)