一種穩(wěn)定的蛋白質載藥微粒系統(tǒng)制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明公開一種穩(wěn)定的蛋白質載藥微粒系統(tǒng)制備方法，可用于體內遞送藥物至病 灶部位而發(fā)揮藥效，屬于生物制藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 蛋白質載藥微粒系統(tǒng)用于遞送藥物是目前研究大熱點，通過體內相容性好蛋白質 遞送藥物至病灶部位，靶向至病灶緩慢釋放，可以延長藥物半衰期和降低藥物毒性，從而可 以提1?療效，降低藥物毒性。
[0003] 蛋白質微粒作為研究熱點，有眾多報道蛋白質微粒制備方法，包括熱交聯(lián)、化學交 聯(lián)、乳化法等。這些制備方法中典型代表為乳化高壓均質法，2005年上市紫杉醇白蛋白納米 粒（abraxane)是成功的代表，開創(chuàng)蛋白質微粒系統(tǒng)臨床治療的先河。Abraxane采用乳化高 壓均質法技術(美國專利US6749868, US5560933)，將白蛋白溶液、紫杉醇的乙醇溶液和三 氯甲烷混合形成乳液，然后使用高壓均質機進行制粒，接著高溫去除有機溶劑后再水化，即 可制備出紫杉醇白蛋白納米粒。該制備方法復雜，使用高壓均質和高溫等條件，容易造成蛋 白質變性，失去生物活性，也增大了成本，其次使用到三氯甲烷等毒性大溶劑，這無疑影響 到產品安全性。
[0004] CN201010247885. 7公開一種制備用于體內遞送藥理活性物質的蛋白納米粒的方 法，利用蛋白質在55-75°C左右打開蛋白質疏水性區(qū)域，而利用蛋白質二硫鍵打開再折疊自 組裝方法將藥物包埋蛋白納米粒中。但該方法需要在高溫55-75 °C左右反應，致使很多藥理 活性物質無法耐受高溫，比如紫杉醇在高溫下其7-表紫杉醇雜質會線性增大，從而影響產 品的質量。
[0005] 在現(xiàn)行制備方法中，基本都是根據(jù)蛋白質變性原理，采用高溫、高壓、化學變性物 質固化蛋白，實現(xiàn)蛋白質微粒系統(tǒng)的制備。然而無論是高壓、高溫、化學變性劑都使得產品 質量存在未知不安全因素。要么對蛋白質活性有損失，要么影響藥物和產品質量，均存在一 定缺陷。
【發(fā)明內容】
[0006] 本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的蛋白質載藥微粒系統(tǒng)制備方法，解決上述蛋白質微粒制備 時高溫、高壓或化學變性劑等缺陷，可在低溫、常壓和無化學變性劑的條件下利用橋梁劑溶 液方法制備成蛋白質載藥微粒系統(tǒng)，進一步保障蛋白質活性和蛋白質載藥微粒系統(tǒng)的產品 質量。同時應用這種制劑系統(tǒng)遞送藥物至體內而發(fā)揮藥效。本發(fā)明制備工藝簡單，適合產 業(yè)化。
[0007] 本發(fā)明提供一種穩(wěn)定的蛋白質載藥微粒系統(tǒng)制備方法，其利用橋梁劑將含藥物的 有機相和含蛋白質的水相溶液混合成均相溶液；來實現(xiàn)蛋白質載藥微粒系統(tǒng)的制備，其具 體步驟如下： 1)用有機溶劑溶解藥物，形成含藥有機相； 2) 將蛋白質溶于水或緩沖體系中制備成l(T500mg/ml的蛋白質的水相溶液； 3) 在步驟1)中加入P/Γ飽和的橋梁劑溶液混勻，然后將2)中蛋白質水相溶液加入， 混勻成均相溶液； 4) 在(T80°C條件下，將步驟3)中形成均相溶液直接冷凍干燥制備成凍干粉針，采用5% 葡萄糖或生理鹽水等配伍稀釋，即形成穩(wěn)定的蛋白質載藥微粒系統(tǒng)； 或將步驟3)中均相溶液直接使用水或5%葡萄糖、生理鹽水、緩沖鹽體系進行稀釋，形 成穩(wěn)定的蛋白質載藥微粒系統(tǒng)； 所述橋梁劑為鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，碳酸鹽中任意一種。
[0008] 本發(fā)明所述的橋梁劑優(yōu)選氯化鈉，硫酸銨，氯化鉀，硫酸鈉，硫酸鎂，磷酸鈉，磷酸 鉀，磷酸二氫鈉，碳酸鈉。
[0009] 本發(fā)明核心技術為通過橋梁劑將含藥物有機相與蛋白質水相溶液混勻成均相溶 液來制備蛋白質載藥微粒系統(tǒng)，其所述的橋梁劑為鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，碳酸鹽。優(yōu)選氯 化鈉，硫酸銨，氯化鉀，硫酸鈉，硫酸鎂，磷酸鈉，磷酸鉀，磷酸二氫鈉，碳酸鈉。更優(yōu)選氯化 鈉。
[0010] 本發(fā)明的制備方法中步驟1)所述有機溶劑為醇類，酮類，酰胺類或亞砜類，優(yōu)選乙 醇、叔丁醇、丙酮、N，N-二甲基乙酰胺、二甲亞砜。
[0011] 本技術方案制備方法中步驟2)所述蛋白質為白蛋白，血紅蛋白，肌紅蛋白，溶菌 酶，免疫球蛋白，轉鐵蛋白，球蛋白，股原蛋白。優(yōu)選為人血白蛋白。
[0012] 本技術方案所述在于步驟4)所述稀釋的倍數(shù)為1~500倍，優(yōu)選為10-50倍。
[0013] 本發(fā)明提供一種穩(wěn)定蛋白質載藥微粒系統(tǒng)制備方法，其特征在于：所述包載藥物 為抗腫瘤藥物，優(yōu)選紫杉醇，多烯紫杉醇，卡巴他賽，阿霉素，替西羅莫司，西羅莫司，絲裂霉 素，羅米地辛，SN38,順鉬及其衍生物，伊立替康、拓撲替康、埃博霉素，伊沙匹龍，硼替佐米。 更優(yōu)選為紫杉醇。
[0014] 本發(fā)明所述蛋白質穩(wěn)定微粒系統(tǒng)的平均粒徑為IOnnTlO μ m，優(yōu)選為50nnT500nm, 最優(yōu)選為50nm?250nm。
[0015] 本發(fā)明進一步公開一種穩(wěn)定的人血白蛋白載地西他濱微粒系統(tǒng)制備方法，包括以 下步驟：首先用二甲亞砜溶解地西他濱，然后在有機相中加入1~15%氯化鈉溶液，混合均勻 后，加入l(T500mg/ml pH 7~8人血白蛋白緩沖液，混勻為均相溶液后，分裝，凍干，臨床使 用時采用5%葡萄糖或生理鹽水等稀釋劑配伍稀釋成穩(wěn)定的蛋白質載地西他濱微粒系統(tǒng)。
[0016] 本發(fā)明還公開了一種穩(wěn)定的人血白蛋白載紫杉醇微粒系統(tǒng)制備方法，包括以下步 驟：首先用無水乙醇溶解紫杉醇，然后在有機相中加入1%~飽和氯化鈉溶液，混合均勻后， 加入l(T500mg/ml白蛋白水溶液，混勻為均相溶液后，稀釋到ΚΓ50倍的(T70°C注射用水 中，人血白蛋白快速包埋紫杉醇形成人血白蛋白載紫杉醇微粒系統(tǒng)。
[0017] 本發(fā)明的穩(wěn)定蛋白質載藥微粒系統(tǒng)在臨床使用時可采用生理鹽水、葡糖糖溶液等 配伍稀釋后直接注射或靜脈滴注給藥。
[0018] 本發(fā)明的積極效果在于：制備方法工藝簡單，條件溫和，適合產業(yè)化，克服現(xiàn)有制 備方法中使用高溫、高壓或化學交聯(lián)劑等缺點，可在溫和條件下，利用橋梁劑溶液將含藥物 的有機相和含蛋白質的水相溶液混合成均相溶液；來制備穩(wěn)定蛋白質載藥微粒系統(tǒng)。
[0019] 本發(fā)明制備穩(wěn)定蛋白質載藥微粒系統(tǒng)還可以使用超濾洗滌濃縮裝置，致使微粒系 統(tǒng)更適宜產業(yè)化，同時通過除水步驟制備成藥物制劑，進一步增大蛋白質穩(wěn)定微粒系統(tǒng)的 穩(wěn)定性和實用性，方便使用，存儲和運輸。
【附圖說明】
[0020] 圖1、人血白蛋白載絲裂霉素微粒系統(tǒng)的粒徑分布結果。
[0021] 圖2、人血白蛋白載紫杉醇微粒系統(tǒng)的粒徑分布結果。
[0022] 圖3、人血白蛋白載紫杉醇微粒復溶后溶液照片。
[0023] 圖4、橋梁劑在含藥有機相和人血白蛋白水相中作用驗證。
【具體實施方式】
[0024] 以下通過實施例來進一步說明本發(fā)明，必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本 發(fā)明，而不應理解為對本發(fā)明的限制。
[0025] 實施例1 將IOmg絲裂霉素溶于Iml N，N-二甲基乙酰胺中，然后加入5%氯化鈉溶液Iml混合 均勻，最后加入用pH 7. 8磷酸鹽緩沖液溶解成20%人血清白蛋白溶液2ml，形成均相溶液。 在〇°C下，將該均相溶液直接凍干成粉針制劑，最后粉針成品采用生理鹽水稀釋，采用馬爾 文粒度分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定載藥量。結果顯示人血白蛋白載絲裂霉素微粒系 統(tǒng)平均粒徑為290. 9nm，粒徑及其粒徑分布圖見圖1。微粒載藥量達2. 1%。
[0026] 實施例2 將Img硼替佐米溶于Iml叔丁醇中，然后加入2%氯化鈉溶液0. 5ml混合均勻，最后加 入2%牛血清白蛋白溶液0. 5ml，形成均相溶液。在室溫下，將該均相溶液直接凍干成粉針制 齊U，最后粉針成品采用生理鹽水稀釋，采用馬爾文粒度分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定微 粒載藥量，結果表明制備微粒系統(tǒng)平均粒徑為164nm，微粒載藥量達7. 8%。
[0027] 實施例3 將IOmg地西他濱溶于Iml二甲亞砜中，然后加入1%磷酸鈉溶液Iml混合均勻，最后 加入用pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解成50%牛血清白蛋白溶液0.4ml，形成均相溶液。在室溫 下，將該均相溶液直接凍干成粉針制劑，最后粉針成品采用生理鹽水稀釋，采用馬爾文粒度 分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定微粒載藥量，結果表明制備微粒系統(tǒng)平均粒徑為264nm， 微粒載藥量達4. 1%。
[0028] 實施例4 將40mg紫杉醇溶于4ml乙醇中，然后加入12. 5%氯化鈉溶液2ml混合均勻，最后加入 10%人血白蛋白溶液I. 0ml，形成均相溶液。將該均相溶液在40°C下使用注射用水稀釋100 倍，得到淡藍色澄清溶液。采用馬爾文粒度分析儀ZS90測定粒徑和HPLC測定微粒載藥量， 實驗結果表明制備微粒系統(tǒng)平均粒徑為102nm，粒分布徑圖譜見圖2,微粒載藥量達18. 4%。 同時將該溶液超濾濃縮后，分裝，凍干，凍干后復溶溶液稀釋不同濃度圖片見圖3 :a.為人 血白蛋白載紫杉醇微粒復溶后濃度〇. 2mg/ml溶液照片；b.為人血白蛋白載紫杉醇微粒復 溶后濃度〇. 5mg/ml溶液照片；c.為人血白蛋白載紫杉醇微粒復溶后濃度2mg/ml溶液照 片。
[0029] 實施例5 將6mg紫杉醇溶于2ml甲醇中，然后加入10%氯化鉀溶