專利名稱：一種測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法，尤其涉及測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
細(xì)胞色素P450 (CYP450)是藥物在體內(nèi)代謝重要的酶系，在藥物代謝和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中起重要作用，主要存在于肝、腸等器官的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。CYP3A作為肝臟CYP家族中主要的亞型，許多外源性和內(nèi)源性物質(zhì)都要經(jīng)過(guò)其代謝，臨床上使用的藥物，約有60%經(jīng)過(guò)CYP3A的代謝，如紅霉素、酮康唑以及他汀類(lèi)藥物。研究表明，一些藥物與天然產(chǎn)物存在著相互作用，如葡萄柚汁能抑制CYP3A的活性，使得經(jīng)過(guò)CYP3A代謝的藥物的生物利用度提高。 因此，CYP3A酶的活性對(duì)了解藥物代謝及相互作用十分重要。咪達(dá)唑侖(MDZ)作為CYP3A的探針?biāo)?，廣泛地用于體內(nèi)外的研究，I-羥基咪達(dá)唑侖(1-0HMDZ)是其主要的代謝產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)定咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物含量，計(jì)算代謝率可以推測(cè)評(píng)價(jià)CYP3A酶的活性。目前，由于高效液相色譜法具有高效、快速和靈敏的特點(diǎn)，因而廣泛用于測(cè)定咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物的濃度。如趙娜萍等(HPLC法測(cè)定大鼠血漿中咪達(dá)唑侖的含量及其在藥物相互作用研究中的應(yīng)用，藥物分析雜志，2007年第27期)以ー定比例的磷酸鹽緩沖液和甲醇作為流動(dòng)相，該含磷酸鹽緩沖液的流動(dòng)相配制繁瑣，而且磷酸鹽緩沖液易析出，磷酸鹽對(duì)儀器和柱子有一定的損害，其采用外標(biāo)檢測(cè)法，操作誤差會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成較大的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可同時(shí)測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物I-羥基咪達(dá)唑侖濃度的方法，從而應(yīng)用于CYP3A酶活性的評(píng)價(jià)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，包括如下步驟I)樣品預(yù)處理取大鼠肝微粒體加入咪達(dá)唑侖進(jìn)行體外孵育，加入含內(nèi)標(biāo)物卡馬西平的こ腈溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液20 μ L進(jìn)樣；2)色譜柱分離采用通用型C18色譜柱，填料為Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為水-こ腈-O. I %三氟こ酸的混合液，該混合液的體積比為44 54 26 36 15 25 ;3)紫外檢測(cè)采用ニ極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm,流速為I. OmL · mirT1,柱溫為40°C,測(cè)定峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物的濃度。所述的代謝產(chǎn)物為I-羥基咪達(dá)唑侖。在步驟(2)所述的色譜條件下，I-羥基咪達(dá)唑侖、咪達(dá)唑侖以及內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間分別為3 4min、4 5min、7 8min。
采用本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)樣本預(yù)處理采用こ腈沉淀法直接處理樣品，省略了提取的步驟，快速簡(jiǎn)易，蛋白沉淀效果好，而且能很好地終止微粒體的反應(yīng)，適合體外孵育實(shí)驗(yàn)。(2)流動(dòng)相選用水-こ臆-O. I %三氟こ酸的混合液作為流動(dòng)相，離子對(duì)試劑三氟こ酸的使用可改善I-羥基咪達(dá)唑侖、咪達(dá)唑侖以及卡馬西平色譜峰峰形不對(duì)稱、峰展寬和拖尾現(xiàn)象，取得了良好的分離效果，理論塔板數(shù)達(dá)到10000以上，可同時(shí)檢測(cè)咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物的濃度。(3)內(nèi)標(biāo)法使用卡馬西平為內(nèi)標(biāo)，減少了操作誤差對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的影響，卡馬西平的保留時(shí)間在7 8min左右，每個(gè)樣本的分析時(shí)間在9分鐘以內(nèi)。本發(fā)明的樣本處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏快速，對(duì)肝微粒體中咪達(dá)唑侖和I-羥基咪達(dá)唑侖的濃度可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可以應(yīng)用于CYP3A酶活性的評(píng)價(jià)研究。本發(fā)明中咪達(dá)唑侖的線 性范圍為O. 06 12μ g · mじ1，ト羥基咪達(dá)唑侖的線性范圍為O. 06 3μ g · mじ1，提取回收率在95%以上，日內(nèi)日間精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。


圖I為咪達(dá)唑侖肝微粒體孵育后樣本的色譜圖。其中，I為I-羥基咪達(dá)唑侖，2為咪達(dá)唑侖，3為卡馬西平(內(nèi)標(biāo)物)。
具體實(shí)施例方式色譜條件色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 (4. 6mm x 150mm 5 μ m);保護(hù)柱為SB-C18 (4.6X12. 5mm，5 μ m，Agilent, USA);流動(dòng)相為水-こ腈-O. I %三氟こ酸的混合液，該混合液的體積比為49 : 31 : 20，流速為I. Oml · mirT1 ;進(jìn)樣量為20 μ L ;檢測(cè)器為ニ極管陣列檢測(cè)器(DAD);柱溫為40°C ;檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。肝微粒體制備采用差速離心法制備肝微粒體。將大鼠斷頭處死，迅速取出肝臟，用冰冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干后稱重，每IOg肝臟加入25mL蔗糖PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)，在冰浴中充分勻漿。取勻漿液10，OOOg離心15min，取上清液再次10，OOOg離心15min，取上清，100, OOOg離心90min ;棄上清液，沉淀用IOmL的PBS復(fù)溶，_80°C分裝保存，以上所有操作在低于4°C環(huán)境中進(jìn)行。用BCA法(雙辛可寧酸法)測(cè)定微粒體蛋白含量為20mg · mL 1 ο肝微粒體體外孵育及樣品的處理吸取微粒體10 μ L于I. 5mL的EP管，加入MDZ標(biāo)準(zhǔn)液25 μ L和PBS緩沖液215 μ L，于37°C水浴預(yù)孵育5min后，加入20mMNADPH 10 μ L啟動(dòng)反應(yīng)，繼續(xù)孵育5min后,置于碎冰中，加入200 μ L的こ腈以終止反應(yīng)。再加入5 μ g ·ηιじ1的卡馬西平內(nèi)標(biāo)工作液，潤(rùn)旋混勻2min后13，OOOrpm離心IOmin,取上清液于自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣瓶中，設(shè)定20yL進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制MDZ 濃度分另Ij 為 O. 06,0. 12,0. 3,0. 6、I. 2、3、6、12μ g · mじ1 和1-0HMDZ濃度為O. 06,0. 12,0. 2,0. 3,0. 6、I. 2、2、3 μ g · mじ1的微粒體孵育體系，按上述樣品的處理方法操作，測(cè)定對(duì)MDZ面積As1U-OHMDZ面積As2、內(nèi)標(biāo)峰面積Ai。以As1Ai為縱坐標(biāo)(Y1)，以MDZ對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)(X1)繪制MDZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以ksjki為縱坐標(biāo)(y2)，以1-0HMDZ對(duì)應(yīng)各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)(X2)繪制1-0HMDZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線。MDZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為W = O. 9157x「0. 1157 (r = O. 9996) ；I-OHMDZ的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y2 =I. 2251χ2-0· 0691 (r = O. 9996)。提取回收率配制低、中、高三種濃度(MDZ濃度為O. 12，O. 6,6. OOyg-mじ1和1-0HMDZ濃度為O. 12，O. 3，2. 00 μ g · mじ1)微粒體孵育體系，每種濃度6份，處理后檢測(cè)，記錄MDZ和1-0HMDZ的峰面積，為微粒體孵育體系的峰面積。另取I. 5mL EP管6支，兩個(gè)ー組；每組配制成終濃度與低、中、高三種濃度(MDZ濃度為O. 12，O. 6,6. OOyg-mじ1和1-0HMDZ濃度為O. 12,0. 3,2. 00 μ g · πιΓ1)相同的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，20 μ L進(jìn)樣檢測(cè)；記錄不同濃度MDZ和1-0HMDZ的峰面積，為純標(biāo)的峰面積。計(jì)算微粒體孵育體系的峰面積與純標(biāo)的峰面積的比值，即為提取回收率，見(jiàn)表I。表I肝微粒體孵育體系MDZ和1-0HMDZ的提取回收率結(jié)果(η = 6，mean土SD)
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，其特征在于包括如下步驟 1)樣品預(yù)處理 取大鼠肝微粒體加入咪達(dá)唑侖進(jìn)行體外孵育，加入含內(nèi)標(biāo)物卡馬西平的有機(jī)溶劑進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀，離心后取上清液20 y L進(jìn)樣； 2)色譜柱分離 采用通用型C18色譜柱，填料為Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為水-乙腈-0. I %三氟乙酸的混合液,該混合液的體積比為44 54 : 26 36 : 15 25 ; 3)紫外檢測(cè) 采用二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為I. OmL mirT1，柱溫為40°C，測(cè)定峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，其特征在于所述的代謝產(chǎn)物為I-羥基咪達(dá)唑侖。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，其特征在于所述步驟(I)中的有機(jī)溶劑為乙腈。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，其特征在于在步驟(2)所述的色譜條件下，代謝產(chǎn)物I-羥基咪達(dá)唑侖、咪達(dá)唑侖以及內(nèi)標(biāo)卡馬西平的保留時(shí)間分別為3 4min、4 5min、7 8min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定肝微粒體中咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物濃度的方法，包括如下步驟1)樣品預(yù)處理；2)色譜柱分離采用通用型C18色譜柱，填料為Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為水-乙腈-0.1％三氟乙酸的混合液，該混合液的體積比為44～54∶26～36∶15～25；3)紫外檢測(cè)采用二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，流速為1.0mL·min-1，柱溫為40℃，測(cè)定峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算咪達(dá)唑侖及其代謝產(chǎn)物的濃度。本發(fā)明的樣本處理簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏快速，對(duì)肝微粒體中咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖的濃度可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，可以應(yīng)用于CYP3A酶活性的評(píng)價(jià)研究。本發(fā)明中咪達(dá)唑侖的線性范圍為0.06～12μg·mL-1，1-羥基咪達(dá)唑侖的線性范圍為0.06～3μg·mL-1，提取回收率在95％以上，日內(nèi)日間精密度標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10％。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102706972SQ20121001165
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者徐濤, 王勇, 王哲, 胡國(guó)新, 邱相君 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)