專利名稱：：用于抑制、控制和消退血管生成的含有透明質酸和nsaid的組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及血管生成的抑制、控制和消退，并找到在癌癥治療方面抑制血管生成的一種特殊的應用，例如作為已知的癌癥治療時防止轉移的一種輔藥。在SandraBlakeslee的標題為“Solidcoresoftumorskeepingoutbestdrugs”的文章中，(由theGlobe和Mail于1989年7月8日出版Toronto(多倫多)Ontario)，Blakeslee女士認為越來越多的研究人員相信，對固體瘤結構的基本錯誤的理解會使得研究人員設計那些注定在許多病人身上失敗的癌癥藥物。她引用Dr.Herberman，DirectorofthePittsburghCancerCenter(匹滋堡癌癥中心的主任)的話說，數(shù)十年來癌癥研究人員簡單地開發(fā)藥物，將它們送入血流并假定它們被帶至腫瘤中，幾乎沒有考慮藥物在一旦到達腫瘤時將如何分布。她的文章還指出根據(jù)Dr.JudahFolkman，theHarvardMedicalSchool的血液生長因子的領頭研究者，長時間以來，醫(yī)生們被告誠瘤的生長速度超出血液供應能力。根據(jù)該文章，這一告誡是不正確的。瘤壓抑了它們的血液供應。這一壓抑作用使得給藥更困難。該文章進一步指出，大多數(shù)人們認為瘤只不過是癌細胞的聚集體。根據(jù)另一研究者Dr.Jain，事實上瘤僅僅是具有50％的細胞。另一半是血管和小間隙。他說，瘤中的小間隙象填塞在盒子中的大理石之間的空隙。該文章進一步指出，不管生物制劑如何混合和施用，它們必須穿過血管壁，然后穿過小間隙到達它們的目的地—癌細胞。該文章繼續(xù)指出，每一只瘤是不同的且每一只當中有不同的區(qū)域。尤其是，瘤在生長時天天變化并重新調整各部分結構。瘤內部的大部分血管在它們曲折迂回和生長成鄰近血管的特殊附屬物時受到高度破壞。Dr.Jain指出，一般情況，隨著瘤生長，它的外部區(qū)域會從周圍正常組織充實新的血管。(瘤需要血液供應來生長；次生腫瘤也需要血液供應來發(fā)展)。瘤本身也會形成幾根異常的血管。當瘤在受限制空間生長時，其中心附近的許多扭曲的血管會擠破。它們附近的瘤細胞似乎會一個個地死去，盡管將它們移植到其它動物身上，它們會生長成活性癌。在這些壞死的區(qū)域會積累起高壓。血管和在小間隙中的液體血漿受擠壓。因而，這一壓力會阻止血載分子(包括氧分子)進入瘤中心區(qū)域。Dr.Jain認為，在正常組織中壓力是不均勻的，這樣，大分子如抗體能夠通過壓力差引發(fā)的對流到達它的目標。Dr.Jain認為，分子還可以通過擴散而遷移，這類似于一滴墨水在水中的蔓延。但他指出，他曾測過抗體在瘤中的擴散速度，發(fā)現(xiàn)此類大分子需花費數(shù)天、數(shù)星期或數(shù)月才能在瘤中通過擴散達到均勻的濃度。那么，對于治療來說太遲而無濟于事。EP0295092中記載，載體與透明質酸的片段一起將該透明質酸的片段輸送至皮膚，到達皮膚的真皮層，促進血管的發(fā)展以刺激毛發(fā)生長或再生。優(yōu)選的透明質酸片段是含有7—25個單糖單元的多糖。該專利指出很明顯，透明質酸的片段越大，將該片段輸送到皮膚的真皮層的困難越大，除非在該組合物中存在增強該片段活性的某種物質。該混合物因而可能包括一種用來增強透明質酸片段的活性的物質，尤其在局部施用之后改進它們透過皮膚的能力。據(jù)說一些活性增強劑也可用作透明質酸片段的載體。據(jù)說一些活性增強劑具有刺激或加速毛發(fā)生長的能力。長壓定也被認為在這類活性增強劑之中。因些，透明質酸和長壓定(兩者都由載體輸送)，據(jù)說都能刺激毛發(fā)生長。曾作過廣泛的研究，探明免疫功能具有允許瘤細胞發(fā)展的缺陷。最初由Jerne，隨后由Burnett推斷，免疫系統(tǒng)的主要作用是免疫監(jiān)視并破壞異常細胞。監(jiān)視的概念，多少有點簡單，保留了存在于高級動物—哺乳動物體內的免疫識別和功能完善機制之可接受的概念。曾有人假定，腫瘤發(fā)展是因為局部或普遍的免疫抑制。然而，正如Moller所指出的，如果發(fā)生普遍的免疫抑制，這僅僅是發(fā)展了某種類型的腫瘤紊亂，主要是淋巴網(wǎng)狀內皮細胞(lymphoreticular)系統(tǒng)的那些。這一觀察結果是正確的并代表了對免疫監(jiān)視理論的主要挑戰(zhàn)，除非能給出特定的理由為什么單個癌細胞能發(fā)展和單獨地逃脫免疫系統(tǒng)。在1974年的實驗表明，巨噬細胞功能的缺陷可能存在于腫瘤疾病中。最初的實驗發(fā)現(xiàn)，抑制細胞是免疫系統(tǒng)中的一部分；這些是巨噬細胞系統(tǒng)的T—細胞類型的一種。據(jù)證明(它們)在瘤形成、慢性細菌感染、大創(chuàng)傷的恢復和慢性真菌感染過程中就存在。在實驗動物身上已反復證明，巨噬細胞功能在腫瘤疾病中會變化。動物各系統(tǒng)中的巨噬細胞在功能上似乎是“被阻滯(blocked)”了。一般說來，當從體內環(huán)境取出、在鹽水中洗滌和加以培養(yǎng)時，它們表現(xiàn)正常。這一阻滯現(xiàn)象據(jù)探明與由腫瘤組織或由巨噬細胞本身過多地產(chǎn)生前列腺素有關。在70年代末和80年代初進行的基礎研究中，關于免疫療法對癌應起什么作用，存在明顯的混淆。巨噬細胞的活化或“hyping”被認為是十分重要的。然而，在Romans和Falk對于從患有腫瘤疾病的病人取得的腹膜巨噬細胞的調查中，有一個確切的證據(jù)這些早已活化的巨噬細胞仍然與癌細胞共存并且沒有引起它們破壞。在今年的早期，幾個獨立的調查人員已探明巨噬細胞的機能障礙或假定的阻滯歸因于過多的前列腺素，以及這種情況可在皮質類固醇、ASA和非甾體類抗炎藥(即消炎痛和萘普生(NaprosynTM))的組織培養(yǎng)中發(fā)生變化。再一次在動物腫瘤中反復證明。這些物質能夠改變對腫瘤細胞的反應，以及這些物質與免疫增強劑一起使用的各種混合物能夠在消除實驗腫瘤方面取得極其可靠的成功。Lala與同事們將消炎痛治療與白細胞介素2并用，并表明能治愈實驗腫瘤。在體內試驗中，在具體的人體內使用任何這類藥劑將會遇到其它問題。所有的非甾體消炎藥劑(NSAID)都會在胃腸、神經(jīng)系統(tǒng)和其它部位產(chǎn)生主要的毒性。因些，目前解決辦法的基礎是在一般的情況下將這些藥劑以足夠的量用于人體疾病，藥物將穿透任何患病組織，以治療方式改變局部前列腺素的產(chǎn)生。靜脈制劑有消炎痛和目前的其它藥劑，我們的實驗數(shù)據(jù)是令人信服的單獨使用這些藥劑會在受試驗的人的體內產(chǎn)生抑制副作用。因此，僅將不足夠的量送入人體全身所起的反應不只是在腫瘤中的偶然反應。新血管的形成對于腫瘤和慢性發(fā)炎肉芽腫的組織(如在類風濕性關節(jié)炎中關節(jié)翳)的發(fā)展是十分重要的。在此類疾病狀態(tài)下血管生成的限制是限制組織生長的有效治療目標。視網(wǎng)膜下新血管的形成是今天西方社會的主要眼科問題。百分數(shù)很少的病人用激光光致凝結技術治療，當視網(wǎng)膜下新血管在視網(wǎng)膜下從眼睛的中脈絡膜層生長時，損壞黃斑視覺或清晰視覺。然而大多數(shù)血管過分靠近中央進行生長，激光灼燒會損壞任何潛在中央視覺。α—干擾素一周注射三次也被建議用來治療視網(wǎng)膜下新血管生成。然而，在年紀較大的人身上注射會帶來非常明顯的副作用，對療程有害。另外，退一步說，從新近制成的制劑安排注射的后勤保證是非常困難的。在患關節(jié)炎處，會發(fā)展關節(jié)翳。為了讓關節(jié)翳發(fā)展，當關節(jié)翳發(fā)展時血管生成過程必須存在，血管生成過程伴隨著角膜上皮下方的矯正組織的沉積。一種結果是結締組織在動關節(jié)的關節(jié)表面上快速生長。申請人現(xiàn)已開發(fā)了一些方法和適用的組合物，用來抑制血管生成(血管形成和分化)，它發(fā)現(xiàn)在眾多用途中有兩個用途是用來治療腫瘤和作為抑制癌的次生腫癌的任何癌癥治療的輔助藥物。申請人還開發(fā)了適用于消退血管生成(消退血管生長)的新方法和新組合物。申請人的發(fā)明還可用來治療其它疾病和病癥，這一成功的治療得益于抑制、控制和/或消退血管生長(例如視網(wǎng)膜下新血管的形成)及減輕關節(jié)炎病情。如果某人易患關節(jié)炎，系統(tǒng)地施用(例如靜脈內注射施用)根據(jù)本申請人的發(fā)明的藥物組合物甚至可以防止關節(jié)炎發(fā)生或至少減輕關節(jié)炎病情。因而本發(fā)明的目的是提供一種抑制、控制和消退血管生成的方法，一種用于抑制、控制和消退血管生成的組合物以及此類組合物用來抑制、控制和消退血管生成的用途。本發(fā)明的進一步的和其它的目的將會由本
技術領域：
中那些熟練人員從本發(fā)明的以下概述和其實施方案的詳細敘述中體會到。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種抑制、控制和/或消退哺乳動物(例如人)體內血管生成(例如抑制惡性腫瘤的血管生長，孤立惡性腫瘤的血管生長或發(fā)展)的方法，該方法包括以下步驟通常以常規(guī)方式經(jīng)幾個星期或幾個月向需要抑制、控制和/或消退血管生成的哺乳動物體上/內的部位施用有效劑量的用來抑制、控制和/或消退血管生成的藥物組合物，每一有效劑量的組合物包括(均勻混合物形式的)有效無毒劑量的NSAID(非甾體類消炎藥)例如二氯苯胺苯乙酸(例如溶于組合物中)和有效無毒劑量的透明質酸和/或其鹽(例如透明質酸鈉)和/或透明質酸(優(yōu)選透明質酸鈉)的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯類、片段和/或透明質酸的亞單元。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，該組合物可以系統(tǒng)地(例如靜脈內注射、動脈內注射、腹膜內注射、胸膜內注射、直接注射到例如腫瘤中等等)施用以及可以用作任何癌癥治療的輔助藥。當NSAID，例如消炎痛(溶于N—甲基還原葡糖胺)、萘普生、Ketorotac的(+/-)三甲醇氨基甲烷鹽類、布洛芬、炎痛喜康、丙酸衍生物、乙酰水楊酸、氟尼克辛、二氯苯胺苯乙酸、二氯苯胺苯乙酸鈉或其它的NSAID與200mg以上的一種形式的透明質酸(例如200—1,000mg的透明質酸鈉)一起施用時，對于70kg的人施用有效量的NSAID(在一種情況下是二氯苯胺苯乙酸)，沒有發(fā)生大的毒性副作用，如胃腸痛苦、神經(jīng)系統(tǒng)異常、抑郁癥等，甚至在更高NSAID(如果需要的話)用量的情況下也是如此。如果透明質酸的用量降至那一用量以下，則開始發(fā)生副作用。根據(jù)另一實施方案，該組合物還可以皮內注射施用，局部使用以輸送入皮膚內，或直腸施用或者涂在膠布片上然后貼在病人皮膚上。不管以什么途徑施用，其形式是一種均相組合物，不論是用于系統(tǒng)施用的含有無菌水的溶液，還是用于局部施用的乳劑、洗劑或凝膠制劑。不管什么樣的組合物，它都可包裝在適當?shù)娜萜髦?靜脈輸液袋、注射用小玻璃瓶、裝乳劑的藥管或大口瓶)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，一種形式的透明質酸(例如透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和/或亞單元)(例如透明質酸鈉)和非類固醇消炎藥(NSAID)例如二氯苯胺苯乙酸鈉的混合物的用途是用來抑制、控制和/或消退血管生成。在此類用途中，有效且無毒劑量的一種形式的透明質酸(例如透明質酸鈉)和NSAID(例如二氯苯胺苯乙酸鈉)的混合物可用來抑制、控制和消退血管生成。因此，包括有效無毒劑量的透明質酸鈉和用于治療的有效無毒劑量的NSAID(例如二氯苯胺苯乙酸鈉)的有效無毒劑量的組合物可用來抑制血管生成。NSAID(例如二氯苯胺苯乙酸)的系統(tǒng)施用量可以是大約15—大約100mgNSAID，例如35mg/70kg人(1/2mg/kg)。NSAID可以較大量施用，只要這一用量無毒，例如420mg/70kg人(6mg/kg)。當系統(tǒng)地(例如注射等)施用NSAID時，對于一種形式的透明質酸的建議用量是，約每15mgNSAID，可使用約50mg的一種形式的透明質酸(例如透明質酸鈉)。對于局部使用，在某一劑量中，一種形式的透明質酸鈉的量可以多于約5—10mg/cm2皮膚或暴露組織(將該劑量的組合物施用于它們)。在每一劑量中，一種形式的透明質酸，例如透明質酸鈉也可多于約5—10mg/cm2。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，一種藥物組合物(適合于系統(tǒng)施用和/或局部使用在皮膚上，直腸內，在粘膜上等)(例如供局部使用的克數(shù)量級(multigram)藥物組合物)被提供來有效地抑制、控制和消退血管生成，含有多個劑量的藥物組合物用來抑制、控制和消退血管生成，每一該劑量包括治療有效的無毒(對病人)劑量的NSAID(例如二氯苯胺苯乙酸)和有效無毒劑量的透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和/或亞單元，并能有效地抑制、控制和消退血管生成。該藥物組合物可包括與施用途徑有關的合適賦形劑例如無菌水(系統(tǒng)施用)，用來制造凝膠制劑、洗滌或乳劑(局部施用)的賦形劑或不管途徑是什么的賦形劑(例如增溶劑(如甲氧基聚乙二醇350)和防腐劑如芐醇)。根據(jù)本發(fā)明的又一另外方面，一定劑量的藥物組合物用來抑制、控制和消退血管生成，該組合物包括(1)非甾體類抗炎藥(NSAID)，例如二氯苯胺苯乙酸鈉；(2)透明質酸和/或其鹽(例如透明質酸鈉)和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和亞單元；其特征在于該組合物(a)屬于適合施用(系統(tǒng)方式或局部方式等)的劑量形式(例如乳劑、洗劑、凝膠制劑、靜脈注射溶液、注射液等等)；(b)其用量和形式能使得組分(1)以有效劑量與組分(2)一起用來抑制、控制和消退血管生成(例如它抑制次生腫瘤)。該藥物組合物可包括多個劑量。根據(jù)本發(fā)明再一另外方面，提供了(1)非甾體類抗炎藥(NSAID)，例如二氯苯胺苯乙酸鈉；(2)透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和亞單元，在制造用于抑制、控制和消退哺乳動物(例如人)體內血管生成的藥物組合物方面的用途，其中劑量取自該組合物，且每一取出的劑量包括治療有效的無毒劑量的每一種組分(1)和(2)，以抑制、控制和消退血管生成。包含某形式的透明質酸和NSAID的組合物比只包含(沒有NSAID)某種形式的透明質酸(例如透明質酸鈉)的組合物具有更大的抑制、控制和消退血管生成的作用(明顯更大的抑制、控制和消退作用)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，申請人提供了類似的治療方法、藥物組合物、劑量和用途，該組合物包含各種形式的透明質酸(例如分子量低于約750,000道爾頓的透明質酸鈉)且不含NSAIDS，這與各種形式的透明質酸和NSAIDS一起使用時的做法相同。每劑量中某形式的透明質酸(例如透明質酸鈉)的量可以從人體施用的約5mg至約1,000mg/70kg人，這取決于施用途徑，例如局部施用(5mg/cm2皮膚或暴露組織)。由于沒有毒性，透明質酸某形式能以劑量明顯過量(例如，如果系統(tǒng)施用的話，3000mg/70kg人)的方式施用，而沒有任何不良作用。希望系統(tǒng)施用的透明質酸某形式(例如透明質酸鈉)的量是每15mgNSAID約50mg。優(yōu)選所施用的透明質酸某形式(例如透明質酸鈉)的分子量低于約750,000道爾頓(例如約150,000—約225,000道爾頓)。盡管較高分子量的透明質酸和其各種形式可用來抑制血管生成，當所選用的透明質酸的分子量很高時，優(yōu)選的是將透明質酸形式進行熱壓處理，將透明質酸斷裂成較低分子量的片段，或者如果可行的話，經(jīng)過稀釋后可允許施用和確保無凝聚(不管什么施用途徑)。當所使用透明質酸形式的分子量較大時，可調節(jié)透明質酸形式在組合物中的濃度，例如根據(jù)分子量來降低(例如降至低于約1％)。適用于申請人的發(fā)明的，一種形式的透明質酸和/或其鹽(例如鈉鹽)和透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和亞單元，優(yōu)選透明質酸和其鹽，是由HyalPharmaceuticalCorpoation提供的片斷(fraction)。一種此類片斷是15ml的小玻璃瓶裝的透明質酸鈉20mg/ml(300mg/小玻璃瓶—Lot2F3)。透明質酸鈉是2％溶液，其平均分子量為225,000。該小瓶中含有適量水，水是三次蒸餾和消毒的，根據(jù)U.S.P關于注射配制劑的有關方式。透明質酸和/或其鹽的小瓶可以是由丁基橡膠塞子封閉的1型硼硅酸鹽玻璃瓶，該塞子不與瓶中內容物反應。透明質酸和/或其鹽(例如鈉鹽)和透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配位物、酯、片段和亞單元的級分，優(yōu)選透明質酸和其鹽，可以包括具有以下特征的透明質酸和/或基鹽來自于自然的透明質酸的提純了的、基本上無熱原的片斷，它具有至少一種選自由以下特征組成的一組的特征(優(yōu)選具有所有特征)i)分子量在150,000—225,000范圍內；ii)低于約1.25％的硫酸化粘多糖，以總重為基礎；iii)低于約0.6％的蛋白質，以總重為基礎；iv)低于約150ppm的鐵，以總重為基礎；v)低于約15ppm的鉛，以總重為基礎；vi)低于0.0025％的葡糖胺；vii)低于0.025％的葡糖醛酸；viii)低于0.025％N—乙酰基葡糖胺；ix)低于0.0025％氨基酸；x)在257nm下的UV消光系數(shù)低于約0.275；xi)在280nm下的UV消光系數(shù)低于約0.25；xii)PH在7.3—7.9范圍內。優(yōu)選透明質酸與水混合，透明質酸片斷的平均分子量在150,000—225,000范圍內。更優(yōu)選透明質酸片斷具有至少一種選自由以下特征組成的組的特征(優(yōu)選具有所有特征)i)低于約1％硫酸化粘多糖，以總重為基礎；ii)低于約0.4％蛋白質，以總重為基礎；iii)低于約100ppm的鐵，以總重為基礎；iv)低于約10ppm的鉛，以總重為基礎；v)低于0.00166％的葡糖胺；vi)低于0.0166％的葡糖醛酸；vii)低于0.0166％的N—乙?；咸前罚籿iii)低于0.00166％氨基酸；x)在257nm下的UV消光系數(shù)低于約0.23；xi)在280nm下的UV消光系數(shù)低于0.19；xii)PH在7.5—7.7范圍內。本申請人還推薦使用由LifeCoreTMBiomedical，Inc.制造和提供的透明質酸鈉，它具有以下技術規(guī)格性質技術規(guī)格外觀白色至乳白色顆粒氣味無味粘均分子量＜750,000道爾頓UV/visScan(紫外可見光掃描)，190—820nm符合標準(參考)OD(光密度)，260nm＜0.25OD單位透明質酸酶敏感度正反應IR掃描符合標準PH，10mg/g溶液6.2—7.8水8％最大值蛋白質＜0.3mcg/mgNaHy乙酸鹽＜10.0mcg/mgNaHy重金屬，最大值ppmAsCdCrCoCuFePbHgNi2.05.05.010.010.025.010.010.05.0微生物(Bioburden)沒有觀察到內毒素＜0.07EU/mgNaHg生物安全試驗通過兔子眼毒性試驗另一種形式的透明質酸鈉的商品名為HyalurnanHA—M5070，由SkymartEnterprises，Inc.銷售，它具有以下技術規(guī)格技術規(guī)格的測試結果LotNo.(批號)HG1004PH6.12CondroitinSulfate未檢測到蛋白質0.05％重金屬不高于20ppm砷不高于2ppm干燥失重2.07％灼燒殘余物16.69％特性粘度12.75dl/s(xw679,000)氮3.14％含量測定(Assay)104.1％微生物計數(shù)80只/g大腸桿菌陰性霉和酵母不高于50只/g其它形式的透明質酸和/或其鹽，和透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和亞單元可從其它供應商選購，例如在現(xiàn)有技術文獻中描述的那些供應商提供了所選擇形式的透明質酸，它適合于輸送藥物。下面的參考文獻講述了透明質酸的來源以及其制造和回收的工藝，該透明質酸是合適的。USP4,141,973中記載了透明質酸片斷(包括鈉鹽)，它具有以下技術指標“(a)平均分子量大于約750,000，優(yōu)選大于約1,200,000——即，極限粘度值大于約1400cm3/g，優(yōu)選大于約2000cm3/g；(b)蛋白質含量低于0.5％(重量)；(c)透明質酸鈉的1％溶液的紫外光吸收率，在257nm波長處低于3.0，在280nm波長處低于2.0；(d)透明質酸鈉在生理緩沖劑中的1％溶液的動力粘度高于約1000厘沱，(centistokes)，優(yōu)選高于10,000厘沱；(e)透明質酸鈉在生理緩沖劑中的0.1—0.2％溶液的摩爾旋光度，在220nm處測得的結果低于—11×103度—cm2/摩爾(二糖的)；(f)當將1毫升1％的透明質酸鈉(溶于生理緩沖劑)溶液植入晶狀體中置換約一半的現(xiàn)存液態(tài)晶狀體時，貓猴(owlmonkey)的眼睛沒有明顯的玻璃體和前房的細胞浸潤，在眼房水中沒有翳霧，在玻璃體中沒有混濁或翳霧，以及角膜、眼球晶狀體、虹膜、視網(wǎng)膜和脈絡膜沒有病理變化，該HUA是(g)無菌和無熱原和；(h)非抗原的。”加拿大專利第1,205,03號(參考美國專利4,141,973作為現(xiàn)有技術)，記載了平均分子量為50,000—100,000、250,000—350,000和500,000—730,000的透明質酸片斷并討論了它們的制造工藝。圖1包括圖1(a)和1(b)，它們是說明配制劑對鼠慢性肉芽腫的氣囊內的脈管系統(tǒng)的影響的條線圖。圖2以圖示方式說明了與抗血管生成與VI比率有關的試驗結果。圖3以圖示方式說明了與抗血管生成與胭脂紅有關的試驗結果。圖4以圖示方式說明了與抗血管生成與肉芽腫干重有關的試驗結果。本發(fā)明將參考下列實驗數(shù)據(jù)和所進行的試驗來加以說明。本申請人選擇一簡單的鼠血管生成的模型，該血管生成是由對巴豆油中弗羅因德氏完整輔助劑(completadjuvant)的慢性肉芽腫反應誘發(fā)的。申請人使用通過引入胭脂紅形成血管鑄型(cast)的這種方法的改進形式來評估這一過程。通過向麻醉的老鼠(25—30g，TuckOriginal)SC注射3ml空氣，并在24小時后注射0.5ml弗羅因德氏完整輔助劑(其中含有0.1％巴豆油)，從而誘發(fā)慢性肉芽腫氣囊，對這些老鼠連續(xù)給藥6天，通過形成血管鑄型評估血管內容物。這可通過向被溫暖的老鼠在40℃下靜脈注射1ml的一種胭脂紅在10％明膠溶液中的25％溶液來實現(xiàn)。這克服了末梢血管舒縮音色中任何與藥物或溫度有關的變化，這一變化可使結果作廢。將軀體冷卻，解剖肉芽腫氣囊內壁。將它們在56℃下干燥，稱重，并用木瓜蛋白酶消化。然后通過添加1ml0.05MNaOH將染料溶解進去，樣品以2500g離心處理20分鐘。在過濾之后，使用多井平板讀取器(Biotek)讀取在490nm下的吸收率。該結果表達為ug染料/mg組織干重。本申請人已試驗了二氯苯胺苯乙酸/透明質酸類(HA)(例如透明質酸鈉，分子量低于750,000道爾頓)的局部使用是否具有使血管生成停止的活性和HA(例如透明質酸鈉)單獨是否具有使血管生成停止的活性。0.1ml透明質酸類和二氯苯胺苯乙酸(6mg/kg)每天局部施用于已脫毛氣囊的表面上。二氯苯胺苯乙酸，當單獨施用時，與羧甲基纖維素混合使用。內傷應用是通過注射入氣囊中進行的，二氯苯胺苯乙酸單獨在無菌鹽水中被施用。在誘發(fā)后的第七天，評估組織的血管狀態(tài)。圖1(a)和1(b)表明，透明質酸類(HA)單獨地和二氯苯胺苯乙酸(diclo)單獨地局部施用和內傷施用對組織血管狀態(tài)都沒有明顯的影響。然而，透明質酸類(HA)和二氯苯胺苯乙酸(diclo)的結合使用顯著降低了血管生成速度。圖1(a)和1(b)說明了透明質酸類和二氯苯胺苯乙酸單獨施用或兩者結合施用對鼠慢性肉芽腫氣囊內血管系統(tǒng)的影響作用。0.1ml透明質酸類和二氯苯胺苯乙酸(6g/kg)每天單獨或兩者結合(圖1(a))局部施用于已脫毛氣囊的表面上。二氯苯胺苯乙酸單獨以混在作為載體的羧甲基纖維素中的形式給出。內傷應用是通過注入氣囊中(圖1(b))來完成的。在這種情況下，二氯苯胺苯乙酸以在鹽水中的形式給出。在第七天時，評估該組織的多血管狀態(tài)。透明質酸和二氯苯胺苯乙酸結合起來局部和囊內施用的方案介紹在鼠的背部中間皮下氣囊的形成能允許內壁(lining)的形成，該內壁響應抗原、刺激物和異體而產(chǎn)生慢性炎癥損傷。它(內壁)還可用來將藥物和各種其它治療劑引入發(fā)炎部位并收集炎癥滲出液。通過引入胭脂紅制造血管模型(cast)(它然后能被分光光度法分析)而完善了一奇特和簡單的技術，它可以定量地分析在發(fā)展發(fā)炎氣囊時的血管形成。方法為進行此實驗，用hypnorm/hypnoval輕度麻醉雌性鼠(TO，25—30g，每組10只)。通過向每只鼠的背部皮下注射3ml過濾消毒空氣而形成氣囊。24小時后，通過注射0.5毫升弗羅因德氏完整輔助劑(FCA)補充有0.1％巴豆油在氣囊內壁中誘發(fā)慢性炎癥。給藥計劃動物從注射FCA/巴豆油時開始每天給藥，共6天。在此時進行分析。1.局部(參見表1，局部使用)四組，——0.1ml水乳劑(Thornton&amp;Rossltd.)——0.1ml水乳劑＋6mg/kg二氯苯胺苯乙酸(HPC批號.9113003)——0.1ml透明質酸(透明質酸鈉)(HyalPharmaceuticalCorporation(HPC))批號OG019——0.1ml透明質酸(1％透明質酸鈉溶液，分子量低于750,000道爾頓，例如225,000道爾頓)＋6mg/kg二氯苯胺苯乙酸在局部使用之前，使用毛發(fā)剪和脫發(fā)油(LouisMarcel)除去背上的毛。在使用電剪時，在每一組中有一只或兩只的皮膚表面被弄破。將這些動物從結果中排除。2.囊內(注射)四組，——0.1ml消毒鹽水(0.9％)——0.1ml消毒鹽水＋6mg/kg二氯苯胺苯乙酸(HPC批號9113003)——0.1ml透明質酸(透明質酸鈉)(HPC批號OG019)——0.1ml透明質酸(1％溶液，分子量低于750,000道爾頓—例如225,000道爾頓)＋6mg/km二氯苯胺苯乙酸血管模型將鼠用hypnorm/hyproval麻醉并在恒溫的37℃的加熱手術臺上放置20分鐘。然后將每只鼠放入在37℃下的水夾套的培養(yǎng)室中并用注射器和預熱到40℃的溶液進行靜脈注射，使用1ml15％胭脂紅染料溶解在10％明膠(在Hanks平衡的鹽溶液中)中的溶液。將軀體然后在4℃下冷藏4小時。分析肉芽組織被解剖出來并在56℃的烘箱中干燥48小時。將干燥過的肉芽腫稱重，然后在pml木瓜蛋白酶溶液(12單位/ml、在0.05M磷酸鹽緩沖液中、PH7.0、補充有0.33g/的N—乙?；腚装彼?中在56℃下消化48小時。用5.0MNaOH將消化液添補到10ml，攪成旋渦以溶解染料，然后離心處理。消化液通過0.2um的硝酸纖維素膜過濾，200ml樣品被等分到96井板(Cweu—place)中，然后使用微板(microplate)讀取器在490nm下進行分光光度分析來分析染料含量。血管體積計算為每mg組織干重的胭脂含量。*一種由商業(yè)途徑可獲得的水基乳劑。表1局部使用表1(緩)<>n＝X(diclo＝(二氯苯胺苯乙酸)表2囊內<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="908">透明質酸(1％溶液)＋dic1o(6mg/kg)透明質酸(1％溶液)動物干重(mg)吸光度mg胭脂紅染ug/料/mg干重(mg)吸光度ug胭脂紅染ug料mg12.3.4.5678910平均s.e.m.p＝10410614013311590262726485117.117.80.0454*0.3230.2930.2150.3050.4600.2580.2710.1780.1710.2106861.544.664.197.753.956.836.635.143.556.25.850.0029**0.6540.5800.3190.4820.8460.6020.2170.5090.5450.5120.52660.05460.0260*126128142108118971341601471301295.85NS0.6070.2090.7100.6030.4140.2930.1900.4940.4950.31813043.315212987.861.839.210510566.991.9712.24NS1.0320.3371.0691.1940.7470.6370.2940.6540.7160.5170.71970.0957NS</table></tables>表2(<p>表3結果n＝8為局部使用n＝10為囊內治療這一數(shù)據(jù)支持HA和二氯苯胺苯乙酸結合起來以協(xié)同方式用作使血管形成停止的試劑的結論。同時，更重要的是應該注意到，雖然不是非常顯著，但是趨勢是HA＋diclo比HA單獨使用時具有更高的血管形成停止作用，HA比二氯苯胺苯乙酸更有效。所有的數(shù)據(jù)均用于統(tǒng)計分析，如果排除“明顯的”跳躍值，例如表2，動物7，HA＋dido，那么結果更突出。試驗和實驗的結果強有力地表明，各種形式的透明質酸(例如透明質酸，分子量低于750,000道爾頓，例如225,000道爾頓)和NSAID(例如二氯苯胺苯乙酸)可用來抑制血管生成，例如在肉芽腫中將會導致肉芽腫干重的減少。血管生成的抑制作用可用于治療和破壞惡性腫瘤。本發(fā)明的組合物，取自組合物的劑量，諸方法和治療劑可用作任何抗癌治療(例如放射治療，使用抗癌藥物的化療，等等)的一種輔助。本發(fā)明還可用于癌癥病人體內的次生腫瘤，這樣，一個瘤被消滅后，沒有發(fā)展其它惡性瘤。因此，通過抑制腫瘤的血管生長(切斷血管對腫瘤的供應)而抑制了腫瘤的發(fā)展。在這方面，使用本發(fā)明來對抗、反對、干擾和抑制由惡性腫瘤產(chǎn)生的腫瘤血管生成因子(TAF)的相應活性，該因子可提高此類腫瘤的血管生長速度，從而抑制了這一生長。系統(tǒng)地施用于病人的組合物，例如包括透明質酸鈉和二氯苯胺苯乙酸，能抑制血管生成，然后消滅腫瘤。該組合物按要求可以短期施用或長期施用(例如，按要求施用兒周或幾個月)。從這些原始的調查研究可看出，透明質酸類和二氯苯胺苯乙酸的結合物，不是局部施用就是直接施用于損傷處，可導致肉芽腫發(fā)炎過程中血管發(fā)展的減緩。其它方案在另一方案中，氣囊在老鼠身上再次被采用。只有這一次，在形成囊和注射0.5ml弗羅因德氏完整輔助劑(FCA)(補充有0.1％巴豆油)之后，老鼠體內的肉芽腫允許生長7天(在未醫(yī)治狀態(tài)下保持一星期)。結果是新血管的生長。一些鼠在7天周期結束時死去(與前面所述方式相同)，而其它用以下幾組藥局部治療(每天給藥)——0.1ml水乳劑(Thornton&amp;RossLtd.)——0.1ml水乳劑＋6mg/kg二氯苯胺苯乙酸(HPC批號.9113003)——0.1ml透明質酸(HPC批號.OG019)——0.1ml透明質酸(1％透明質酸鈉溶液，分子量低于750,000道爾頓，例如225,000道爾頓)＋6mg/kg二氯苯胺苯乙酸一些鼠在兩星期后(在停止局部使用后的一星期)死亡(以同樣方式)，剩下的在三星期后(在停止局部使用后的兩星期)死亡(以同樣方式)。用胭脂紅染料置換肉芽腫組織中的血液。將肉芽腫組織解剖出來，并按前述方式進行處理。對每一階段(7天、14天和21天后)的每一只老鼠測定肉芽腫的重量(包括胭脂紅染料)和胭脂紅染料(它置換血液)的重量。計算血管生長指數(shù)(VI)并對每組計算平均血管生長指數(shù)，如下從下表可以看出，用透明質酸(HA)和HA/diclo結合物，肉芽腫的平均干重隨時間推移而降低。用HA/diclo組合物，血管生長指數(shù)(VI)隨時間推移而降低(減少)。但是用其它任何試驗的組合物則沒有發(fā)生這種情況。因而很清楚，這一降低(減少)是血管分布(血液供應)減少的衡量標準。表4所有同時死亡老鼠的結果一起處理s.e.m.＝平均標準誤差p＝置信水平為了便于說明，將結果用曲線圖表示，在表2、3和4中它們表示圖2“抗血管生成”VI比率圖3“抗血管生成”胭脂紅圖4“抗血管生成”肉芽腫還提供了表5，列出了相應之間非常接近的平均數(shù)據(jù)，以便于比較，并根據(jù)它們制出了圖2、3和4中的曲線圖。表5從施用給老鼠的透明質酸鈉組合物的數(shù)據(jù)出發(fā)，推斷其也適用于人。下面的計算結果并不意味著使用較少的量不能實現(xiàn)基本消退。在這種情況下，0.1ml1％HA溶液與6mg/kg的二氯苯胺苯乙酸一起施用于25—30mg鼠，可轉化成33.3mgHA/kg和6mg二氯苯胺苯乙酸鈉/kg。因此70kg的人應施用多于2200mg的HA和420mg的二氯苯胺苯乙酸。本
技術領域：
中的那些熟練人員可以理解，根據(jù)本發(fā)明的各方面的方法、用途、組合物和劑量形式可以在需要抑制血管生成的其它情況下用來抑制血管生成，例如(抑制)視網(wǎng)膜下新血管形成，用來治療關節(jié)炎或防止進一步損傷，包括防止關節(jié)翳的進一步發(fā)展。因而很清楚，本發(fā)明的各實施方案和各方面可以在脫離其范圍的前提下派生出很多用途。因而希望本文所包含的所有內容材料應被解釋為是對本發(fā)明的說明，而沒有限制本發(fā)明的意思。權利要求1.兩組分(1)非甾體類抗炎藥，及(2)透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片斷和亞單元，在制造藥物組合物方面的用途，該組合物在治療中用來抑制、控制和/或消退血管生成，其中各劑量取自該組合物，每一劑量包括(1)治療有效量的組分(1)，和(2)治療有效量的透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片斷和亞單元，該藥物組合物的特征在于每一劑量取自該組合物，組分(1)和(2)的量能足以抑制、控制和/或消退血管生成。2.權利要求1的用途，其中組分(2)是透明質酸鈉。3.權利要求1的用途，其中藥物組合物用于治療視網(wǎng)膜下新血管生成。4.權利要求1的用途，其中藥物組合物用來治療關節(jié)炎或關節(jié)翳。5.權利要求1的用途，其中藥物組合物用來治療腫瘤。6.權利要求1的用途，其中藥物組合物用作癌癥治療的輔助藥劑。7.任一項前述權利要求的用途，其中組分(2)是分子量低于750,000道爾頓的透明質酸鈉、8.任一項前述權利要求的用途，其中藥物組合物局部施用于皮膚和/或暴露組織。9.權利要求7的用途，其中藥物組合物供系統(tǒng)施用。10.權利要求9的用途，其中每劑量中組分(2)的量超過約50mg/每15gNSAID。11.權利要求9的用途，其中一種形式的透明質酸在每劑量中超過約200mg/70kg人，以及NSAID在約15g—約100mgNSAID之間。12.任一項前述權利要求的用途，其中組分(1)非甾體類抗炎藥(NSAID)選自二氯苯胺苯乙酸，二氯苯胺苯乙酸鈉，消炎痛，萘普生，(+/-)Ketorolac的三甲醇氨基甲烷鹽，布洛芬，炎痛喜康，丙酸衍生物，乙酰基水楊酸和氟尼克辛。13.兩組分包括(1)非甾體類抗炎藥(NSAID)，和(2)透明質酸和/或其鹽，在制造單劑量的藥物組合物方面的用途，該劑量用來在治療中抑制、控制或消退人體內血管生成，其中單劑量包括治療有效量的該試劑(1)和治療有效量的分子量低于750,000道爾頓的透明質酸和/或其鹽，該用途的特征在于組分(1)和(2)的量能夠在施用后立即會抑制、控制或消退血管生成。14.權利要求10的用途，其中該劑量局部施用于皮膚和/或暴露的組織。15.權利要求13的用途，其中該劑量供系統(tǒng)施用。16.權利要求12的用途，其中每劑量中組分(2)的量超過約50mg/每15mgNSAID。17.權利要求13的用途，其中一種形式的透明質酸的量超過約200mg/70kg人，和NSAID是在約15mg—約100mgNSAID之間。18.任一項前述權利要求的用途，根據(jù)施用途徑，進一步包括藥理上相容的賦形劑，以提供易于施用的一種形式。19.權利要求13或14的用途，將組合物局部施用、直腸施用或施用于粘膜。20.權利要求13的用途，其中藥物組合物用于治療視網(wǎng)膜下新血管生成。21.權利要求13的用途，其中藥物組合物用于治療關節(jié)炎或關節(jié)翳。22.權利要求13的用途，其中藥物組合物用于治療腫瘤。23.權利要求13的用途，其中藥物組合物用作癌癥治療的輔助劑。24.一種抑制、控制或消退人體內血管生成的方法，包括一定時期內對人施用無毒劑量的藥物組合物，治療有效的、無毒的劑量的組合物包括非甾體類抗炎藥(NSAID)和有效無毒劑量的透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和/或亞單元，當施用該組合物以抑制、控制或消退人體內血管生成時表明這兩種組分一起使用十分有效，按需要該組合物進一步包括適合該施用形式的藥物賦形劑。25.權利要求24的方法，其中藥物組合物用于治療視網(wǎng)膜下新血管生成。26.權利要求24的方法，其中藥物組合物用于治療關節(jié)炎或關節(jié)翳。27.權利要求24的方法，其中藥物組合物用于治療腫瘤。28.權利要求24的方法，其中藥物組合物用作癌癥治療的輔助劑。29.權利要求24、25、26、27或28的方法，其中透明質酸形式是透明質酸鈉且其分子量低于約750,000道爾頓。30.權利要求24、25、26、27或28的方法，其中該劑量供系統(tǒng)施用。31.權利要求30的方法，其中透明質酸鈉的量超過約200mg/70kg人，NSAID是在約15mg—約100mgNSAID。32.權利要求25、26、27、28、29或30的方法，其中非甾體類抗炎藥(NSAID)選擇二氯苯胺苯乙酸鈉，它的量在約15mg—約100mg/70kg人，透明質酸形式的量是50mg—1050mg。33.權利要求24、25、26、27、28、29、30、31或32的方法，其中NSAID選自二氯苯胺苯乙酸、二氯苯胺苯乙酸鈉、消炎痛、萘普生、ketorolac的(+/-)三甲醇氨基甲烷鹽、布洛芬、炎痛喜康、丙酸衍生物、乙酰水楊酸和氟尼克辛。34.權利要求24、25、26、27、28或29的方法，其中劑量中NSAID的量是400mg，透明質酸形式的量高于約2000mg。35.內含一種施用于人體以抑制、控制和消退人體內血管生成的組合物的容器，該組合物包括至少一個劑量，每一劑量包括(a)NSAID和(b)透明質酸和/或透明質酸鈉，每一劑量包括有效無毒劑量的一種NSAID和透明質酸和/或透明質酸鈉以抑制、控制和消退人體內血管生成，其中有效量的透明質酸和/或透明質酸鈉在欲施用的每一劑量中包含約50mg透明質酸形式和約15mgNSAID。36.權利要求35的容器，其中透明質酸和/或透明質酸鈉的分子量低于約750,000道爾頓。37.權利要求35或36的容器，其中藥物組合物供系統(tǒng)施用。38.有效劑量的藥物組合物在抑制、控制和/或消退哺乳動物體內血管生成方面的用途，該組合物包括有效量的NSAID和有效無毒量的分子量低于750,000道爾頓的透明質酸和/或其鹽類。39.權利要求38的用途，其中藥物組合物供系統(tǒng)施用。40.權利要求39的用途，其中透明質酸形式的量超過約200mg/70kg人，NSAID是在約15mg—約100mgNSAID之間。41.透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片斷和亞單元在制造藥物組合物時的用途，該組合物在治療中用來抑制、控制和/或消退血管生成，其中各劑量取自該組合物，每一劑量包括治療有效量的透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片斷和亞單元，該藥物組合物的特征在于每一劑量取自該藥物組合物，透明質酸形式的量能夠抑制、控制和/或消退血管生成。42.權利要求41的用途，其中藥物組合物用于視網(wǎng)膜下新血管生成。43.權利要求41的用途，其中藥物組合物用于治療關節(jié)炎或關節(jié)翳。44.權利要求41的用途，其中藥物組合物用于治療腫瘤。45.權利要求41的用途，其中藥物組合物用作癌癥治療的輔助劑。46.權利要求41、42、43、44或45的用途，其中透明質酸形式是分子量低于約750,000道爾頓的透明質酸和/或其鹽。47.權利要求41、42、43、44、45或46的用途，其中藥物組合物供系統(tǒng)施用。48.一種抑制、控制和/或消退人體內血管生成的方法，它包括施用無毒劑量的組合物，該組合物包括治療有效量的、無毒的劑量的透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和/或亞單元，當施用組合物抑制、控制和/或消退人體內血管生成時，它是十分有效的。49.權利要求48的方法，其中透明質酸形式是分子量低于約750,000道爾頓的透明質酸鈉。50.權利要求47的方法，其中該治療方法是在數(shù)周內每天施用。51.權利要求24或48的治療方法，其中治療方法包括在數(shù)周時間內每天多次施用有效劑量的組合物，以抑制、控制和/或消退血管生成。52.權利要求24、25、48或49的方法，它與治療癌癥的任何方法相結合。53.有效劑量的組合物的用途，該組合物包括有效劑量的分子量低于750,000的透明質酸和/或其鹽，經(jīng)施用后足以抑制、控制或消退人體內血管生成。54.權利要求53的用途，其中藥物組合物供系統(tǒng)施用。55.用于抑制、控制或消退人體內血管生成的藥物組合物，該藥物組合物包括(1)非類固醇消炎藥(NSAID)，和(2)透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和亞單元，其形式適合于施用給人；其特征在于該組合物包括至少一種有效劑量的組分(1)和(2)以抑制、控制或消退血管生成。56.權利要求55的藥物組合物，其中至少一種有效劑量包括多個劑量。57.權利要求55的藥物組合物，其中至少一種有效劑量包括一個劑量。58.權利要求55、56或57的藥物組合物，其中透明質酸和/或其鹽和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和/或亞單元是分子量低于約750,000道爾頓的透明質酸和/或其鹽。59.權利要求55、56、57或58的藥物組合物，其中透明質酸形式是分子量低于750,000道爾頓的透明質酸鈉，在每劑量中透明質酸鈉的存在量為約2200mg，二氯苯胺苯乙酸的存在量為約420mg。60.權利要求38或53的用途，用來治療視網(wǎng)膜下新血管生成。61.權利要求38或53的用途，用來治療關節(jié)炎或關節(jié)翳。62.權利要求38或53的用途，用來治療腫瘤。63.權利要求38或53的用途，用作癌癥治療的輔助劑。64.權利要求24、25、26、27、28或29的方法，其中透明質酸形式是分子量低于750,000道爾頓的透明質酸鈉，在每劑量中透明質酸鈉的存在量為約2200mg，二氯苯胺苯乙酸的存在量為約420mg。全文摘要兩組分，(a)非甾體類抗炎藥，和(b)透明質酸和/或其鹽類和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片段和亞單元在制造藥物組合物時的用途，該藥物組合物在治療中用來抑制，控制和/或消退血管生成，其中各劑量取自該組合物，每一劑量包括(1)治療有效量的組分(α)；和(2)治療有效量的透明質酸和/或其鹽類和/或透明質酸的同系物、類似物、衍生物、配合物、酯、片斷和亞單元，該藥物組合物的特征在于每一取自該藥物組合物劑量，組分(α)和(b)的量足以抑制、控制和/或消退血管生成。文檔編號C08B37/08GK1123005SQ94192096公開日1996年5月22日申請日期1994年4月15日優(yōu)先權日1993年4月16日發(fā)明者D·A·威洛比,C·阿拉姆,S·S·阿庫萊,R·E·法爾克,D·W·哈博申請人:諾法姆康公司