專利名稱：一種酰胺類化合物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的醫(yī)藥用途，更涉及如式I的化合物在預(yù)防和/或治療肝損傷和/或肝衰竭中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝臟是人體內(nèi)最大的器官，具有消化與代謝、解毒、對(duì)代謝產(chǎn)物再利用以及維持個(gè) 體內(nèi)穩(wěn)定的重要功能，其代謝活動(dòng)十分復(fù)雜。它不但在物質(zhì)代謝的生物合成與降解功能上 發(fā)揮著重要作用，還是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的貯存庫(kù)。任何破壞肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程都可能造成 肝細(xì)胞損傷，從而影響肝臟正常的生理功能。各種致病因素包括物理的、化學(xué)的和生物性 的，作用于肝組織，都會(huì)引起損傷與抗損傷反應(yīng)。肝損傷主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞變性、壞死和凋 亡。肝損傷通常由感染、損傷、暴露在毒性化合物中、酒精、食物不潔，或血液正常物質(zhì)的不 正常積累、或機(jī)體自身免疫、或遺傳缺陷(如血色病)所導(dǎo)致的，而有時(shí)引起肝損傷的具體 原因是不得而知的。目前，病毒所造成的肝損傷是傳播最為廣泛并最難控制的一種，已知 的有A型、B型、C型、D型、E型和G-型肝炎病毒，病毒性肝炎的種類還在不斷增加。有 時(shí)，正常情況下無(wú)毒性的物質(zhì)被濫用時(shí)也會(huì)有肝毒性，如服用過(guò)量的乙酰胺基酚(APAP)和 酒精。由于長(zhǎng)期酒精的攝入導(dǎo)致的酒精性肝損傷是另一主要的病因。免疫性肝損傷很少 發(fā)生但很難控制。膽汁淤積也會(huì)造成肝損傷，如原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是肝內(nèi)膽管進(jìn) 行性破壞并以慢性膽汁淤積為主要特征的肝損傷。近期還發(fā)現(xiàn)基因治療也可導(dǎo)致肝損傷。 如，以肝細(xì)胞小葉中心壞死為特征的肝細(xì)胞損傷是肝病毒策略的基因治療的主要副反應(yīng)。 大量研究表明，肝細(xì)胞的過(guò)度凋亡是上述多種肝病的病因之一。此外，肝細(xì)胞的凋亡還會(huì) 導(dǎo)致肝纖維化和其它肝病。預(yù)防肝細(xì)胞的過(guò)度凋亡在預(yù)防和治療肝損傷時(shí)是十分重要的 (Guicciardi et al. Gut, 2005 :54，1024-1033 和 Ghavami et al.，Med. Sci. Monit.，2005 11(11) :RA337-345)。肝衰竭(Liver Failure,LF)是多種因素引起的嚴(yán)重肝損傷，導(dǎo)致其合成、解毒、排 泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙和黃疸、肝性腦病、腹水 等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。肝衰竭的具體病因尚不完全清楚，在歐美國(guó)家藥物是誘導(dǎo)肝衰竭的重要因素，如 對(duì)乙酰氨基酚、甲基多巴、硫異煙胼、吡嗪酰胺，麻醉劑氟烷，非類固醇類抗炎藥等。在美國(guó)， 乙酰氨基酚中毒引發(fā)肝衰竭的比例在逐年上升。病毒性肝炎在亞洲，尤其在我國(guó)是引起肝 衰竭的主要原因。在發(fā)展中國(guó)家，戊型肝炎則是引起的肝衰竭的一個(gè)重要病因。另外，外科 疾病肝巨大或彌漫性惡性腫瘤，尤其合并肝硬變時(shí)，易并發(fā)肝衰竭。嚴(yán)重肝外傷，大范圍肝 被手術(shù)切除或者有肝血供的損害如血管損傷、肝血流阻斷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等，治療門靜脈高壓癥 的門體靜脈分流，膽道長(zhǎng)時(shí)間阻塞，肝膽管結(jié)石反復(fù)炎癥導(dǎo)致肝損害，Budd-Chiari綜合癥、 Wilson病、皰疹病毒感染、其他膿毒癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、妊娠期急性脂肪肝等也可引起肝?竭。自身免疫性肝炎常會(huì)在2-3周內(nèi)病情迅速進(jìn)展為肝衰竭，但臨床上往往無(wú)特殊表現(xiàn)。肝 毒性物質(zhì)如四氯化碳、黃磷等，誤食毒菌也可造成肝衰竭。
肝衰竭是一組臨床綜合癥，其臨床特點(diǎn)是突然出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞損害，肝功能 迅速惡化，并導(dǎo)致精神異常，伴肝性腦病以及凝血功能障礙，預(yù)后極差，病死率可高達(dá) 50%-90%。我國(guó)每年因重癥肝功能衰竭導(dǎo)致死亡的人數(shù)為30萬(wàn)-50萬(wàn)。尤其是乙型肝炎 肝衰竭患者生存率僅有26%。在發(fā)展中國(guó)家，戊型肝炎則是引起的肝衰竭中妊娠婦女的病 死率極高。對(duì)于肝細(xì)胞無(wú)法大量再生的患者，肝移植是目前唯一的有效治療措施。但美國(guó) 最大樣本的調(diào)查研究表明，只有29%的急性肝衰竭患者進(jìn)行了移植手術(shù)，約1/4的患者列 入了等待肝移植的名單，在列入肝移植名單的患者中，10%在等待肝源期間死亡。其它研究 報(bào)告也表明，等待肝源時(shí)死亡的患者高達(dá)40%。2006年，我國(guó)制定了第一部《肝衰竭診療指南》，將我國(guó)肝衰竭分為急性肝衰竭 (Acute Liver Failure, ALF)、亞急性肝衰竭(Subacute Liver Failure, SALF)、慢加急性 (亞急性)肝衰竭(Acuter-on-Chronic Liver Failure, ACLF)和慢性肝衰竭(Chronic Liver Failure,CLF)0而在此之前，有關(guān)肝衰竭(重型肝炎)的分型診斷一直無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)， 其原因有多種，如病因多樣、是否將肝性腦病列為肝衰竭必備條件、對(duì)過(guò)去肝病史的認(rèn)識(shí)不 一、命名角度的不一等。從命名角度上，歐美國(guó)家較看重肝臟功能，故稱肝衰竭；而我國(guó)和日 本較看重炎癥本質(zhì)，故稱重型(癥)肝炎(Sever Hepatitis) 0日本還根據(jù)有無(wú)肝性腦病分 別稱為劇癥肝炎(Fulminant Hepatitis)和重癥肝炎。我國(guó)重型肝炎中的急性重型肝炎、 亞急性重型肝炎及慢性重型肝炎分別與國(guó)外急性肝衰竭、亞急性肝衰竭及慢加急性肝衰竭 相似。急性肝衰竭的特征是起病急，發(fā)病2周內(nèi)出現(xiàn)以II度以上肝性腦病為特征的肝衰竭 癥候群；慢加急性(亞急性)肝衰竭是在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性肝功能失代償。我國(guó) 肝衰竭患者多發(fā)生于慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，在此基礎(chǔ)上由于勞累、飲酒、感染、病 毒復(fù)制等誘因，肝臟發(fā)生大塊或亞大塊壞死，此種肝衰竭類型稱為慢加急性肝衰竭；慢性肝 衰竭是在肝硬化基礎(chǔ)上，肝功能進(jìn)行性減退導(dǎo)致的以腹水或門靜脈高壓、凝血功能障礙和 肝性腦病等為主要表現(xiàn)的慢性肝功能失代償。肝功能嚴(yán)重受損患者由于對(duì)內(nèi)毒素滅活功能降低，幾乎都存在內(nèi)毒素血癥，而內(nèi) 毒素血癥又可加重肝損傷，促發(fā)多種并發(fā)癥的發(fā)生，此為肝功能衰竭的“二次打擊”學(xué)說(shuō)。 內(nèi)毒素或稱脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是存在于所有革蘭氏陰性細(xì)菌外膜中的 糖脂。在高濃度時(shí)則能夠?qū)е卵装Y反應(yīng)的發(fā)生，而成為肝臟的致病因素，稱為內(nèi)毒素血癥。 在各種急慢性肝損傷患者中均存在不同程度的內(nèi)毒素血癥，如急性肝炎為26% -50%，急 性重癥肝炎為59% -100%，慢性活動(dòng)性肝炎為20-50%，肝硬化為15% -92%，肝性腦病為 93% -100%，肝衰竭則為100%。一般認(rèn)為肝衰竭時(shí)內(nèi)毒素主要來(lái)源于腸道菌群。當(dāng)某些疾病導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或 移位時(shí)，產(chǎn)生的有毒物質(zhì)也一起被腸道吸收，從門靜脈進(jìn)入血液循環(huán)形成腸源性內(nèi)毒素血 癥。其結(jié)果為加重肝損害和使部分患者促發(fā)肝功衰竭及肝外并發(fā)癥的發(fā)生。其發(fā)病機(jī)制主 要包括以下因素①LPS對(duì)肝細(xì)胞有直接毒性作用。肝細(xì)胞接觸LPS或類脂A后，類脂A被 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜與特異性受體結(jié)合，抑制ATP合成酶及還原煙酰胺嘌呤二核苷酸(NADH) 脫氫酶，使能量生成受阻，并因呼吸鏈電子傳遞干擾，氧分子接受電子不足，產(chǎn)生氧自由基 損害生物膜，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死；②LPS可損傷肝竇血管內(nèi)皮，促進(jìn)肝內(nèi)微血栓形成。LPS激活 中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，后者 通過(guò)粘附蛋白破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，許多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì) 作用于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及微血管，激活凝血系統(tǒng)，引致微血栓形成。③LPS可致肝細(xì)胞損害，使肝細(xì)胞體積增大，縮小肝內(nèi)血管間隙。LPS刺激血液成份或組織細(xì)胞釋放縮血管物質(zhì)，導(dǎo) 致門脈壓增高。LPS所致肝竇內(nèi)血栓形成及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的去窗孔化均可直接升高肝內(nèi)血 管阻力，導(dǎo)致門脈壓升高。④LPS激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。單核巨噬 細(xì)胞系統(tǒng)包括單核細(xì)胞和枯否細(xì)胞被LPS激活后，可表達(dá)、分泌各種細(xì)胞因子和炎性遞質(zhì)， 并作用于肝臟和其它組織器官的生物膜，導(dǎo)致肝臟及其它器官損傷，乃至出現(xiàn)多器官衰竭。 在肝病方面尚可引起肝內(nèi)膽汁瘀積、高黃疸，促進(jìn)腹水及(或)肝性腦病的出現(xiàn)及加重。D-Gal為一種特異性損害肝臟的藥物，能耗竭肝細(xì)胞內(nèi)三磷酸尿嘧啶核苷，抑制RNA合成；促使肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺，造成結(jié)腸水腫，使腸源性內(nèi)毒素吸收增加，增強(qiáng) 動(dòng)物對(duì)LPS的敏感性及肝臟損傷特異性。D-Gal/LPS誘導(dǎo)的肝衰竭模型，被認(rèn)為是肝衰竭的 良好模型。本發(fā)明采用此方法復(fù)制的肝衰竭模型，動(dòng)物死亡率高，肝功能指標(biāo)及病理表現(xiàn)均 符合肝衰竭中肝臟大塊壞死性病變特點(diǎn)。對(duì)于肝衰竭，至今尚無(wú)特效的治療方法，處理上大多是根據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度 和進(jìn)展情況，選擇采用支持療法(每日靜脈補(bǔ)給一定量的葡萄糖、肌苷、維生素Ki和大劑量 維生素C并酌情使用降黃、降酶的藥物)、對(duì)癥治療(主要控制并發(fā)癥)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生和 保護(hù)肝細(xì)胞的藥物如促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素等。盡管采取多種措施，成年患者能存活者仍很少，兒 童患者預(yù)后略好一些。現(xiàn)已證實(shí)，大劑量使用糖皮質(zhì)激素、換血、前列腺素治療都無(wú)效。目前 肝移植是治療肝衰竭最有效的方法。國(guó)內(nèi)近年來(lái)也在積極開(kāi)展肝移植，但肝移植在我國(guó)廣 泛用于肝衰竭患者治療的條件尚不成熟，除經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)較差外，供肝嚴(yán)重不足也是瓶頸之一。過(guò)去認(rèn)為其肝細(xì)胞大量死亡是壞死，主要與機(jī)體免疫功能紊亂介導(dǎo)損傷有關(guān)?，F(xiàn) 認(rèn)為除肝細(xì)胞壞死這一死亡形成外，肝細(xì)胞凋亡在肝衰竭(重型肝炎)過(guò)程中起著重要 作用。肝細(xì)胞死亡有兩種形式一凋亡和壞死，其中肝衰竭引起的細(xì)胞凋亡與線粒體損 傷程度密切相關(guān)。臨床研究也表明，肝衰竭(重型肝炎)患者中內(nèi)毒素及腫瘤壞死因子 α (TNF-α)水平明顯升高。近年來(lái)的研究認(rèn)為肝衰竭(重型肝炎)與肝細(xì)胞凋亡關(guān)系密 切，動(dòng)物模型試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在肝衰竭(重型肝炎)早期肝細(xì)胞以凋亡為主，之后則以壞死 為主，直至最終因肝功能衰竭死亡。肝細(xì)胞凋亡存在于整個(gè)病程中，而壞死則在病程后期出 現(xiàn)，凋亡的肝細(xì)胞也可能引起肝細(xì)胞壞死。因此，抑制肝細(xì)胞的凋亡，則可抑制由于肝細(xì)胞 凋亡導(dǎo)致的肝損傷和肝衰竭。Caspase即半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，是經(jīng)典的細(xì)胞凋亡分子，目前，人類 Caspase家族至少包括14個(gè)成員。根據(jù)Caspase家族成員之間大小亞單位的同源性，可分 為 3 組，包括炎癥組=Caspase-U _4、_5、-12、-13 和-14 ；凋亡起始組Caspase_2、_8、~9 和-10 ；凋亡效應(yīng)組Caspase-3、_6和_7。Caspase能夠通過(guò)破壞或激活細(xì)胞內(nèi)一些關(guān)鍵 性的酶，引起DNA斷裂，破壞細(xì)胞骨架而引起細(xì)胞凋亡，通過(guò)Caspase聯(lián)級(jí)信號(hào)途徑在細(xì)胞 凋亡的啟動(dòng)、發(fā)展、終止等過(guò)程中起著決定性的作用。目前基于caspase的肽底物結(jié)構(gòu)制備了許多強(qiáng)caspase抑制劑。然而，與其體外 的強(qiáng)效作用相反，目前尚未有對(duì)凋亡的完整細(xì)胞模型具有良好功效(IC5tl < ImM)的報(bào)道。 值得注意的是，之前有研究認(rèn)為，某些帶有FMK^luoromethylketone)基團(tuán)的caspase酶抑 制劑在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性，其FMK部分可能與化合物在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的毒性反應(yīng)有關(guān)。本領(lǐng)域迫切需要提供一種對(duì)于肝細(xì)胞凋亡有抑制作用而且具有低毒性的化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種式I化合物的新用途。在本發(fā)明中，提供了一種如式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其藥物前 體的用途， 所述的化合物用于制備肝細(xì)胞凋亡抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑是肝細(xì)胞中Caspase的抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑用于肝細(xì)胞凋亡引起的肝損傷。在另一優(yōu)選例中，所述的肝損傷是肝衰竭。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑是肝損傷治療劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、亞急性肝衰竭治療劑、慢加 急性肝衰竭治療劑、和/或慢性肝衰竭治療劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、和/或慢加急性肝衰竭治 療劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑用于預(yù)防和/或治療肝損傷和/或肝衰竭。在另一優(yōu)選例中，所述的肝細(xì)胞是人肝細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑選自片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口 服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無(wú)菌粉末、或栓劑。據(jù)此，本發(fā)明提供了 一種對(duì)于肝細(xì)胞凋亡有抑制作用而且具有低毒性的化合物。


圖1顯示了式I化合物對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。圖2顯示了式I化合物對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)源PARP蛋白切割的抑制作用。圖3顯示了式I化合物對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)源caspase 3/7活性的抑制 作用。圖4顯示了式I化合物體外對(duì)caspase 3活性的抑制作用。圖5顯示了正常小鼠肝組織形態(tài)。圖6顯示了實(shí)施例7中模型組小鼠肝組織病理變化情況。圖7顯示了實(shí)施例7中藥物組小鼠肝組織病理變化情況。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)如式I的化合物可以有效地保護(hù)肝細(xì)胞凋亡，特別對(duì)肝細(xì)胞中的Caspase活性具有良好的抑制作用。 如本文所用，“肝衰竭”和“重型肝炎”可以互換使用，都是指由多種因素引起的嚴(yán) 重肝損傷，導(dǎo)致其合成、解毒和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙，出現(xiàn)以黃疸、凝血功能障礙、 肝性腦病和腹水等為主要表現(xiàn)的一種臨床癥候群。在本發(fā)明中，所述肝損傷，包括但不限于由炎癥、毒性損害、肝血流改變、肝臟感 染(如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng))、先天性代謝障礙引起物質(zhì)在肝臟貯積、化學(xué)物質(zhì)和藥物、 肝內(nèi)循環(huán)紊亂(如慢性心衰、Budd-chiari綜合癥、靜脈閉塞疾病、門靜脈栓塞)或膽汁流 動(dòng)阻塞等任何破壞肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程所引發(fā)的肝細(xì)胞損傷，其中包括肝衰竭。在本發(fā)明中，所述的重型肝炎，包括但不限于，急性、慢加急性(亞急性)、慢性重 型肝炎。在本發(fā)明中，所述的肝衰竭，包括但不限于，急性肝衰竭(ALF)、亞急性肝衰竭、慢 加急性肝衰竭/亞急性(ACLF)、慢性肝衰竭。爆發(fā)性肝衰竭(FHF)、急性黃疸型肝炎、肝炎 引起的腦損傷也屬于肝衰竭。以及藥物誘導(dǎo)的肝衰竭，如對(duì)乙酰氨基酚、利福平、乙醇、甲基 多巴、硫異煙胼、吡嗪酰胺，麻醉劑氟烷，非類固醇類抗炎藥、化療藥物、抗代謝藥等；病毒性 肝炎引起的肝衰竭，如甲型、乙型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎；其他病毒引起的肝衰竭，如 巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腸道病毒等；細(xì)菌及寄生蟲(chóng)等病原體感染嚴(yán)重或持續(xù)感 染(如敗血癥、血吸蟲(chóng)病等)；外科疾病肝巨大或彌漫性惡性腫瘤，尤其合并肝硬變時(shí)，并發(fā) 的肝衰竭；嚴(yán)重肝外傷，大范圍肝被手術(shù)切除或者有肝血供的損害如血管損傷、肝血流阻斷 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等造成的肝衰竭；治療門靜脈高壓癥的門體靜脈分流，膽道長(zhǎng)時(shí)間阻塞，肝膽管結(jié) 石反復(fù)炎癥導(dǎo)致的肝損害；Budd-Chiari綜合癥、Wilson病、皰疹病毒感染、其他膿毒癥、肝 豆?fàn)詈俗冃浴⑷焉锲诩毙灾靖蔚葘?dǎo)致的肝衰竭。缺血、缺氧性肝損傷，包括休克、充血性心 力衰竭等引起的肝衰竭，自身免疫性肝炎導(dǎo)致的肝衰竭。肝毒性物質(zhì)如四氯化碳、黃磷、毒 菌等導(dǎo)致的肝衰竭等。本文中使用的“有效劑量”指達(dá)到希望療效的藥物的最小劑量。因此，本文中使用 的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物的有效劑量指能夠達(dá)到希望的式I化合 物血藥濃度的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物的量。式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物可以用于抑制肝細(xì)胞凋亡，尤其 適用于抑制人肝細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其 前體藥物對(duì)于肝細(xì)胞內(nèi)源Caspase具有抑制作用；較佳地，可抑制Caspase 3/7。本發(fā)明的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物的治療有效劑量是能 有效地保護(hù)肝衰竭的劑量，一般的，治療以小劑量開(kāi)始，以便不斷增加劑量直到此條件下的 最適。在給藥前，式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物可與磷酸鹽緩沖液或?yàn)楸绢I(lǐng)域的熟練人員所熟知的任何其他適合的溶液混合。式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物可如需求的那樣以固體(冷凍干燥)或液體制劑形式給藥。施用本發(fā)明的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物的方法視具體情 況而定。通常，施用本發(fā)明的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物可通過(guò)以下 途徑完成口腔內(nèi)、鼻腔內(nèi)、腹膜內(nèi)、腸胃外、靜脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、間質(zhì)內(nèi)、動(dòng) 脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、滑膜腔內(nèi)、經(jīng)上皮、經(jīng)皮施用。在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制劑(或稱藥物組合物)，它含有式I化合 物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物和藥學(xué)上可接受的載體；以抑制劑的總重量計(jì)， 其中的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物的含量為0.01-99. 9wt%，優(yōu)選 50_99wt%。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各 種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施 用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形 劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另 夕卜，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如崩解劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。來(lái)自 于式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物之外的非必要成分，以及其他非必要成 分(例如其他輔助性藥物)，也包括在藥學(xué)上可接受的載體的定義中。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的抑制劑可以被制成針劑形式，例如用生 理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的 藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條 件下制造。式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前體藥物在治療疾病時(shí)常用的每日劑量 為約 0. OOOl-IOOOmg,優(yōu)選 0. 01_500mg，更優(yōu)選 0. l_200mg。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的式I化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或 其前體藥物施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全劑量通常每日劑量為約0. OOOl-lOOOmg，優(yōu)選 0. 01-500mg,更優(yōu)選0. l-200mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素， 這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。在預(yù)防和治療肝損傷和肝衰竭時(shí)，式I化合物可以與以下物質(zhì)聯(lián)用抗炎藥物如 布洛芬(Ibuprofen)及其它非固醇類抗炎藥物，抗病毒藥物如拉米夫定、阿德福韋酯、恩替 卡韋、干擾素，抗內(nèi)毒素藥物或單抗、IL-I受體拮抗劑(IL-Ira)、TNF_a及其受體拮抗劑， 抗氧化劑如N-乙酰半胱氨酸，蛋白酶抑制劑如西維來(lái)司納(Slivelestat Sodium)，免疫調(diào) 節(jié)劑身上皮質(zhì)激素、胸腺肽α 1，磷酸二酯酶抑制劑如己酮可可堿(Pentoxifylline)，護(hù)肝 藥腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽等。促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素或前列腺素El脂質(zhì)體等促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)藥 物。腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、乳果糖或拉克替醇，改善微循環(huán)藥物等。式I化合物還可與治療肝 纖維化的藥物聯(lián)用，如水飛薊素、吡非尼酮、秋水仙堿。此外還可與含丹參、黃芪、鱉甲等單 味或復(fù)方中藥聯(lián)合使用。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說(shuō)明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、首次發(fā)現(xiàn)式I化合物對(duì)于肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用；2、首次發(fā)現(xiàn)式I化合物可以施用于肝衰竭(重型肝炎)病人；3、本發(fā)明提供的caspase抑制劑也含有FMK基團(tuán)，發(fā)明人在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了一系列毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其具有低毒性。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按
重量計(jì)。本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。以下實(shí)施例中的式I化合物由下述方法制備得到1. 3-硝基丙酸叔丁酯(1)的制備向冷卻的450ml 二氯甲烷(DCM)中通入異丁烯681. 94g，得到溶液(I)；向3-硝 基丙酸300g中加入二氯甲烷1700ml和2-甲基-2-丙醇33. 76g，冷至-10°C，加入硫酸 109. 18g，得到溶液(II)?；旌先芤?I)與溶液(II)，分離和萃取有機(jī)相和水相，合并有機(jī) 層，干燥，濃縮得化合物(1) 375g，油狀物，收率為85%。 2. 5-氟-4-羥基-3-硝基戊酸叔丁酯(2)的制備向1. 5L 二氯甲烷中加入乙二酰氯 254. 18g JnADMSO 344. 55g，2_ 氟乙醇 91. 84g 和三乙胺828. Sg。將化合物(1)200. Og的二氯甲烷溶液加入反應(yīng)混合物中，干燥，濃縮， 得到深琥珀色油狀物。粗提油狀物用硅膠純化，得到白色結(jié)晶化合物(2)70.42g，收率為 26%。3. 3-氨基-5-氟-4-羥基戊酸叔丁酯(3)的制備在反應(yīng)釜中投入化合物(2)80. Og,甲醇1. 6L，Raney Ni 32. 0g。反應(yīng)混合物經(jīng)硅 藻土(Celite plug)過(guò)濾，濃縮，得到化合物(3) 70. 0g，粗提物直接用于下步反應(yīng)，收率為 100%。4. 3- (2-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酰胺基)_5_氟4_羥基戊酸叔丁酯(4)的制 備向無(wú)水四氫呋喃溶液中加入化合物(4) 70. 0g, cbz-L-纈氨酸85. 7g，1_羥基-苯 丙-三唑水合物(HOBT) 57. 16g，4- 二甲氨基吡啶(DMAP) 45. 40g和1_ (3- 二甲氨基甲 基)3_乙基碳二甲胺鹽酸鹽(EDCI) 71. 22g，反應(yīng)10分鐘。過(guò)濾，真空濃縮，分離有機(jī)層，得 到化合物(4)的粗提物148. 8g，直接用于下步反應(yīng)，淺棕色粘性液體，收率為100%。5. 3- (2-芐氧羰基氨基-3-甲基-丁酰胺基)_5_氟_4_氧代戊酸叔丁酯(5)的制 備將氯鉻酸吡啶鹽(PCC) 674. Ig加入化合物(5)450. Og的無(wú)水二氯甲烷溶液中，室 溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)混合物經(jīng)硅膠柱層析法純化，洗脫，真空干燥，得到白色結(jié)晶固體化合物(5)296g，收率為66%。6.式I化合物的制備 將三氟乙酸(TFA) 390. 85g加入化合物(5)295. Og的二氯甲烷溶液中，室溫反應(yīng)18 小時(shí)。真空濃縮去除二氯甲烷，洗滌，真空下干燥兩次，得到結(jié)晶的式I化合物，合并產(chǎn)物為 192. 02g，收率為 76%。實(shí)施例1式I化合物對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用L02細(xì)胞(人肝細(xì)胞)按4Ε3-5Ε3個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)。式I化合 物分別稀釋為0 μ Μ，0. 5 μ Μ，5 μ Μ，50 μ Μ。誘導(dǎo)凋亡前L02細(xì)胞與式I化合物預(yù)孵育2小 時(shí)，對(duì)照組為只含有DMS0(0. 2% )，不含有肝細(xì)胞和式I化合物。然后分別加入25ng/ml TNF- α和2 μ g/ml放線菌素，培養(yǎng)18-24小時(shí)，加入MTT 10 μ 1/孔，孵育4小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μ 1，在492nm處讀值。見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，式I化合物可明顯抑制由TNF-α誘導(dǎo)的L02細(xì)胞凋亡，說(shuō)明式I化合 物對(duì)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。實(shí)施例2式I化合物對(duì)TNF- α誘導(dǎo)的L02細(xì)胞內(nèi)源PARP蛋白切割有抑制作用聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)是一種依賴Zn2+的真核DNA結(jié)合蛋白， 可特異性地識(shí)別DNA斷裂末端并結(jié)合，是一種重要的DNA修復(fù)酶。在細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期， PARP是caspase家族(如caspase 3和7)的作用底物，后者可使PARP的DNA修復(fù)功能喪 失。Caspase可將113kD的PARP水解為89kD和24kD的兩個(gè)片斷。本實(shí)施例主要是運(yùn)用抗 PARP抗體，用蛋白印跡法(western blotting)檢測(cè)PARP 89kD的裂解片斷以及113kD完整 的PARP蛋白，以作為細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志物。L02細(xì)胞按4E3-5E3個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)。式I化合物分別稀釋為 0 μ M，0. 5 μ M，5 μ M，50 μ M。誘導(dǎo)凋亡前L02細(xì)胞與式I化合物預(yù)孵育2小時(shí)，對(duì)照組為只 含有DMSO(0. 2% )，不含有肝細(xì)胞和式I化合物。然后分別加入25ng/ml TNF- α和2 μ g/ml放線菌素，培養(yǎng)18-24小時(shí)，收細(xì)胞制 備蛋白樣品，Westem-blot檢測(cè)凋亡蛋白PARP(購(gòu)自BD Pharmingen#556494)表達(dá)情況。見(jiàn) 圖2。 結(jié)果表明，式I化合物可明顯抑制由TNF- α激活的內(nèi)源PARP的蛋白剪切，說(shuō)明式 I化合物能夠抑制caspase的活性。實(shí)施例3式I化合物對(duì)L02細(xì)胞中TNF- α激活的內(nèi)源Caspase 3/7的活性有抑制作用L02細(xì)胞按4E3-5E3個(gè)/孔接種至96孔板，培養(yǎng)24小時(shí)。式I化合物從40 μ M開(kāi) 始對(duì)半稀釋至0. 15 μ Μ。每孔加入等體積式I化合物預(yù)孵育2小時(shí)，終體積為100 μ 1。對(duì) 照組為只含有DMS0(0. 2% )，不含有肝細(xì)胞和式I化合物。然后分別加入25ng/ml TNF-alpha和2 μ g/ml放線菌素，培養(yǎng)6小時(shí)，每孔加入 100 μ 1 caspase Glo 3/7試劑盒(購(gòu)自promega#G8091)室溫反應(yīng)1小時(shí)后，熒光分光光度 計(jì)檢測(cè)Iuciferase讀值，并計(jì)算IC50。見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，式I化合物可明顯抑制由TNF- α激活的內(nèi)源Caspse 3/7的活性，細(xì)胞水平的上式I化合物的IC50為5. 7nM。實(shí)施例4式I化合物體外caspase 3活性檢測(cè) 在96孔板中每孔加入含有caspase 3蛋白5ng，Ac-DEVD-AMC 1 μ Μ，溶于100 μ 1 酶反應(yīng)緩沖液(IOmM HEPES, IOOmM NaCl, 10% sucrose, ImM EDTA，0. 1% CHAPS, IOmM DTT)。 式I化合物用0. 5% DMSO溶液從1 X 10_5稀釋至5X IiT11M共12個(gè)點(diǎn)，加入到含上述物質(zhì)的 96板中。孵育1小時(shí)，用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)355nm，發(fā)射波長(zhǎng)460nm讀值，并計(jì)算 IC50。見(jiàn)圖 4。結(jié)果表明，式I化合物可明顯抑制caspase 3的酶活，對(duì)caspase 3 IC50為 220nM。實(shí)施例5式I化合物對(duì)撲熱息痛引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用撲熱息痛(Acetaminophen，APAP)可引起小鼠藥物性肝損傷，在這個(gè)模型中，小鼠 注射APAP可引起肝臟細(xì)胞的凋亡。式I化合物對(duì)APAP引起小鼠藥物性肝損傷具有保護(hù)作用。用雄性ICR小鼠，18-22克(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)，APAP購(gòu)自Sigma公司。式I化合物以pH8. 50. 05M Tris-HCl溶解后，再以0. IN HCl 調(diào)pH至7. 2，稀釋濃度為10mg/ml。將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、APAP模型組、式I化合物三個(gè)給藥組。 式I化合物給藥組動(dòng)物在給予APAP前1小時(shí)以及給毒后30分鐘口服式I化合物50mg/kg， 正常對(duì)照組和APAP模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物腹腔注射 APAP,劑量為400mg/kg，體積為20ml/kg，禁食過(guò)夜。給予APAP 16小時(shí)后將動(dòng)物斷頭處死， 取血，測(cè)定血清中ALT、AST含量(紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-754型)。結(jié)果表明，式I化合物在很低濃度時(shí)即能對(duì)APAP引起的肝損傷具有明顯的保護(hù)作 用。正常動(dòng)物腹腔注射APAP后，血清ALT、AST明顯升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異。 小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低APAP引起的小鼠血清ALT、AST水平，與模型組比 較有顯著性差異，結(jié)果見(jiàn)表1。表1式I化合物對(duì)APAP引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用 與模型組比較:**P< 0. 01 :***P < 0. 001實(shí)施例6式I化合物對(duì)Con-A誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用
已知Con-A可引起小鼠免疫性肝損傷，式I化合物對(duì)Con-A引起小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用。雄性ICR小鼠，體重18-22克(由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)， Con-A購(gòu)自Sigma公司。式I化合物，白色粉狀，以0. 05M Tris-HCl (ρΗ8· 5)溶解后，以0. IN HCl調(diào)ρΗ至7. 2，藥物濃度為10mg/ml。將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、Con-A模型組和式I化合物給藥組三個(gè) 組。式I化合物給藥組動(dòng)物在給予Con-A前7、1小時(shí)以及給予Con-A后30分鐘口服式I 化合物50mg/kg，正常對(duì)照組和Con-A模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組靜 脈注射Con-A，劑量為27mg/kg，體積為20ml/kg，禁食過(guò)夜。給予Con-A 16小時(shí)后將動(dòng)物斷 頭處死，取血，測(cè)定血清中ALT、AST水平(紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-754型)。小鼠口服式I化合物50mg/kg對(duì)Con-A誘發(fā)小鼠免疫性肝損傷有明顯的保護(hù)作 用。正常動(dòng)物靜脈注射Con-A后，血清ALT、AST明顯升高，與正常對(duì)照組比較有顯著性差異； 小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低Con-A引起的小鼠血清ALT、AST水平，與模型組 比較有顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)表2。表2式I化合物對(duì)Con-A引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用 與模型組比較廣P <0.001實(shí)施例7式I化合物對(duì)D-Galn/LPS誘導(dǎo)的肝衰竭的保護(hù)作用一次性大劑量注射D-Galn/LPS可引起小鼠肝衰竭，是本領(lǐng)域比較成熟的動(dòng)物肝 衰竭模型，可模擬肝細(xì)胞凋亡的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)選用雄性ICR小鼠，體重22-28克(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提 供)，D-Galn購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，式I化合物， 白色粉狀，溶于50mM Tris堿溶解后，藥物濃度為50mg/ml。AST, ALT試劑盒購(gòu)自南京建成 試劑公司。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組、D-Galn/LPS模型組和式I化合物給藥 組。式I化合物給藥組動(dòng)物在給毒后5分鐘給予一次性灌胃式I化合物50mg/kg，正常對(duì)照 組和LPS模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組腹腔注射D-Galn (800mg/kg)和 LPS(15ug/kg)，末次給藥6小時(shí)后將動(dòng)物眼眶取血，取肝臟。在肝臟同一葉的固定位置切取 肝組織，石蠟包埋，切片并進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡200倍下觀察各組織病理變化情況。離 心分離血清，測(cè)定血清中ALT、AST水平(紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-754型)。數(shù)據(jù)均采用SPSS 12. O軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較方差分析LSD檢驗(yàn)。等級(jí)資料組間比較采用ridit分析。結(jié)果見(jiàn)表3。表3式I化合物對(duì)D-Galn/LPS引起小鼠肝衰竭的保護(hù)作用 與對(duì)照組比較，Δ Δ :P < 0. 01 ；與模型組比較，“=P < 0. 01小鼠口服式I化合物(50mg/kg)對(duì)D-Galn/LPS誘發(fā)小鼠免疫性肝損傷有明顯的 保護(hù)作用。正常動(dòng)物靜脈注射D-Galn/LPS后，血清ALT、AST明顯升高，與正常對(duì)照組比較 有顯著性差異；小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低D-Galn/LPS引起的小鼠血清ALT、 AST水平，與模型組比較有顯著性差異。病理學(xué)檢查可見(jiàn)，正常小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)完整(見(jiàn)圖5)。模型組小 鼠肝組織出現(xiàn)彌漫性的大片壞死，細(xì)胞核溶解，肝索解離，肝竇網(wǎng)狀支架非完全塌陷。小葉 結(jié)構(gòu)模糊不清，小葉內(nèi)及匯管區(qū)可見(jiàn)大量散在的或灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖6)。藥物組(式 I化合物組)小鼠壞死灶較模型組明顯減少，炎細(xì)胞浸潤(rùn)的范圍及數(shù)量也明顯減輕(見(jiàn)圖 7)。該模型病理表現(xiàn)均符合肝衰竭診療指南中關(guān)于肝衰竭的特征。實(shí)施例8式I化合物能提高D-Galn/LPS致肝衰竭小鼠的存活率一次性大劑量注射D-Galn/LPS可引起小鼠肝衰竭，是本領(lǐng)域比較成熟的動(dòng)物肝 衰竭模型，可模擬肝細(xì)胞凋亡的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)選用25只雄性ICR小鼠，體重20_25克(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公 司提供)，D-Galn購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，式I化 合物，白色粉狀，溶于50mM Tris堿溶解后，藥物濃度為50mg/ml。AST，ALT試劑盒購(gòu)自南京 建成試劑公司。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組(5只)、D-Galn/LPS模型組(10只)和 式I化合物給藥組(10只)。式I化合物給藥組動(dòng)物在給毒后5分鐘給予一次性灌胃式I 化合物50mg/kg，正常對(duì)照組和LPS模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組腹腔 注射D-Galn (800mg/kg)和LPS (15ug/kg)，分別于末次給藥6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小 時(shí)觀察各組小鼠死亡情況。結(jié)果表明，小鼠口服式I化合物對(duì)D-Galn/LPS誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭有保護(hù)作用，并 大大提高了動(dòng)物的存活率。模型組在觀察時(shí)間點(diǎn)的死亡率分別為10%、40%、60%、80%。 而給藥組僅在12小時(shí)觀察到死亡2只，死亡率僅為20%。與模型組比較具有明顯差異。實(shí)施例9式I化合物對(duì)D-Galn/LPS誘導(dǎo)的肝衰竭的預(yù)防作用實(shí)驗(yàn)選用雄性ICR小鼠，體重20-25克(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供)，D-Galn購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，式I化合物， 白色粉狀，溶于50mM Tris堿溶解后，藥物濃度為50mg/ml。AST, ALT試劑盒購(gòu)自南京建成 試劑公司。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，分別為正常對(duì)照組、D-Galn/LPS模型組和式I化合物預(yù)防給藥組。式I化合物給藥組動(dòng)物在造模前1小時(shí)給予一次性灌胃式I化合物50mg/kg，正常對(duì) 照組和LPS模型組給予同體積賦形劑。除正常對(duì)照組外，各組腹腔注射D-Galn (800mg/kg) 和LPS(15ug/kg)，造模6小時(shí)后動(dòng)物眼眶取血，測(cè)定血清中ALT、AST水平(紫外可見(jiàn)分光 光度計(jì)，UV-754型)。小鼠口服式I化合物(50mg/kg)對(duì)D-Galn/LPS誘發(fā)小鼠肝衰竭有明顯的預(yù)防作 用。模型組靜脈注射D-Galn/LPS后，與正常組血清ALT (22. 99 士9. 39)、AST (44. 46 士4. 29) 相比顯著升高(P < 0. 01)，分別為207. 27士25. 12，115. 88士24. 37。給藥組ALT，AST分別 為150. 56士24. 14，80.43士 11. 13，與模型組比較有顯著性差異(P < 0.01)。結(jié)果表明，提 前給予小鼠口服式I化合物50mg/kg可明顯降低D-Galn/LPS引起的小鼠血清ALT、AST水 平，與模型組比較有顯著性差異。實(shí)施例10式I化合物對(duì)慢加急性大鼠肝衰竭模型的保護(hù)作用本發(fā)明建立了免疫誘導(dǎo)型肝硬化大鼠與D-氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)合急性攻擊，該 模型與人慢加急性肝衰竭(ACLF)形態(tài)學(xué)表現(xiàn)非常相似。此模型形成穩(wěn)定，容易復(fù)制，再現(xiàn) 了臨床上ACLF患者的全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，病理生理環(huán)節(jié)與人ACLF有共同之處，可用于臨 床藥物研究。實(shí)驗(yàn)選用雌性Wistar清潔級(jí)大鼠30只，體重120-150克(由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物有限責(zé)任公司提供)，20%人血清白蛋白(HSA) ,D-Galn均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有 限公司，LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。參照王寶恩(中華醫(yī)學(xué)雜志，1989,9 :503_505)等的方法復(fù)制大鼠肝硬化模型。除 留取5只大鼠為正常對(duì)照組外，其余大鼠HSA致敏后，予以尾靜脈注射HSA 2. 5_4mg，每周2 次。6周后挑取成模大鼠20只，隨機(jī)分為模型組10只和模型給藥組10只。給藥組動(dòng)物在 給予D-Galn/LPS后5分鐘給予一次性灌胃式I化合物50mg/kg。除正常對(duì)照組外，各組腹 腔注射D-Galn (400mg/kg)和LPS (100ug/kg)，于給藥后8小時(shí)將動(dòng)物眼眶取血，測(cè)定血清中 ALT、AST水平(紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV-754型)。大鼠口服式I化合物(50mg/kg)對(duì)大鼠慢加急性肝衰竭有明顯保護(hù)作用。模型 組靜脈注射D-Galn/LPS后，與正常組血清ALT (65. 3士24. 89)、AST (87. 8士 18. 22)相比較 有顯著升高(P <0.01)，分別為484. 9士61. 05，883. 6士221. 57。給藥組ALT，AST分別為 233. 8士43. 46，392. 8士41. 66，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0.01)。結(jié)果表明，小鼠口 服式I化合物50mg/kg可明顯降低慢加急性肝衰竭大鼠血清ALT、AST水平，與模型組比較 有顯著性差異。實(shí)施例11灌胃給予式I化合物對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)根據(jù)化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則(HGPT1_1 2005，3)，進(jìn)行小鼠的急性 毒性試驗(yàn)，觀察灌胃給予式I化合物對(duì)小鼠的急性毒性。實(shí)驗(yàn)選用KM小鼠(由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，實(shí)驗(yàn)前在恒溫室(20士3°C)飼養(yǎng)適應(yīng)，選出生長(zhǎng)正常的健康動(dòng)物，雌雄 各10只，6-8周齡，體重18-22g。式I化合物用Tris-HCL緩沖液配成濃度60mg/ml溶液， 健康小鼠20只，雌雄各10只，按最大可注射容量50ml/kg(體重)灌胃給藥。觀察動(dòng)物給 藥后的毒性反應(yīng)及死亡情況。毒性反應(yīng)重點(diǎn)觀察癥狀、程度，毒性反應(yīng)起始時(shí)間、持續(xù)時(shí)間 及恢復(fù)時(shí)間等，觀察期14天。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明式I化合物具有低毒性，死亡動(dòng)物經(jīng)尸檢肉眼未見(jiàn)明顯病 理改變。結(jié)果表明灌胃給予式I化合物對(duì)小鼠的LD50 > 3000mg/kg。實(shí)施例12靜脈注射式I化合物對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)根據(jù)化學(xué)藥物急性毒性試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則(HGPT1_1 2005，3)，進(jìn)行小鼠的急 性毒性試驗(yàn)，觀察式I化合物靜脈注射對(duì)小鼠的急性毒性。實(shí)驗(yàn)選擇KM小鼠，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供提供，實(shí)驗(yàn)前在恒溫室 (20士3°C)飼養(yǎng)適應(yīng)，選出生長(zhǎng)正常的健康動(dòng)物，雌雄各25只，6-8周齡，體重18-22g。健 康小鼠50只，雌雄分別按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，按20ml/kg (體重)的 容量iv給藥，各組小鼠的給藥劑量分別為1020、714、500、350、245mg/kg。(相應(yīng)給藥濃度 分別為 51. 0,35. 7,25. 0,17. 5 和 12. 3mg/ml)。用 Bliss 法計(jì)算 LD50 及其 95%可信限。觀 察動(dòng)物給藥后的毒性反應(yīng)及死亡情況。毒性反應(yīng)重點(diǎn)觀察癥狀、程度，毒性反應(yīng)起始時(shí)間、 持續(xù)時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間等。觀察期14天。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明式I化合物具有低毒性，死亡動(dòng)物經(jīng)尸檢肉眼未見(jiàn)明顯病 理改變。結(jié)果表明靜脈注射式I化合物對(duì)小鼠的LD50為> 600mg/kg。以上所述僅為本發(fā) 明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范 圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù) 實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將 被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
一種如式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其藥物前體的用途，其特征在于，所述的化合物用于制備肝細(xì)胞凋亡抑制劑。F2009100479636C0000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是肝細(xì)胞中Caspase的抑制劑。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑用于肝細(xì)胞凋亡引起的肝損傷。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的肝損傷是肝衰竭。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是肝損傷治療劑。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、亞急性 肝衰竭治療劑、慢加急性肝衰竭治療劑、和/或慢性肝衰竭治療劑。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑是急性肝衰竭治療劑、和/或 慢加急性肝衰竭治療劑。
8.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑用于預(yù)防和/或治療肝損傷和 /或肝衰竭。
9.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝細(xì)胞是人肝細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑選自片劑、膠囊、散劑、顆粒 劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無(wú)菌粉末、或栓劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酰胺類化合物的新用途。所述的酰胺類化合物是如式I所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其藥物前體，所述的化合物用于制備肝細(xì)胞凋亡抑制劑。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101836973SQ20091004796
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者吳駿, 張慧, 束放, 羅楹, 顧翠萍 申請(qǐng)人:上海睿星基因技術(shù)有限公司