一種基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的方法，包括基于近紅外光譜分析技術建立用于人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程中HA含量測定模型的步驟，建立用于pH值測定模型的步驟，以及利用上述建立的模型對人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的HA含量和pH進行過程測定的步驟。本發(fā)明的方法能夠有效實現(xiàn)人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程中HA含量和pH值的過程測定，以便根據(jù)HA的含量變化即時調整加醋酸緩沖液的速率并可準確及時的判斷反應終點。
【專利說明】
一種基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉 淀過程的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程 的方法。
【背景技術】
[0002] 人血白蛋白（HA)是人體血漿中含量最高的蛋白質，占血漿蛋白的40%-60%。說在 臨床用于治療各種疾病，包括低血容量癥、低白蛋白血癥、休克、燒傷、手術失血、創(chuàng)傷、慢性 肝病、營養(yǎng)支持、危重患者復蘇等。由于HA大多從人血漿中分離得到，原料來源匱乏，在市場 常出現(xiàn)供不應求的狀況。
[0003] 目前HA的生產(chǎn)基本采用低溫乙醇法從人血漿中分離，由于HA的工業(yè)化生產(chǎn)中投入 的血漿數(shù)量巨大(一般以噸計量），反應罐的容積也很大，巨大的體積給乙醇濃度、pH調節(jié)和 HA含量的測定帶來了很多技術上的難點，而且終點pH值確定需要在乙醇含量低于10%的條 件下用pH計在室溫條件測定。因而在實際工業(yè)生產(chǎn)過程多采用離線的方式進行監(jiān)測和判斷 反應終點，大大降低了生產(chǎn)效率。并且離線方式滯后于生產(chǎn)過程，嚴重制約了 HA收率的提高 和產(chǎn)品質量的提升。
[0004] 近紅外光譜分析技術(NIRS)經(jīng)過近些年的發(fā)展，目前已廣泛應用于石油化工、制 藥和煙草等領域，并取得了良好的經(jīng)濟效益。但國內外還未見近紅外光譜分析技術在監(jiān)測 人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程或建立相關模型方面的報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的是提供一種基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血 白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的方法，本發(fā)明的方法能夠有效實現(xiàn)人血白蛋白醋酸緩沖液沉 淀過程中HA含量和pH值的過程測定，以便根據(jù)HA的含量變化即時調整加醋酸緩沖液的速率 并可準確及時的判斷反應終點(pH值達到4.6-4.7間，即白蛋白等電點時為反應終點），提高 了生產(chǎn)效率。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案：
[0007] 本發(fā)明所提供的基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程 的方法，包括如下步驟：
[0008] (1)建立模型用于HA含量的測定：
[0009] A模擬不同批次人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程并取樣，采集樣品的原始近紅外 光譜，并采用常規(guī)方法對樣品中HA含量進行檢測，得離線指標成分化學測定值；
[0010] B將步驟A的樣品劃分為校正集和驗證集，對樣品光譜進行預處理，然后比較不同 變量選擇方法對建模結果的影響，選擇參與建模的變量，建立PLSR模型用于HA含量的測定； [0011] c采用驗證集的樣品驗證模型的預測能力；
[0012] (2)建立模型用pH值的測定：
[0013] A模擬不同批次人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程并取樣，采集樣品的原始近紅外 光譜，并采用常規(guī)方法對樣品中乙醇含量進行檢測，并根據(jù)測定結果配制乙醇含量為10% 的樣品，測定樣品的pH值；
[0014] B將步驟A的樣品劃分為校正集和驗證集，對樣品光譜進行預處理，并對建模區(qū)間 進行考察，建立PLSR模型用于pH值的測定；
[0015] C采用驗證集的樣品驗證模型的預測能力；
[0016] (3)利用步驟（1)和步驟(2)建立的模型對人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的HA含 量和pH進行過程測定。
[0017] 上述方法，步驟（1)中，所述模擬不同批次人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程并取 樣，具體方法為:每一批次的醋酸緩沖液的加入方法為:每4min加一次醋酸緩沖液，前9次每 次加0.2mL，后6次每次加0.8mL，每次加醋酸緩沖液前取樣lmL并離心處理;模擬至少8個批 次。
[0018] 上述方法，步驟（1)中，以Antaris Π傅里葉變換近紅外光譜儀采集光譜，近紅外 光譜的采集條件為:光譜分辨率為8CHT1，掃描次數(shù)為32，光譜范圍為10000-4000cnf1。
[0019]上述方法，步驟（1)中，所述建立PLSR模型用于HA含量的測定的過程中，引入縮小 濃度區(qū)間的思想，去除HA含量變化不明顯且對模型應用作用較小的樣品點，保留含量變化 趨勢大的樣品建立模型，從而提高了模型的準確性和有效性。
[0020] 優(yōu)選的，參與建模的樣品為每個批次的前11個取樣點，HA的含量范圍為1.22-13.00g/L〇
[0021] 上述方法，步驟(1)中，所述樣品光譜預處理的方法優(yōu)選為一階導數(shù)SG21點平滑和 均值中心化。
[0022] 上述方法，步驟（1)中，所述選擇參與建模的變量的具體方法為：以RMSECV+RMSEP 值作為模型的評價指標，考察相關系數(shù)法（CC)、連續(xù)投影法（SPA)、無信息變量消除法 (UVE)、競爭自適應加權法(CARS)、穩(wěn)定性競爭自適應加權法（SCARS)、前向偏最小二乘法 (FiPLS)、移動窗口偏最小二乘法(麗PLS)、反向偏最小二乘法(BiPLS)以及不同方法與SPA 聯(lián)用法對建模結果的影響，最終優(yōu)選的變量選擇方法為:基于與SPA聯(lián)用的方法，選擇參與 建模的變量為35個。
[0023]上述方法，步驟（2)中，所述模擬不同批次人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程并取 樣，具體為:模擬了 6批次醋酸緩沖液沉淀過程，得到74個pH值在4.50-5.55間的樣品。
[0024]上述方法，步驟（2)中，將樣品劃分為校正集和驗證集的劃分方法包括隨機(RS) 法、含量梯度法、KS法、SPXY法和Dup 1 er法;優(yōu)選的，劃分方法為Dup 1 ex法，選擇的校正集樣 品49個，驗證集樣品25個。
[0025] 上述方法，步驟(2)中，所述樣品光譜預處理的方法包括:正交信號校正(0SC)、一 階導數(shù)SG15點平滑、二階導數(shù)SG15點平滑、0SC+-階導數(shù)SG15點平滑、0SC+二階導數(shù)SG15點 平滑、一階導數(shù)SG15點平滑+0SC、二階導數(shù)SG15點平滑+0SC。
[0026] 優(yōu)選的，所述樣品光譜預處理的方法為一階導數(shù)SG15點平滑+0SC。
[0027] 上述方法，步驟（2)中，考察出參與建模的光譜區(qū)間為4613-4000(^-1、6538-5404cm-1、10000-73550^ 1。
[0028]需要說明的是，NIRS是一種間接測定技術，一級樣品的線性關系對于模型結果具 有很大的影響，本發(fā)明所使用的樣品，其一級數(shù)據(jù)穩(wěn)定測定的難度大，為相應模型的建立帶 來了一定的難度;而且，蛋白質結構復雜，在整個近紅外光譜區(qū)都有吸收，因而造成特征區(qū) 間的選擇較為困難;此外，生理鹽水在近紅外光譜區(qū)域具有強烈的吸收，會掩蓋其他物質的 光譜信息，因此，有效信息的提取也是模型建立的關鍵問題。
[0029] 所采集的近紅外光譜的原始譜圖中包含的并不都是有用的信息，為了保證對樣品 光譜的分辨，光譜的數(shù)據(jù)一般有數(shù)百到數(shù)千個數(shù)據(jù)點，但譜區(qū)中各個數(shù)據(jù)點包含的信息是 不相同的，需要對光譜進行預處理，以及運用算法壓縮光譜數(shù)據(jù)，在全光譜中選擇部分譜區(qū) 用于建立數(shù)學模型。而且基于物質的化學、物理結構的信息以及對光譜儀器的要求，光譜的 區(qū)間進行考察是很有必要的，并不是隨意選擇的。建立數(shù)學模型需要通過具體的試驗進行 考察，不斷的進行參數(shù)篩選，參數(shù)優(yōu)化，才能獲得穩(wěn)定性和可靠性都比較好的模型。
[0030] 基于此，本發(fā)明所建立的用于HA含量的測定模型和用于pH值測定的模型，由于樣 品本身的性質為相應近紅外光譜模型的建立所帶來的難度，以及模型建立過程中，對于光 譜預處理方法、光譜波段的選擇方法、不同變量選擇方法，等等，都需要技術人員根據(jù)實際 樣品體系進行多方面多角度考察，這一過程所存在的難度遠超出本領域技術人員常規(guī)選擇 的范疇。
[0031] 本發(fā)明的有益效果：
[0032] 本發(fā)明首次利用近紅外光譜分析技術建立了一種監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉 淀過程的方法。能夠有效實現(xiàn)人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程中HA含量和pH值的過程測 定，并可在過程中根據(jù)HA含量變化即時調整加醋酸緩沖液速率并準確及時的判斷反應終 點，提尚了生廣效率。
【附圖說明】
[0033] 圖1為HA含量測定模型建立中測得的醋酸緩沖液沉淀過程原始近紅外光譜圖； [0034]圖2為參與HA含量測定模型建立的變量；
[0035]圖3為HA含量預測值和參考值對比圖；
[0036] 圖4為pH值定量測定模型建立中測得的醋酸緩沖液沉淀過程原始近紅外光譜圖；
[0037] 圖5為參與pH值定量測定模型建立的變量；
[0038]圖6為pH值預測值和參考值對比圖。
【具體實施方式】
[0039]結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內容進行限定。
[0040] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)渠道得到。
[0041] 實施例1:用于HA含量的測定模型的建立
[0042] (1)醋酸緩沖液沉淀過程:取100mL FIV壓濾后上清液（山東泰邦生物制品有限公 司提供)置于圓底燒瓶中，然后將圓底燒瓶置于溫度恒定的低溫反應儀中；過程開始前取樣 lmL然后開始滴加醋酸緩沖液，醋酸緩沖液的加入方式為前9次每次加0.2mL，后6次每次加 0.8mL;過程中每4min加一次醋酸緩沖液并取樣lmL并做離心處理，一共重復8個批次。近紅 外光譜的采集:Antaris II傅里葉變換近紅外光譜儀的透射模塊進行原始近紅外光譜的采 集。光程4mm，光譜范圍lOOOO-^OOcnf1，分辨率為8CHT1，掃描次數(shù)32;每小時進行一次背景 的采集，以空氣作為參考。HA含量的測定:HA含量的測定方法為BCG法，采用市售的試劑盒進 行測定。
[0043] (2)引入縮小濃度區(qū)間的思想，即將HA含量變化不明顯且對模型應用作用較小的 樣品點去掉，保留含量變化趨勢大的樣品建立模型，從而提高模型的準確性和有效性。優(yōu)選 的建模樣品為每個批次的前11個取樣點，HA的含量范圍為1.22-13.00g/L。表1為全樣品建 模和局部樣品建模結果對比，由表1可以看出，局部樣品建模的準確性和有效性得到明顯的 提尚。
[0044] 光譜經(jīng)過一階導數(shù)SG 21點平滑和均值中心化的處理后采用多種變量選擇方法選 擇參與建模的變量，表2為不同變量選擇方法，其中基于與SPA聯(lián)用是指CC-SPA、UVE-SPA、 起來。以RMSECV+RMSEP值作為模型的評價指標，其值越小說明模型越好。結果顯示BiPLS-SPA得到最小結果，但模型存在過擬合現(xiàn)象，因此基于與SPA聯(lián)用法選擇的35個變量建模得 到了最佳的模型結果，模型的 Rc；2、RP2、RMSEC、RMSECV、RMSEP分別為0.977、0.978、0.5971g/ L、0.7038g/L、0.5893g/L。
[0045] 表1全樣品和局部樣品建模結果比較
[0047] 表2不同變量選擇方法建模對比
[0048]
[0049] (3)以3個批次的驗集樣品考察模型的預測能力，利用配對t檢驗進行統(tǒng)計學分析。 由表3配對t檢驗統(tǒng)計結果可知，NIRS法與傳統(tǒng)的BCG法得到的結果的均值和標準差非常接 近，在95%的置信限下得到的P = 0.374>0.05,說明兩種方法測定結果之間不存在顯著性差 異，NIRS法可替代傳統(tǒng)方法進行醋酸緩沖液沉淀過程HA含量的快速測定。
[0050] 表3驗證集樣品配對t檢驗統(tǒng)計結果
[0052]實施例2:用于pH值測定模型的建立
[0053] (1)醋酸緩沖液沉淀過程:模擬6批醋酸緩沖液沉淀過程，除第6批外其它5批酸沉 的步驟和實施例1(1)中的過程保持一致。第6批中在加酸13次后每次補加乙醇lml，共補加2 次，其余條件和前5批均一致。每次取樣1.2ml并做離心處理。原始近紅外光譜采集條件和實 施例1(1)中相同，氣相色譜法測定樣品乙醇含量，根據(jù)含量配制乙醇為10% (體積分數(shù)）的 樣品，pH計測定樣品的pH值。共得到74個樣品的pH值，用于定量模型的建立，表4為樣品pH值 信息表。
[0054] 表4樣品pH值信息表
[0056] (2)為得到最優(yōu)的樣品集劃分結果，考察了隨機(RS)法、含量梯度法、KS法、SPXY 法、Duplex法等樣品集劃分方法對模型的影響，表5為樣品集劃分信息，表6為不同樣品集劃 分方法建模結果，以RMSEP值作為模型評價指標，最終選擇的最佳樣品集劃分方法為 Duplex，得到校正集49個樣品和驗證集25個樣品。
[0057]表5樣品集劃分信息表
[0059]表6不同樣品集劃分方法建模結果

[0061]在全波段范圍內對光譜預處理方法進行考察，對比了 0SC、一階導數(shù)SG15點平滑、 二階導數(shù)SG15點平滑對建模結果的影響，表7為不同預處理后得到的建模結果，以RMSEP值 作為模型評價指標，優(yōu)選出的最佳預處理方法為一階導數(shù)SG15點平滑+0SC。
[0062] 表7不同預處理方法處理后建模結果
[0064]為得到最佳的建模區(qū)間，對樣品光譜和背景光譜以及光譜的吸光度進行了考察， 去除生理鹽水的背景光譜范圍為:5400-5200〇1^和7350-6950011'考察的最佳光譜吸光度 范圍為0.63-2.88。最終，選擇用于建模的三個光譜區(qū)間為4613-4000011-^6538-5404(^-^ 10000-7355cm-S 模型參數(shù)為 Rc2 = 0.968，RP2 = 0.956，RMSEC = 0.0512，RMSECV = 0.0875， RMSEP = 0.0594。
[0065] (3)以驗證集中25個樣品對模型的預測能力進行驗證，表8為配對t檢驗的統(tǒng)計學 結果，可見pH計測定結果的平均值和NIRS得到的結果均值相同。在95%的置信限下，P = 0.847>0.05,說明pH計的測定結果和近紅外模型測定的結果沒有顯著性差異，證實了 NIRS 用于酸沉過程pH值測定的有效性。
[0066] 表8配對t檢驗統(tǒng)計結果
[0068] 實施例1和實施例2表明，本發(fā)明建立的用于HA含量測定的模型和用于pH值測定的 模型準確、可靠，能夠有效實現(xiàn)人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程中HA含量和pH值的過程測 定。
[0069] 上述雖然結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范 圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。
【主權項】
1. 一種基于近紅外光譜分析技術監(jiān)測人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的方法，其特征 在于，包括如下步驟： (1) 建立模型用于HA含量的測定： A、 模擬不同批次人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程并取樣，采集樣品的原始近紅外光 譜，并采用常規(guī)方法對樣品中HA含量進行檢測，得離線指標成分化學測定值； B、 將步驟A的樣品劃分為校正集和驗證集，對樣品光譜進行預處理，然后比較不同變量 選擇方法對建模結果的影響，選擇參與建模的變量，建立PLSR模型用于HA含量的測定； C、 采用驗證集的樣品驗證模型的預測能力； (2) 建立模型用pH值的測定： A、 模擬不同批次人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程并取樣，采集樣品的原始近紅外光 譜，采用常規(guī)方法對樣品中乙醇含量進行檢測，并根據(jù)測定結果配制乙醇含量為10%的樣 品，測定樣品的pH值； B、 將步驟A的樣品劃分為校正集和驗證集，對樣品光譜進行預處理，并對建模區(qū)間進行 考察，建立PLSR模型用于pH值的測定； C、 采用驗證集的樣品驗證模型的預測能力； (3) 利用步驟（1)和步驟(2)建立的模型對人血白蛋白醋酸緩沖液沉淀過程的HA含量和 pH進行過程測定。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，所述建立PLSR模型用于HA含量的 測定的過程中，引入縮小建模區(qū)的思想，去除HA含量變化不明顯且對模型應用作用較小的 樣品點，保留含量變化趨勢大的樣品建立模型。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，所述建立PLSR模型用于HA含量的 測定的過程中，參與建模的樣品為每個批次的前11個取樣點，HA的含量范圍為1.22-13.00g/L〇4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述樣品光譜預處理的方法為一 階導數(shù)SG21點平滑和均值中心化。5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，變量選擇方法為:基于與SPA聯(lián)用 的方法，選擇參與建模的變量為35個。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述模擬不同批次人血白蛋白醋 酸緩沖液沉淀過程并取樣，具體為:模擬6批次醋酸緩沖液沉淀過程，得到74個pH值在4.50-5.55間的樣品。7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，樣品集的劃分方法為隨機法、含 量梯度法、KS法、SPXY法和Dup 1 ex法中的至少一種，優(yōu)選為Dup 1 ex法。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，所述樣品光譜預處理的方法為 0SC、一階導數(shù)SG15點平滑、二階導數(shù)SG15點平滑、0SC+-階導數(shù)SG15點平滑、0SC+二階導數(shù) SG15點平滑、一階導數(shù)SG15點平滑+0SC和二階導數(shù)SG15點平滑+0SC中的至少一種。9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述樣品光譜預處理的方法為一 階導數(shù)SG15點平滑+0SC。10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，考察出參與建模的光譜區(qū)間為 4613-40000^1、6538-54040^ 1、10000-7355^^1。
【文檔編號】G01N21/359GK106018336SQ201610640261
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月5日
【發(fā)明人】臧恒昌, 龐廣禮, 王斐, 仲立軍, 李 燦, 張惠, 王佳月, 范加金, 王鳴宇
【申請人】山東大學