一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法，所述檢測應(yīng)用方法包括如下步驟：S1.標(biāo)準(zhǔn)樣品光譜集的建立：采用微型便攜式近紅外光譜儀于田間直接探測讀取感染柑桔黃龍病病菌和不帶黃龍病病菌柑桔植株葉片的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)；S2.定性分類判別模型的建立：將S1中的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和預(yù)處理后，分別提取其近紅外光譜學(xué)的特征值，經(jīng)訓(xùn)練集訓(xùn)練和驗(yàn)證集驗(yàn)證后得到最優(yōu)的PLS?DA定性分類判別模型；S3.未知樣品的定性判別：用S2建立的最優(yōu)的PLS?DA定性分類判別模型于田間直接區(qū)分待測柑桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病，單一植株僅需現(xiàn)場掃描3～5個(gè)葉片，耗時(shí)僅需1～2 min，便可實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)確診。本發(fā)明方法可進(jìn)行柑桔黃龍病的田間快速診斷，操作簡便，快速準(zhǔn)確，對(duì)樣本不產(chǎn)生任何損傷，并對(duì)環(huán)境友好。
【專利說明】
一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及果樹病害田間的快速診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種柑桔黃龍病的 近紅外光譜田間檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)，是柑桔上的一種毀滅性病害，自20世 紀(jì)初柑桔黃龍病在我國華南地區(qū)被首次報(bào)道以來，該病害已成為制約世界柑桔產(chǎn)業(yè)健康發(fā) 展的最重要因素之一。柑桔植株一旦感染柑桔黃龍病，輕者影響柑橘的產(chǎn)量和品質(zhì)，重者則 造成柑桔植株的直接死亡，堪稱柑桔產(chǎn)業(yè)上的"癌癥"（Bove，2006; Gr叫a,2015)。
[0003] 黃龍病病樹的正確診斷和鑒定是生產(chǎn)上正確防治柑桔黃龍病的前提，因此掌握快 速而有效的柑桔黃龍病診斷與檢測技術(shù)，對(duì)及時(shí)發(fā)現(xiàn)柑桔黃龍病并采取相應(yīng)的措施積極防 治柑桔黃龍病具有重要實(shí)踐意義。PCR檢測技術(shù)是目前最有效的診斷技術(shù)，但是其僅限于在 具備有一定設(shè)備條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，而且需要熟練的技術(shù)人員，檢測成本高昂，不適合進(jìn) 行田間大規(guī)模的排查（張利平，2009)。目前已有的田間直接診斷方法有：田間癥狀診斷法 (張名福等，1998;田亞南等，1999)，碘染色法(張利平等，2009)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法 (黃麗等，2012)，近紅外光譜法等(劉燕德等2016)。田間癥狀診斷雖然快速簡便，但是黃龍 病的田間癥狀復(fù)雜多變，不同的生長季節(jié)在葉片、果實(shí)和植株上表現(xiàn)不同，且其癥狀易與柑 桔衰退病、缺素癥、天牛為害和除草劑藥害相互混淆，給病害的準(zhǔn)確診斷鑒定造成困難 (Bove，2006);碘染色法則特異性較差，準(zhǔn)確度低，同樣不適合進(jìn)行柑桔黃龍病的田間早期 診斷(張利平等，2009);環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法的原理基本與PCR檢測方法相同，需要先 進(jìn)行復(fù)雜的前處理，并需要熟練的技術(shù)人員（孔德英等，2013);而現(xiàn)有報(bào)道的近紅外光譜法 是將柑桔葉片樣本采集回到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，再利用大型的傅里葉光譜儀進(jìn)行分析，對(duì)不同類型 柑桔葉片的光譜特征解釋有較大意義，并從理論上明確了近紅外光譜應(yīng)用于柑桔黃龍病的 診斷是可行的（劉燕德等，2016);但現(xiàn)有報(bào)道并沒有涉及該方法的田間應(yīng)用技術(shù)，特別是沒 有涉及光譜數(shù)據(jù)的田間采集方法，難以適應(yīng)于柑桔黃龍病的田間大規(guī)?？焖僭\斷。因此，生 產(chǎn)上依然急需一種簡單易行，果農(nóng)可以快速掌握，適合于田間大規(guī)模應(yīng)用的柑桔黃龍病快 速診斷技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢 測方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法，具體包括以下步驟：
[0007] S1.標(biāo)準(zhǔn)樣品光譜集的建立:采用微型便攜式近紅外光譜儀于田間直接探測讀取 感染柑桔黃龍病病菌和不帶黃龍病病菌柑桔植株葉片的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)；
[0008] S2.定性分類判別模型的建立:將S1中的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和預(yù)處理后， 分別提取其近紅外光譜學(xué)的特征值，經(jīng)訓(xùn)練集訓(xùn)練和驗(yàn)證集驗(yàn)證后得到最優(yōu)的PLS-DA定性 分類判別模型；
[0009] S3.未知樣品的定性判別：用S2建立的最優(yōu)的PLS-DA定性分類判別模型于田間直 接區(qū)分待測柑桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病。
[0010] 本發(fā)明的方案，針對(duì)單一植株僅需現(xiàn)場掃描3~5個(gè)葉片，耗時(shí)僅需1~2min，便可 實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)確診。
[0011] 作為優(yōu)選實(shí)施方式，微型便攜式近紅外光譜儀探測讀數(shù)的部位為葉片背面的主葉 脈，葉齡為當(dāng)年生或上年生的秋稍成熟葉片。
[0012] 為了讓該模型很好的將感染柑桔黃龍病柑桔葉片樣本與不帶菌柑桔葉片樣本進(jìn) 行正確歸類。PLS-DA模型評(píng)價(jià)參數(shù)包括:決定系數(shù)(R 2)、預(yù)測誤差均方根(RMSEP)和交互驗(yàn) 證均方根(RMSECV)。建立PLS-DA定性分類判別模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：（1)決定系數(shù)R 2值越接近 于1，表示所建立模型的預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性越好；⑵預(yù)測誤差均方根(RMSEP)值 越小，則能夠表明試驗(yàn)結(jié)果和真實(shí)值越接近，并說明所建模型的預(yù)測精度越高；（3)交互驗(yàn) 證均方根(RMSECV)作為主成分選擇的主要依據(jù)，一般選在RMSECV值最低處對(duì)應(yīng)的主成分?jǐn)?shù) 作為最佳主成分?jǐn)?shù)；（4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，預(yù)測精度越高。
[0013] 優(yōu)選地，步驟S1所述的微型便攜式近紅外光譜儀采用的圖譜采集軟件為 MicroNIRl.5.7,測量時(shí)間（典型值)為0.5s，測量波長范圍為950~1650nm，采集背景為鋼 板，光源采集直徑為16mm。
[0014] 優(yōu)選地，步驟S2并利用移動(dòng)窗口擬和多項(xiàng)式平滑法（Sav i t zky-Go 1 ay，SG)消除噪 聲對(duì)光譜信號(hào)的影響，同時(shí)進(jìn)行一階求導(dǎo)以消除基線漂移和背景影響，采用隨機(jī)樣本劃分 法(RS)劃分出為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。
[0015] 優(yōu)選的，所述訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中的柑桔葉片光譜學(xué)數(shù)據(jù)樣本均從標(biāo)準(zhǔn)樣品光譜集 中選取。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0017] 本發(fā)明以田間采集的柑桔葉片近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，建立能對(duì)柑桔黃龍病進(jìn) 行定性分類判別的判別模型，建立一種柑桔黃龍病的近紅外光譜學(xué)快速無損檢測方法，以 實(shí)現(xiàn)柑桔黃龍病的田間早期、準(zhǔn)確以及快速無損診斷。相比目前常用的PCR檢測技術(shù)，本發(fā) 明不需要在具備有一定設(shè)備條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，可以直接在田間進(jìn)行，每個(gè)樣本的相對(duì) 檢測成本低廉，而且還可以極大縮短生產(chǎn)上柑桔黃龍病的檢測周期，單一植株僅需現(xiàn)場掃 描3~5個(gè)葉片，耗時(shí)僅需1~2min，便可實(shí)現(xiàn)快速實(shí)時(shí)確診，有利于進(jìn)行柑桔黃龍病的田間 大規(guī)模排查。另外，本發(fā)明采用物理光譜學(xué)實(shí)現(xiàn)柑桔黃龍病的田間快速診斷，還可以對(duì)樣本 不產(chǎn)生任何損傷，并對(duì)環(huán)境友好。
【附圖說明】
[0018] 圖1為不同柑桔葉片樣本的MicroNIR原始光譜。
[0019] 圖2為最優(yōu)PLS-DA模型的預(yù)測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例 只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特 殊說明，均為常規(guī)方法;所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑 和材料。
[0021] 實(shí)施例1
[0022]本實(shí)施例采用MicroNIR微型便攜式近紅外光譜儀直接于田間直接探測讀取待測 砂糖桔葉片的光譜學(xué)數(shù)據(jù)，并同時(shí)應(yīng)用偏最小二乘判別(PLS-DA)模型進(jìn)行定性分類判別， 以區(qū)分待測砂糖桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病。
[0023] 1、砂糖桔葉片標(biāo)準(zhǔn)樣品光譜集的建立:不帶菌砂糖桔葉片樣本與感染柑桔黃龍病 砂糖桔葉片樣本的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)均通過微型近紅外光譜儀（Mi croNIR 17003?6〇讓〇1116七6〇進(jìn)行采集，圖譜采集軟件為聽(^(^11?1.5.7，測量時(shí)間（典型值）為 〇. 5s，測量波長范圍為950~1650nm，將吸收率低、折射率和反射率相對(duì)較好的鋼板作為采 集背景。每個(gè)樣本取3點(diǎn)進(jìn)行掃描，并取其平均值作為砂糖桔葉片標(biāo)準(zhǔn)樣品光譜集中每個(gè)樣 本的原始近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)。
[0024] 2、柑桔黃龍病定性分類判別模型的建立:利用The Unscrambler 9.8分析軟件，結(jié) 合偏最小二乘判別(PLS-DA)法建立柑桔黃龍病病葉定性分類判別模型，并利用移動(dòng)窗口擬 和多項(xiàng)式平滑法(Savitzky-G〇lay，SG)消除噪聲對(duì)光譜信號(hào)的影響，同時(shí)進(jìn)行一階求導(dǎo)以 消除基線漂移和背景影響。采用隨機(jī)樣本劃分法(RS)將分別將感染柑桔黃龍病柑桔葉片樣 本與不帶菌柑桔葉片樣本的原始近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)劃分出為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，染病柑桔葉 片樣本121個(gè)，其中訓(xùn)練集101個(gè)，驗(yàn)證集20個(gè);不帶菌柑桔葉片樣本176個(gè)，其中訓(xùn)練集133 個(gè)，驗(yàn)證集43個(gè)。PLS-DA定性分類判別模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：（1)決定系數(shù)R 2值越接近于1，表 示所建立模型的預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性越好；（2)預(yù)測誤差均方根(RMSEP)值越小， 則能夠表明試驗(yàn)結(jié)果和真實(shí)值越接近，并說明所建模型的預(yù)測精度越高；（3)交互驗(yàn)證均方 根(RMSECV)作為主成分選擇的主要依據(jù)，一般選在RMSECV值最低處對(duì)應(yīng)的主成分?jǐn)?shù)作為最 佳主成分?jǐn)?shù)；（4)RMSEP和SEP值越接近且越小代表模型性能越佳，預(yù)測精度越高。根據(jù)以上 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)SG -階導(dǎo)數(shù)7點(diǎn)平滑時(shí)，其R2 = 0.970317，RMSEP = 0.080198，SEP = 0.074656,相對(duì)其它組合的預(yù)測結(jié)果更能滿足模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。所以將經(jīng)過SG-階導(dǎo)數(shù)7點(diǎn)平 滑預(yù)處理后所建的模型作為最優(yōu)PLS-DA預(yù)測模型，主成分15為最佳參數(shù)。PLS-DA模型建立 過程中，為了決定樣本種類歸屬，通常需要對(duì)訓(xùn)練集賦予分類變量(Y)，Y矩陣必須描述特定 種類的樣品，一般可以用"Γ和"〇"來表示樣本屬于某一類或者不屬于某一類，然后通過設(shè) 定一個(gè)臨界值來判定歸屬。圖2為最優(yōu)PLS-DA模型的預(yù)測結(jié)果，從圖中可以看出，該模型很 好的將感染柑桔黃龍病柑桔葉片樣本與不帶菌柑桔葉片樣本進(jìn)行了正確歸類。經(jīng)計(jì)算，其 驗(yàn)證集分類準(zhǔn)確率高達(dá)100%，表明該模型的預(yù)測準(zhǔn)確度足以滿足后期田間待測樣本的定 性分類判別要求。
[0025]決定系數(shù)(R2):
①
[0027]交互驗(yàn)證均方根（root-mean-squares error of cross_validation，RMSCEV)
②
[0029]預(yù)測誤差均方根（root-mean-squares error of prediction，RMSEP)
[0031 ]公式①、②和②中：Yi為傳統(tǒng)分析技術(shù)得到的參考值;Ym為Yi的均值;?ξ為利用近紅 外分析得到的預(yù)測值;η為建模樣品數(shù);m為主成分?jǐn)?shù);ρ為驗(yàn)證集樣品數(shù);1^為交叉驗(yàn)證得到 的預(yù)測值;&.為驗(yàn)證集得到的預(yù)測值。
[0032] 3、柑桔黃龍病定性分類判別模型的適用性驗(yàn)證:為對(duì)所建模型進(jìn)行適用性驗(yàn)證， 重新采集了兩個(gè)砂糖桔果園（1號(hào)果園與2號(hào)果園）的田間樣本，每個(gè)果園按五點(diǎn)隨機(jī)取樣法 進(jìn)行采樣，每點(diǎn)采樣33個(gè)，每個(gè)柑桔園共采樣165個(gè)，兩個(gè)柑桔園共采樣330個(gè)。實(shí)時(shí)熒光定 量PCR(RT-qPCR)檢測結(jié)果顯示，本批次田間樣品中帶菌樣本共297個(gè)，不帶菌樣本共33個(gè)， 其中1號(hào)果園帶菌樣本150個(gè)，不帶菌樣本10個(gè)，2號(hào)果園帶菌樣本147個(gè)，不帶菌樣本13個(gè)。 兩個(gè)不同柑桔園樣本MicroNIR光譜按照最佳參數(shù)進(jìn)行預(yù)處理后，分別輸入最優(yōu)PLS-DA定性 分類判別模型中進(jìn)行分類預(yù)測，并用卡方檢驗(yàn)(X 2)判斷模型預(yù)測值與理論值之間是否有差 異。兩個(gè)不同砂糖桔果園的田間驗(yàn)證結(jié)果表明，PLS-DA模型的正確識(shí)別率均在99%以上，最 高達(dá)到100%，再一次驗(yàn)證了該模型的精確預(yù)測能力。將理論預(yù)測值與RT-qPCR的檢測實(shí)際 值進(jìn)行卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其卡方(X 2)值為〇. 357，P值為0.592，表明該模型的理論預(yù)測值與RT-qPCR所檢測的實(shí)際值之間無顯著差異，能精確的對(duì)待測柑桔葉片樣本進(jìn)行定性分類判別， 可以進(jìn)一步利用該模型進(jìn)行柑桔黃龍病的田間快速診斷應(yīng)用。
[0033] 正確識(shí)別率（Correct recognition rate) =Nr/NiX 100%
[0034] 式中:Nr為正確識(shí)別樣品本身來源的樣本數(shù);Ni為同一來源的樣本個(gè)數(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種柑桔黃龍病的近紅外光譜田間檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：51. 標(biāo)準(zhǔn)樣品光譜集的建立:采用微型便攜式近紅外光譜儀于田間直接探測讀取感染 柑桔黃龍病病菌和不帶黃龍病病菌柑桔植株葉片的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)；52. 定性分類判別模型的建立:將S1中的近紅外光譜學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正和預(yù)處理后，分別 提取其近紅外光譜學(xué)的特征值，經(jīng)訓(xùn)練集訓(xùn)練和驗(yàn)證集驗(yàn)證后得到最優(yōu)的PLS-DA定性分類 判別t吳型； S3 .未知樣品的定性判別：用S2建立的最優(yōu)的PLS-DA定性分類判別模型于田間直接區(qū) 分待測柑桔葉片樣本是否已感染柑桔黃龍病。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，光譜儀探測讀數(shù)的部位為葉片背面的主葉 脈，葉齡為當(dāng)年生或上年生的秋稍成熟葉片。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，S1所述微型便攜式近紅外光譜儀使用 的圖譜采集軟件為MicroNIR 1.5.7,測量時(shí)間為0.5 s，測量波長范圍為950~1650 nm，采 集背景為鋼板，光源采集直徑為16 mm。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述最優(yōu)PLS-DA模型評(píng)價(jià)的參數(shù)包括： 決定系數(shù)、預(yù)測誤差均方根和交互驗(yàn)證均方根。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，決定系數(shù)值越接近于1，表示所建立模型的 預(yù)測值與真實(shí)值之間的相關(guān)性越好;預(yù)測誤差均方根值越小，則能夠表明試驗(yàn)結(jié)果和真實(shí) 值越接近，說明所建模型的預(yù)測精度越高;交互驗(yàn)證均方根選在其值最低處對(duì)應(yīng)的主成分 數(shù)作為最佳主成分?jǐn)?shù);預(yù)測誤差均方根和預(yù)測誤差值越接近且越小代表模型性能越佳，預(yù) 測精度越高。
【文檔編號(hào)】G01N21/359GK106018332SQ201610581372
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月21日
【發(fā)明人】曾鑫年, 陳冬梅, 王華堂
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)