一種檢測和定量乙酰金剛烷胺的免疫學(xué)檢測方法
【專利摘要】一種檢測和定量接受小劑量的金剛烷胺的人的尿液或其他體液中的乙酰金剛烷胺的免疫學(xué)檢測方法。乙酰金剛烷胺的定量能被用來定量SSAT活性，并且升高的SSAT活性是包括但不限于炎癥和癌癥的疾病的指征。
【專利說明】一種檢測和定量乙酰金剛烷胺的免疫學(xué)檢測方法 【背景技術(shù)】 技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及定量精胺/亞精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)酶活性的方法和組合物。
[0002] 相關(guān)技術(shù)說明
[0003] 亞精胺/精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)普遍分布在哺乳動物組織中，并在聚胺在細 胞中的分解代謝和消除中起作用。SSAT是一種催化乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到聚胺的氨丙 基部分的誘導(dǎo)酶。SSAT的這一行為促進了聚胺的降解、排泄以及循環(huán)和/或細胞內(nèi)循環(huán)。 SSAT以這種方式參與維持哺乳動物細胞中聚胺的體內(nèi)平衡。然而，在正常的或未經(jīng)誘導(dǎo)的 哺乳動物組織中，SSAT以非常低的水平存在。
[0004] 可以通過不同的藥物、生長因子、聚胺、聚胺類似物、有毒物質(zhì)、激素和生理刺激物 誘導(dǎo)SSAT的表達。雖然所有上述化合物可以誘導(dǎo)SSAT的表達，但是對于每個單獨的化合物， 誘導(dǎo)發(fā)生的時間不同。SSAT表達的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄、mRNA穩(wěn)定、mRNA翻譯和蛋白質(zhì)穩(wěn)定的水平發(fā) 生。在體外實驗?zāi)艹晒Φ剡M行前，為使細胞中或100，〇〇〇 X g的上清液中存在足夠的SSAT酶， 通常需要SSAT的誘導(dǎo)或過表達。
[0005] 目前的文獻教導(dǎo)SSAT是一種對包括精胺和亞精胺或其類似物在內(nèi)的底物有特異 性的乙酰化酶，然而SSAT作用于SSAT的非精胺/亞精胺底物的SSAT活性、SSAT的酶動力學(xué)以 及測定方法還是沒有被理解?，F(xiàn)在有定量SSAT活性的方法。然而，這些技術(shù)都依賴于技術(shù)高 度熟練的人員和復(fù)雜的實驗方法。更具體地說，存在對一種測定方法的需求，這種測定方法 通過檢測非精胺的乙?；问絹矶縎SAT的活性。包括金剛烷胺在內(nèi)的SSAT的亞精胺底物 可以被用來檢測不同的病理狀況。
[0006] 傳統(tǒng)的方法，比如單獨的氣液色譜法(GLC)、高壓液相色譜法(HPLC)，或與質(zhì)譜法 聯(lián)用，已被用來測定乙?；x物例如乙酰金剛烷胺。檢測靈敏度需要目標(biāo)分析物的十億 分之幾，這是一個挑戰(zhàn)。GLC和HPLC已被證明對體外測定有效，但是對體內(nèi)測定可能不實用。 使用氘代分析物作為HPLC-MS-MS方法的內(nèi)標(biāo)來測定乙酰金剛烷胺是成功的。
[0007] 這些傳統(tǒng)的方法需要勞動力集中的分析服務(wù)，這導(dǎo)致高的操作成本和資本成本。 所有這些都增加了醫(yī)療保健經(jīng)濟的低效率。此外，生物樣品必須有物流處理并運送至集中 的實驗室進行測定。這些操作可能會導(dǎo)致樣品質(zhì)量改變以及可能會導(dǎo)致結(jié)果的錯誤解讀。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供一種免疫學(xué)檢測方法，其檢測并優(yōu)選地定量接受小劑量 的金剛烷胺的哺乳動物或患者的尿液或其他體液中的乙酰金剛烷胺。
[0009] 本文公開了利用含有乙酰金剛烷胺的尿液樣品，能夠抑制抗-乙酰金剛烷胺多克 隆抗體與結(jié)合在底物上的乙酰金剛烷胺的結(jié)合。特異性識別乙酰金剛烷胺的多克隆抗體是 通過使用免疫原乙酰金剛烷胺免疫溫血動物產(chǎn)生的，該免疫原乙酰金剛烷胺與載體蛋白質(zhì) 或與通用T細胞表位、優(yōu)選地和佐劑一起交聯(lián)。交聯(lián)蛋白、通用T細胞表位和佐劑的方法是常 規(guī)的。特異性識別乙酰金剛烷胺的多克隆抗體被金剛烷胺吸附，因為在接受了小劑量的金 剛烷胺的哺乳動物和患者的尿液中有高濃度的金剛烷胺。這可以通過常規(guī)的方法完成，比 如將抗體加入到共價結(jié)合了金剛烷胺的瓊脂糖珠的柱子上，并收集來自該柱子的流穿液。 還提供了一種使用被測數(shù)量的乙酰金剛烷胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量分析。
[0010] 基于本公開的體外測試診斷（IVD)的形式是一種免疫學(xué)檢測方法，其在臨床辦公 室檢測并可以定量乙酰金剛烷胺。這可允許快速醫(yī)療決策以及可間接地測量身體中的SSAT 活性。因此，在護理現(xiàn)場(point of care)的測試方法有益于最小化樣品不穩(wěn)定性和減少醫(yī) 療成本。在醫(yī)療辦公室的IVD的形式可允許快速醫(yī)療決策。
[0011] 基于本公開的測量接受了小劑量的金剛烷胺的哺乳動物的尿液中的乙酰金剛烷 胺的免疫學(xué)檢測方法，可以有多種IVD的設(shè)計。
[0012] 對被金剛烷胺吸附的乙酰金剛烷胺有特異性的多克隆抗體可以被用來檢測或定 量有過量金剛烷胺存在時的乙酰金剛烷胺。
[0013] 對被金剛烷胺吸附的乙酰金剛烷胺有特異性的多克隆抗體可以被用來檢測或定 量身體中的精胺/亞精胺N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(SSAT)活性。 【附圖說明】
[0014]通過以下給出的【具體實施方式】的描述，僅以實施例的方式，并參照附圖，本發(fā)明將 更容易理解，其中：
[0015] 圖1是顯示了針對吸附有金剛烷胺的乙酰金剛烷胺的多克隆親和純化抗體被低濃 度乙酰金剛烷胺抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖；
[0016] 圖2是顯示了針對吸附有金剛烷胺的乙酰金剛烷胺的多克隆親和純化抗體被低濃 度乙酰金剛烷胺和高濃度的金剛烷胺抑制的圖；
[0017] 圖3是顯示了針對乙酰金剛烷胺的多克隆親和純化抗體被低濃度乙酰金剛烷胺和 高濃度的金剛烷胺抑制的圖；
[0018] 圖4是顯示了來自兔子的血清被低濃度乙酰金剛烷胺和高濃度的金剛烷胺抑制的 圖；以及
[0019] 圖5是顯示了乙酰金剛烷胺競爭性ELISA的結(jié)果的圖，信號是針對乙酰金剛烷胺的 競爭性濃度讀取的。 【具體實施方式】
[0020] 本文公開的是一種免疫學(xué)檢測方法，該免疫學(xué)檢測方法可被用來檢測或定量接受 了小劑量的金剛烷胺的哺乳動物中的乙酰金剛烷胺。
[0021] 從哺乳動物中獲取體液樣品，并與已知濃度的對乙酰金剛烷胺特異性的多克隆抗 體溫育。樣品中的乙酰金剛烷胺將抑制乙酰金剛烷胺特異性的多克隆抗體對連接在底物上 的乙酰金剛烷胺的結(jié)合。有許多方法能將乙酰金剛烷胺連接到底物上，在底物上抗體信號 被檢測。本文公開的實施例中，生物素化的乙酰金剛烷胺連接到連接至底物的鏈霉親和素 上。如果抗-乙酰金剛烷胺抗體沒有被樣品中的乙酰金剛烷胺抑制，當(dāng)抗-乙酰金剛烷胺抗 體結(jié)合了乙酰金剛烷胺，通過底物來檢測信號。如果樣品中的乙酰金剛烷胺濃度超過了異 常濃度的閾值，底物的信號可能被完全的抑制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，可以使用許多檢測樣 品中乙酰金剛烷胺的體外檢測診斷（IVD)設(shè)計。比如，有色顆粒，如金顆粒，連接到乙酰金剛 烷胺上，樣品中異常濃度的乙酰金剛烷胺抑制有色顆粒和結(jié)合有抗-乙酰金剛烷胺抗體的 檢測線的結(jié)合。
[0022] 制備乙酰金剛烷胺蛋白綴合物
[0023]載體蛋白質(zhì)卵白蛋白的綴合物是使用生產(chǎn)商使用說明，通過1-乙基-3-(3_二甲基 氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)連接到乙酰金剛烷胺的胺衍生物形成的。在這個實施例中，生產(chǎn) 商是美國，61101，伊利諾斯州，羅克福德的馬莉甸路3747N的賽默飛世爾科技公司。另一個 用于免疫兔子的免疫原是通過甲醛連接到乙酰金剛烷胺的胺衍生物的匙孔血藍蛋白的綴 合物。另一個用于免疫兔子的免疫原是生物素-結(jié)合蛋白親和素偶聯(lián)過量的生物素化4-氨 基-1-N-乙酰金剛烷胺的綴合物。使用生產(chǎn)商的標(biāo)準(zhǔn)方法和使用說明進行生物素化，在本實 施例中，生產(chǎn)商是美國，61101，伊利諾斯州，羅克福德的馬莉甸路3747N的賽默飛世爾科技 公司。
[0024]乙酰金剛烷胺的胺衍生物如下方合成方案中描述的進行合成。
[0025] 金剛烷基胺衍生物的合成
[0027] 免疫兔子:
[0028]使用250iig乳化在完全弗氏佐劑中的乙酰金剛烷胺-卵白蛋白綴合物免疫新西蘭 白兔。該兔子用乙酰金剛烷胺-卵白蛋白綴合物增強多次，用lOOyg乙酰金剛烷胺-綴合物匙 孔血藍蛋白增強兩次，并用偶聯(lián)有過量的生物素化的乙酰金剛烷胺并以明礬作為佐劑的4y g親和素增強一次。在兔子被安樂死并放血前的14天，該兔子使用100yg乙酰金剛烷胺-卵白 蛋白綴合物進行增強。
[0029] 免疫球蛋白G(IgG)的制備:
[0030]使兔子的血液凝固并收集血清。使用包被了蛋白A的珠子收集IgG，并用pH 2的甘 氨酸緩沖液將IgG從柱子上洗脫，并中和到pH 7.2。
[0031] 柱子的制備:
[0032]溴化氰偶聯(lián)的瓊脂糖珠與乙酰金剛烷胺的胺衍生物或金剛烷胺的胺衍生物進行 結(jié)合。
[0033] 針對乙酰金剛烷胺的親和純化的抗體:
[0034]使IgG流動穿過結(jié)合有乙酰金剛烷胺的溴化氰偶聯(lián)的瓊脂糖珠的柱子，針對乙酰 金剛烷胺的抗體結(jié)合到柱子上。柱子用磷酸鹽緩沖鹽水充分洗滌。針對乙酰金剛烷胺的親 和純化的抗體用pH 2的甘氨酸緩沖液從柱子上洗脫，并中和至pH 7.2。
[0035] 吸附有金剛烷胺的針對乙酰金剛烷胺的親和純化的抗體:
[0036]針對乙酰金剛烷胺的親和純化的抗體流動穿過結(jié)合有金剛烷胺的溴化氰偶聯(lián)的 瓊脂糖珠的柱子，并采集IgG的峰。
[0037]用吸附有金剛烷胺的針對乙酰金剛烷胺的親和純化的抗體定量乙酰金剛烷胺: [0038]酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)板用2ug/mL生物素結(jié)合蛋白鏈霉親和素包被，并用脫 脂牛奶封閉。然后使用自動洗滌器采用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌ELISA板。將2ng/mL的生物素化 乙酰金剛烷胺加入鏈霉親和素包被的ELISA板中，使得乙酰金剛烷胺結(jié)合到鏈霉親和素上。 然后洗滌ELISA板以去除未結(jié)合的生物素化乙酰金剛烷胺。將可溶性的乙酰金剛烷胺或金 剛烷胺滴定到單獨的96孔板中，并和小量的、事先測定濃度的吸附有金剛烷胺的抗-乙酰金 剛烷胺親和純化的抗體溫育一小時，該小量的、事先測定濃度的吸附有金剛烷胺的抗-乙酰 金剛烷胺親和純化的抗體在包被有乙酰金剛烷胺的ELISA板中給出明顯的信號。吸附有金 剛烷胺的針對乙酰金剛烷胺的親和純化的抗體的最小量給出了乙酰金剛烷胺的最大靈敏 度。之后，將與恒定數(shù)量的吸附有金剛烷胺的抗-乙酰金剛烷胺親和純化的抗體溫育一小時 的乙酰金剛烷胺和金剛烷胺滴定液加入乙酰金剛烷胺包被的ELISA板中。
[0039] ELISA溫育兩小時，然后ELISA通過加入針對兔IgG的結(jié)合有堿性磷酸酶的羊抗體 進行顯影。加入底物，通過標(biāo)準(zhǔn)方法對ELISA顯影，通過ELISA檢測儀測定光密度，光密度如 圖1所示。特別地，圖1示出了表示從100pg/mL從1 Ong/mL的抑制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。若對尿液樣品 進行一式四份的測定，可以在該檢測方法中準(zhǔn)確地定量乙酰金剛烷胺。如果尿液100%抑 制，可以將樣品稀釋，并在該檢測方法中準(zhǔn)確地定量乙酰金剛烷胺。將~400pg/mL可溶的乙 酰金剛烷胺加入吸附有金剛烷胺的抗-乙酰金剛烷胺親和純化抗體中，在EILSA中有明顯的 結(jié)合的抑制（50 % )，如圖2所示。相比之下，使用僅40yg/mL金剛烷胺會有明顯的抑制 (50%)，如圖2所示。
[0040] 用針對乙酰金剛烷胺的親和純化的抗體定量乙酰金剛烷胺:
[0041] 來自這個單獨的兔子的親和純化的抗體結(jié)合到乙酰金剛烷胺上，并且沒有吸附金 剛烷胺，也能在這個免疫學(xué)檢測方法中工作，如圖3所示。將~1.3ng/mL可溶的乙酰金剛烷 胺加入吸附有金剛烷胺的抗-乙酰金剛烷胺親和純化抗體中，在EILSA中有明顯的結(jié)合的抑 制（50 % )，如圖2所示。相比之下，使用僅100yg/mL金剛烷胺會有明顯的抑制（50 % )，如圖2 所示。
[0042] 用針對乙酰金剛烷胺的重復(fù)免疫的兔子的血清定量乙酰金剛烷胺:
[0043]來自這個單獨的兔子的血清也能在這個定量乙酰化金剛烷胺的免疫學(xué)檢測方法 中工作，如圖4所示。將~300pg/mL可溶的乙酰金剛烷胺加入血清的稀釋液中，在EILSA中有 明顯的結(jié)合的抑制（50%)，如圖2所示。相比之下，使用lOOyg/mL金剛烷胺會有明顯的抑制 (50%)，如圖2所示。
[0044]本領(lǐng)域技術(shù)人員相應(yīng)地也可以知道，本文公開的免疫學(xué)檢測方法可以用于檢測和 定量接受小劑量的金剛烷胺的患者中的乙酰金剛烷胺。這表示在圖5中，其顯示了乙酰金剛 烷胺競爭性ELISA的結(jié)果，針對乙酰金剛烷胺的競爭性濃度讀取信號。ELISA板的包被物是 2ug/ml鏈霉親和素和6ng/ml生物素化的乙酰金剛烷胺。競爭性ELISA使用針對乙酰金剛烷 胺的1:200稀釋的血清，范圍從0.025ng/ml到250ng/ml。完全抑制抑制出現(xiàn)在100ng/ml可溶 的乙酰金剛烷胺附近。檢測限（靈敏度)在〇.5ng/ml到1.0ng/ml附近。乙酰金剛烷胺的定量 能被用來定量SSAT活性，并且升高的SSAT活性是包括但不限于炎癥和癌癥的疾病的指征。
[0045]本領(lǐng)域技術(shù)人員還可知，上述提供的許多細節(jié)僅僅是作為實施例，并無意限縮本 發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明的保護范圍是參考權(quán)利要求得出的。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測哺乳動物的體液中的乙酰金剛烷胺的方法，所述方法包括： 對所述哺乳動物劑量給藥金剛烷胺； 從所述哺乳動物中獲取體液樣品； 將所述體液樣品和已知濃度的乙酰金剛烷胺特異性抗體溫育；以及 基于抗-乙酰金剛烷胺抗體對結(jié)合在底物上的乙酰金剛烷胺的結(jié)合的抑制來檢測所述 體液樣品中的乙酰金剛烷胺。2. -種定量哺乳動物的體液中的乙酰金剛烷胺的方法，所述方法包括： 對所述哺乳動物劑量給藥金剛烷胺； 從所述哺乳動物中獲取體液樣品； 將所述體液樣品和已知濃度的乙酰金剛烷胺特異性抗體溫育；以及 基于抗-乙酰金剛烷胺抗體對結(jié)合在底物上的乙酰金剛烷胺的結(jié)合的抑制來定量所述 體液樣品中的乙酰金剛烷胺。
【文檔編號】G01N33/53GK105899952SQ201480059861
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年8月29日
【發(fā)明人】布萊恩·鄭
【申請人】百奧馬克科技有限公司