魚鱗中作為對(duì)于慢性應(yīng)激的生物標(biāo)記物的糖皮質(zhì)激素的量化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及確定魚類在長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)經(jīng)歷的應(yīng)激水平，其可以用于評(píng)估魚類的福利狀態(tài)。更具體地，本發(fā)明涉及從魚中取樣的鱗片以及其他鈣化組織如耳石、脊和軟鰭條用于量化所述鱗片/基質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素水平的用途。所述糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮的水平在鱗片中隨時(shí)間累積并且反映魚類在其生命期間經(jīng)歷的并且影響其應(yīng)激水平的長(zhǎng)期的和應(yīng)激性狀態(tài)。因此，本發(fā)明公開(kāi)了，使用鱗片作為用于所述應(yīng)激激素的準(zhǔn)確和精確量化的邏輯可行并且非侵入性的基質(zhì)，以量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法。
【專利說(shuō)明】魚鱗中作為對(duì)于慢性應(yīng)激的生物標(biāo)記物的糖皮質(zhì)激素的量化
[0001] 發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及確定魚類經(jīng)歷的應(yīng)激水平，其可以用于評(píng)估魚類的慢性應(yīng)激狀態(tài)。更 具體地，本發(fā)明涉及從魚中取樣的鱗片以及其他鈣化組織如脊、軟鰭條和耳石用于量化所 述鱗片和其他基質(zhì)中的糖皮質(zhì)激素水平的用途。所述糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇或皮質(zhì)酮的水平 在鱗片中隨時(shí)間累積并且反映魚類在其生命期間經(jīng)歷的并且影響其應(yīng)激水平的長(zhǎng)期的和 應(yīng)激性狀態(tài)。因此，本發(fā)明公開(kāi)了，使用鱗片作為用于所述應(yīng)激激素的準(zhǔn)確和精確量化的邏 輯可行并且非侵入性的基質(zhì)，以量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 全世界范圍內(nèi)，魚類越來(lái)越引起公共、科學(xué)和政治的興趣。娛樂(lè)和商業(yè)漁場(chǎng)在我們 社會(huì)中是重要的：魚類問(wèn)題在與保護(hù)生物學(xué)（1)和環(huán)境保護(hù)工作(例如，氣候改變、新型食肉 動(dòng)物、新型動(dòng)物-環(huán)境關(guān)系對(duì)應(yīng)激的影響以及因此對(duì)健康(fitness)的影響）（2、3)有關(guān)的討 論中占據(jù)高度相關(guān)的位置。人類活動(dòng)（例如，能量生產(chǎn)、船運(yùn)交通、工業(yè)污染)損害了野生種 群(4)。因此，各種國(guó)際性監(jiān)測(cè)方案旨在科學(xué)地闡明它們對(duì)海洋生態(tài)位(niche)的健康狀態(tài) 的影響。對(duì)于淡水種群來(lái)說(shuō)存在相似的情形，因?yàn)殡S著農(nóng)業(yè)擴(kuò)張，它們處于土壤侵蝕、肥料 等的威脅下。人類人口持續(xù)膨脹，使得對(duì)可持續(xù)食物生產(chǎn)的需求成為全球的首要優(yōu)先問(wèn)題。 魚肉蛋白質(zhì)是用于人類消耗的最重要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一。既然漁場(chǎng)在產(chǎn)率方面受限，水產(chǎn) 養(yǎng)殖在世界范圍迅速擴(kuò)張并且對(duì)農(nóng)民施加了日益增加的壓力以最佳、可持續(xù)且動(dòng)物友好的 方式生產(chǎn)(5、6)。大量的魚類(例如斑馬魚(況1^ &行811)和鏘魚(1116(1&1?1))在生物醫(yī)學(xué)研究中 (例如在骨生理研究中）用作脊椎動(dòng)物模型和嚙齒動(dòng)物的替代方案。在全球經(jīng)濟(jì)輸出減少的 同時(shí)維持該領(lǐng)域中研究驅(qū)動(dòng)的創(chuàng)新的必要性增加了對(duì)魚類的開(kāi)發(fā)。在最近，隨著大量的魚 類參與到漁場(chǎng)(7)、迅速增長(zhǎng)和加強(qiáng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)(8、9)、公共水族館（10、11)和科學(xué)研究 實(shí)驗(yàn)室（12)中，與魚類受折磨和福利相關(guān)的倫理學(xué)引起了更多的注意。理解和明白作為魚 類開(kāi)發(fā)中管理、控制和做決策的基礎(chǔ)的魚類生物學(xué)對(duì)來(lái)自大量學(xué)科(從分子生物學(xué)到生態(tài)-生理學(xué)）、從多個(gè)角度(所有不同的利益相關(guān)者)觀察并且代表高度具體且珍貴的專業(yè)知識(shí) 的所包括的那些帶來(lái)了明顯的挑戰(zhàn)。在該框架下，用于評(píng)估魚類中的應(yīng)激尤其是慢性應(yīng)激 的水平的新型的科學(xué)驗(yàn)證的生物標(biāo)記物是最重要的。
[0004] 魚類福利容易被損害，并且產(chǎn)生了共識(shí):適當(dāng)?shù)母＠u(píng)估需要基于動(dòng)物的生理指 標(biāo)優(yōu)于較不一致的、間接農(nóng)業(yè)相關(guān)的參數(shù)如水質(zhì)。然而，對(duì)于用于慢性應(yīng)激的實(shí)際、可靠和 驗(yàn)證的生物標(biāo)記物存在不足。經(jīng)常使用的、似乎符合邏輯的用于魚類的生物標(biāo)記物是"應(yīng)激 類固醇"皮質(zhì)醇的血液水平。面對(duì)應(yīng)激性刺激的魚類通過(guò)激活下丘腦-垂體-腎間組織 (hypothalamic-pituitary-interrenal，HPI_)軸啟動(dòng)內(nèi)分泌應(yīng)激反應(yīng)以將皮質(zhì)醇（13、14) 釋放至血液中。皮質(zhì)醇誘發(fā)一系列生理和行為變化（15-17)，這允許魚類應(yīng)對(duì)改變的環(huán)境 (18-20)。廣泛識(shí)別了短期皮質(zhì)醇行為的適應(yīng)性的值(21、22)。關(guān)于持久性應(yīng)激及其對(duì)健康、 生長(zhǎng)、和繁殖的主要有害后果所知甚少（19、20)。穩(wěn)健、容易發(fā)揮作用并且科學(xué)驗(yàn)證的慢性 應(yīng)激生物標(biāo)記物的定義因此是最重要的。魚類血漿中的糖皮質(zhì)激素水平顯示出晝夜變化 (23)，不顯示魚類對(duì)應(yīng)激的終生暴露，并且提供不多于一個(gè)在取樣時(shí)的皮質(zhì)醇狀態(tài)的快照 (snapshot) (24、25)。此外，血液取樣是侵入性的并且由于網(wǎng)捕、空氣暴露和處理而不可避 免地對(duì)魚類造成混亂應(yīng)激(confounding stress)。這使得血衆(zhòng)皮質(zhì)醇在遇到應(yīng)激物之后數(shù) 分鐘水平迅速升高時(shí)易于產(chǎn)生偏差（13)。用于促進(jìn)血液取樣的麻醉劑其本身可以降低或阻 斷HPI軸的活化，從而影響血液中的皮質(zhì)醇釋放并且得到錯(cuò)誤的結(jié)果（26、27)。限制也適用 于在備選基質(zhì)如黏液(28、29 )、腸內(nèi)容物(29 )、排泄物(30)和水(31、32)中的皮質(zhì)醇的測(cè)定。 相關(guān)文獻(xiàn)缺乏關(guān)于適用于慢性應(yīng)激評(píng)價(jià)的基質(zhì)中的皮質(zhì)醇的數(shù)據(jù)。迄今為止，大多數(shù)研究 僅提出了皮質(zhì)醇，并且關(guān)于一種或多種糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生通路(33)或它們?cè)诼詰?yīng)激中的重 要性的報(bào)道很少。魚類記錄了（非)生物事件并且將該歷史儲(chǔ)存在鈣化組織中（34-37)。與鳥 類的羽毛(38)和哺乳動(dòng)物的毛發(fā)(39)-樣，用于魚類中慢性應(yīng)激評(píng)估的理想基質(zhì)應(yīng)該至少 滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：（i)糖皮質(zhì)激素的結(jié)合;（ii)緩慢但持久性的生長(zhǎng);和(iii)取樣容易。
[0005] 骨鱗(elasmoid scale)，鈣化皮膚外骨骼結(jié)構(gòu)(40)，同魚類一起生長(zhǎng)，并且由非細(xì) 胞膠原基質(zhì)組成，其在外層被羥基磷灰石鈣礦物質(zhì)化并且襯有單層具有成骨細(xì)胞樣和破骨 細(xì)胞樣性質(zhì)的細(xì)胞。在移除時(shí)，鱗片將會(huì)在數(shù)天內(nèi)重新生成（41)。鱗片是內(nèi)分泌刺激的靶 標(biāo)。在虹鱒魚(rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)的造骨細(xì)胞細(xì)胞溶質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了高親 和性、低容量的雌二醇-17b結(jié)合(42)，并且已經(jīng)在莫桑比克羅非魚(Mozambique tilapia， Oreochromis mossambicus)和金頭海鯛魚（gilthead sea bream,Sparus auratus)中免疫 組織化學(xué)檢測(cè)到雌激素受體(43)。以可忽略的損傷和在不使其皮質(zhì)醇水平由于取樣操作而 混亂的情況下對(duì)魚類的應(yīng)激，容易并且迅速地收集鱗片。
[0006] 附圖簡(jiǎn)述
[0007] 里i:參與慢性應(yīng)激反應(yīng)的類固醇激素原理通路和分析物。44
[0008] 方法的示意性概述。
[0009] 針對(duì)用于驗(yàn)證的鱗片、脊和軟鰭條的基質(zhì)的最佳量。
[0010] _:鱗片、脊和軟鰭條中皮質(zhì)醇的萃取時(shí)間和重復(fù)的優(yōu)化。
[0011] ?5：在稀釋劑中和在基質(zhì)中對(duì)魚鱗中皮質(zhì)醇的校準(zhǔn)曲線。
[0012]圖6:在處理第42天時(shí)的皮質(zhì)醇(nM)、葡萄糖(mM)、乳酸鹽(mM)、總|丐(mM)、和同滲 質(zhì)量摩爾濃度(mOsmol kg<)的血漿分析。觀察值的百分之五十在框的下邊緣和上邊緣(第 一和第三四分位數(shù)）之間出現(xiàn)，并且虛線(whisker)從框延伸至不大于四分位數(shù)間范圍的 1.5倍的最極端觀察值;空心圓表示在所述范圍外部的值。
[0013] 座:在處理第42天時(shí)的下丘腦（erf)、垂體遠(yuǎn)側(cè)部(pome)、和腎間組織（star)基因 (平均標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)-MNE)的分析?？驁D中的虛線與圖6中相同定義。
[0014] 圖8:在處理42天之后鰓中atplala的基因表達(dá)(MNE)?？驁D中的虛線與圖6中相同 定義。
[0015] 型:處理21和42天之后的個(gè)體發(fā)育的鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/鱗片）（CCa =判定限 并且CCf3 =檢測(cè)能力）。由于展示原因，在框圖中省略了第42天的STRESS的一個(gè)值(2.8pmol/ 鱗片）。框圖中的虛線與圖6中相同定義。
[0016]圖10:個(gè)體發(fā)育和再生鱗片的相對(duì)collal表達(dá)(MNE)相對(duì)于血漿皮質(zhì)醇(nM)的袋 狀圖（bagplot)。袋含有全部觀察值的50%。插圖表示21天時(shí)的再生鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/ 鱗片）?？驁D中的虛線與圖6中相同定義。
[0017]圖11:在處理第42天時(shí)的皮質(zhì)醇(nM)、葡萄糖(mM)、總鈣(mM)、和同滲質(zhì)量摩爾濃 度(mOsmol kg<)的血漿分析。觀察值的百分之五十在框的下邊緣和上邊緣(第一和第三四 分位數(shù))之間出現(xiàn)，并且虛線從框延伸至不大于四分位數(shù)間范圍的1.5倍的最極端觀察值； 空心圓表示在所述范圍外部的值。
[0018]圖12:處理21和42天之后的個(gè)體發(fā)育的鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/鱗片）（CCa =判定 限并且CCP =檢測(cè)能力）?？驁D中的虛線與圖11中相同定義。
[0019] 圖13:處理21天的再生鱗片中的皮質(zhì)醇(pmol/鱗片）（CCa =判定限并且CCg =檢測(cè) 能力）。框圖中的虛線與圖11中相同定義。
[0020] 發(fā)明描述
[0021] 本發(fā)明涉及在鱗片中獲取了魚類中的糖皮質(zhì)激素分布(profile)，以及這些真皮 骨板中的糖皮質(zhì)激素水平反映魚類隨時(shí)間經(jīng)歷的應(yīng)激程度的時(shí)間整合的樣品的研究結(jié)果。 鱗片實(shí)際上被認(rèn)為是用于魚類中慢性應(yīng)激監(jiān)測(cè)的理想基質(zhì)，因?yàn)轺[片容易以非侵入性方式 取樣并且因?yàn)轺[片允許方便的樣品制備以用于進(jìn)一步量化所述鱗片中的糖皮質(zhì)激素水平。 本發(fā)明因此涉及用于量化魚鱗中糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)醇以評(píng)估長(zhǎng)時(shí)間段期間魚類對(duì)應(yīng)激的 暴露的準(zhǔn)確、精確和穩(wěn)健的方法。
[0022] 更具體地，本發(fā)明涉及一種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包 括：
[0023]-從所述魚中獲得至少一個(gè)鱗片，
[0024]-從所述鱗片中萃取糖皮質(zhì)激素，
[0025] _將從所述鱗片中萃取的糖皮質(zhì)激素純化，
[0026] _量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和
[0027] -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"糖皮質(zhì)激素"，當(dāng)（骨）鱗采自屬于真骨魚類（Teleostei)次綱的魚類 (卩18〇68)時(shí)意指皮質(zhì)醇，和/或當(dāng)(硬鱗魚)鱗采自屬于軟骨魚綱(〇1011(11'；[01^768)的魚類時(shí) 意指皮質(zhì)酮，和/或當(dāng)額外需要檢測(cè)可能的額外腎間（extra-interrenal)通路時(shí)意指皮質(zhì) 醇的前體如17a-羥基孕酮和/或11-脫氧皮質(zhì)醇和/或皮質(zhì)酮的前體如11-脫氧皮質(zhì)酮，和/ 或意指皮質(zhì)醇的代謝物如可的松、Reichstein's U(或20-二氫可的松）、四氫皮質(zhì)醇和/或 四氫可的松和/或皮質(zhì)酮的代謝物，因?yàn)檫@些代謝物可以影響鱗片中的糖皮質(zhì)激素水平從 而額外需要對(duì)它們的檢測(cè)。
[0029] 以上指出的糖皮質(zhì)激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下45:
[0030] -皮質(zhì)醇或110，17a
，21-三羥基孕-4-烯-3，20-二酮：
[0032]-皮質(zhì)酮或110，21-二羥基-4-孕烯-3，20-二酮：
[0034] -17a-羥基孕酮或17a-羥基孕-4-烯-3，20-二酮：
[0036] -11-脫氧皮質(zhì)醇或17a，21-二羥基孕-4-烯-3，20-二酮：
[0038] -11-脫氧皮質(zhì)酮或21-羥基孕-4-烯-3，20-二酮
[0040]-可的松或17a，21 -二羥基-孕-4-烯-3，11，20-三酮：
[0042] -Reichsteir/ s U或20-二氫可的松或 17a，20，21-三羥基-孕-4-烯-3，11-二酮：
[0044]-四氫皮質(zhì)醇或3a，110，17a，21-四羥基-5f3-孕烷-20-酮：
[0046]-四氫可的松或3a，17a，21-三羥基-50孕烷-11，20-二酮：
[0048]因此，本發(fā)明涉及如在此描述的方法，其中所述糖皮質(zhì)激素是皮質(zhì)醇、17a-羥基孕 酮、II-脫氧皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、II-脫氧皮質(zhì)酮、可的松、Reichstein' s U、四氫皮質(zhì)醇和/或四 氫可的松。作為被認(rèn)為反映硬骨魚類中應(yīng)激反應(yīng)的經(jīng)典參數(shù)，皮質(zhì)醇被釋放至血流中使得 結(jié)合入鈣化結(jié)構(gòu)中成為可能，并且因此是用于慢性應(yīng)激研究的首要靶標(biāo)分析物。在所述方 法中包括其前體17a_羥基孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇以闡明可能的額外腎間通路的存在。因?yàn)?魚類中的額外腎間通路的存在目前是未知的，但是因?yàn)樵谌祟愔写嬖陬~外腎上腺通路的跡 象 46,出于將來(lái)的研究目的，在所述方法中并入兩種分析物。這種通路的存在可能對(duì)我們對(duì) HPI軸和因此對(duì)應(yīng)激的理解具有深遠(yuǎn)的影響。在所述方法中還包括代謝物可的松、 Reichstein' s U、四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松，因?yàn)樵谒械耐庠刺瞧べ|(zhì)激素（來(lái)自其他魚 類、人類活動(dòng)等)可以充當(dāng)可能影響鱗片中糖皮質(zhì)激素分布的內(nèi)分泌干擾劑。
[0049] 術(shù)語(yǔ)"魚類"基本上意指具有鱗片的任何帶有鰓的、有頭類水生動(dòng)物，但是具體是 指屬于軟骨魚(Chondrichtyes)(軟骨魚類(cartilaginous fish))的分類學(xué)綱或?qū)儆谡婀?魚類(Teleostei)(硬骨魚(bony fish))的分類次綱的魚類。
[0050] 本發(fā)明還具體涉及如上所述的方法，其中所述魚類屬于真骨魚類次綱。
[0051] 更具體地，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述屬于真骨魚類次綱的魚類是屬 于下列各項(xiàng)的魚類：狼?/^4(Moronidae)(例如歐洲海f盧魚(European Sea bass))、鯛科 (Sparidae)(例如海鯛魚(Sea breams))、觸科(Soleidae)(例如觸魚(Solea solea)和塞內(nèi) 加爾觸魚（5〇163 86]16831611818))、鮭科（3311]10111(136)(例如，鮭魚、鱒魚）、所謂的石首魚 (Kingfish)(例如黃尾石首魚）、鯖科(Scombridae)(例如金槍魚）、鱈科(Gadidae)(例如鱈 魚）、鯉科(Cyprinidae)(例如常見(jiàn)的鯉魚、錦鯉）、和麗魚(cichlid fish)(例如莫桑比克以 及尼羅河羅非魚）。
[0052]術(shù)語(yǔ)"鱗片"意指通常發(fā)現(xiàn)于魚皮中的真皮骨板，其顯示出依賴于生長(zhǎng)的同心環(huán)或 圓環(huán)。更具體地，術(shù)語(yǔ)"鱗片"是指如在真骨魚類中發(fā)現(xiàn)的"骨鱗(elasmoid scale)"并且是 指如在軟骨魚中發(fā)現(xiàn)的"硬鱗(ganoid scale)"。
[0053]魚類中的術(shù)語(yǔ)"慢性應(yīng)激"意指歸因于處理、差的水質(zhì)、飼養(yǎng)密度、捕食和多種其他 人類因素如風(fēng)車、船只交通、觸摸等隨時(shí)間累積并且反映長(zhǎng)期的和應(yīng)激性狀態(tài)的應(yīng)激。慢性 應(yīng)激因此是魚類不能完全恢復(fù)的長(zhǎng)期狀態(tài)。應(yīng)激因素以及在內(nèi)分泌水平、免疫系統(tǒng)或功能 水平出現(xiàn)的變化的直接作用可以是造成降低所述魚類的福利的（前)病理后果的原因。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"從魚中獲得鱗片"意指用例如細(xì)鑷子從所述(活的或死的）魚的皮膚移除至 少一個(gè)鱗片。所述鱗片可以取自所述魚的身體的任何部分：即，背部、顱腹部 (cranioventral)、中腹部(medioventral)、尾部、左或右側(cè)等。為了使本發(fā)明的方法標(biāo)準(zhǔn) 化，從胸鰭背側(cè)的中背腹區(qū)域取鱗片。因?yàn)楸灰瞥镊[片在短時(shí)間內(nèi)重新生長(zhǎng)，因此這種非 侵入性的樣品收集方式對(duì)魚類沒(méi)有影響。這些再生的鱗片被證實(shí)展現(xiàn)出在經(jīng)歷的應(yīng)激方面 相同的糖皮質(zhì)激素的結(jié)合分布，并且本身提供了額外的工具以在充分限定的時(shí)間期限內(nèi)量 化慢性應(yīng)激。
[0055] 因?yàn)閱蝹€(gè)鱗片的重量取決于魚種類，以及取決于魚的年齡，并且在幼魚中是較小 的鱗片，所需的鱗片的數(shù)量取決于這兩種因素。由于這種原因，使用相當(dāng)于例如l〇〇mg的鱗 片的標(biāo)準(zhǔn)化的量的鱗片將本發(fā)明的方法標(biāo)準(zhǔn)化，盡管試驗(yàn)指出也可以使用較小的量(如80、 60、40、20、10、5、111^等的鱗片）。相當(dāng)于10011^的鱗片的鱗片的數(shù)量通常為約40至80個(gè)鱗片， 如60個(gè)鱗片，但是應(yīng)當(dāng)清楚的是，考慮如上所述的兩種因素，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10個(gè)或多個(gè)鱗片進(jìn)行本發(fā)明的方法。
[0056] 本發(fā)明因此還涉及如上所述的方法，其中所述從所述魚中獲得至少一個(gè)鱗片是從 所述魚中獲得40至80個(gè)之間的鱗片。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"從所述鱗片萃取糖皮質(zhì)激素"涉及任何從所述鱗片分離/萃取糖皮質(zhì)激素的 方法。本發(fā)明的典型但是非限制性的萃取方法包括將糖皮質(zhì)激素從水相萃取至有機(jī)相中。 例如可以使用的萃取溶劑是甲醇、2-丙醇、乙腈、二乙醚等。然而，甲醇是優(yōu)選的溶劑。
[0058] 因此，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述萃取糖皮質(zhì)激素通過(guò)加入甲醇作為 萃取溶劑進(jìn)行。本發(fā)明的萃取的實(shí)例如下:將均化的鱗片樣品〇.lg±〇.〇〇lg稱重至l〇ml試 管中。隨后，添加8ml甲醇作為萃取溶劑并且添加10此的0.5yg I/1的皮質(zhì)醇-d4溶液作為內(nèi) 部標(biāo)準(zhǔn)品。將樣品渦旋混合30s，在室溫下置于60rpm的架空搖床上lh，并且以3500g在7°C離 心10分鐘。取全部上清液，在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥，并且在5ml H20/Me0H(80: 20;v/v)中重構(gòu)以用于隨后的固相萃取(SPE)。
[0059] 術(shù)語(yǔ)"將從所述鱗片中萃取的糖皮質(zhì)激素純化"涉及任何使得本發(fā)明的糖皮質(zhì)激 素純或者更純以及濃或更濃和/或盡可能多地消除雜質(zhì)的方法。
[0060] 更具體地，本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中所述用甲醇萃取之后進(jìn)行SPE(固 相萃?。?。本發(fā)明的純化步驟的非限制性實(shí)例如下:在用3ml甲醇接著3ml超純水調(diào)節(jié)C18SPE 柱之后，加載如以上得到的樣品。將柱用4.5ml H20/Me0H(65:35;v/v)洗滌并且將殘留的化 合物用2.5ml H2〇/MeOH(20:80;v/v)洗脫至10ml試管中并且在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸 發(fā)干燥。最終在小瓶中將樣品在1〇〇此H 20/Me0H(80:20;V/v)中重構(gòu)并且借助與串聯(lián)質(zhì)譜 法偶聯(lián)的超高效液相色譜法(UPLC-MS/MS)進(jìn)行分析。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"量化所述純化的糖皮質(zhì)激素"是指任何確定在如上所述的在萃取/純化之后 得到的糖皮質(zhì)激素的量的方法。
[0062] 更具體地，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述萃取和純化的糖皮質(zhì)激素的量 化通過(guò)與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的液相色譜法（OmPLC-MS/MS) 47'與紫外線檢測(cè)偶聯(lián)的高效液 相色譜法(HPLC-UV)和與二極管陣列檢測(cè)偶聯(lián)的高效液相色譜法(HPLC-DAD) 49_5<)、或與熒光 檢測(cè)偶聯(lián)的高效液相色譜法(HPLC-FL)5142、氣相色譜法(GC) 5344、（放射性）（酶)免疫測(cè)定 (RIA)5546(EIA)5H8或基于傳感器的技術(shù)5!M5°進(jìn)行。
[0063] 本發(fā)明還涉及如上所述的方法，其中所述與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的液相色譜法是超高 效液相串聯(lián)質(zhì)譜法。
[0064] 更具體地，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中所述免疫測(cè)定是放射性免疫測(cè)定或 酶免疫測(cè)定。
[0065] 術(shù)語(yǔ)"將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)"是指應(yīng)激的硬骨魚產(chǎn)生 被釋放至血流中的皮質(zhì)醇的事實(shí)。當(dāng)這種應(yīng)激負(fù)荷時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)，皮質(zhì)醇在這個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)間 段內(nèi)在血液中循環(huán)?？紤]到鱗片的結(jié)構(gòu)，特定百分比的這種生物活性和自由循環(huán)的皮質(zhì)醇 結(jié)合至鱗片中。在鱗片隨時(shí)間生長(zhǎng)時(shí)，這隨時(shí)間提供了量化皮質(zhì)醇以及因此量化應(yīng)激負(fù)荷 的機(jī)會(huì)。了解到這一點(diǎn)，可以分析暴露于不同應(yīng)激負(fù)荷的魚類的鱗片的糖皮質(zhì)激素。例如， 暴露于較小應(yīng)激負(fù)荷的魚類（即，每2天限制(confinement)在減小的體積(如"原始"體積的 25%)30分鐘）具有1.70yg kg<的平均皮質(zhì)醇量，而在高度應(yīng)激的魚類（即，每2天限制在10 體積％30分鐘，+追捕5分鐘，+每周一次空氣暴露1分鐘）中，平均皮質(zhì)醇量為3.44yg kg-1。
[0066] 本發(fā)明因此基本上涉及從魚中取樣的魚鱗用于測(cè)定或量化所述魚的慢性應(yīng)激水 平的用途。
[0067] 本發(fā)明涉及如上所述的用途，其中所述量化/測(cè)定通過(guò)根據(jù)上述方法的方法進(jìn)行。
[0068] 鱗片是用于慢性應(yīng)激量化的最重要基質(zhì)，因?yàn)樗鼈円苑乔秩胄苑绞绞占摹Ｈ欢?在某些情況下，可以使用其他鈣化基質(zhì)如耳石、脊和鰭條，以及用于慢性應(yīng)激量化的基質(zhì)。 后一種量化可以以與以上對(duì)于鱗片描述的相同的方式進(jìn)行。具體地，將脊和鰭條用剪子剪 斷并且通過(guò)將它們切成小塊進(jìn)行均化，而將耳石用手術(shù)刀移除并且通過(guò)使用研缽研磨進(jìn)行 均化。
[0069] 軟鰭條是柔性的、區(qū)段化的，并且在通過(guò)將新的區(qū)段加入至尖端而延長(zhǎng)的遠(yuǎn)端部 分支。脊不是區(qū)段化的而是與基部融合并且展現(xiàn)出連續(xù)生長(zhǎng)。耳石是內(nèi)耳中平衡器官的一 部分并且主要由霰石(aragonite)形式的結(jié)晶碳酸鈣和被稱為otoline的纖維狀、膠原蛋白 狀蛋白質(zhì)組成。當(dāng)不存在身體生長(zhǎng)時(shí)，它們顯示出徑向沉積并且維持的可容易辨識(shí)的每日 增量。軟鰭條和鱗片當(dāng)它們損失或受損時(shí)可以迅速重新生成。
[0070] 本發(fā)明因此還涉及從魚中取樣的其他鈣化基質(zhì)如脊、鰭條或耳石用于量化所述魚 的慢性應(yīng)激水平的用途。
[0071] 本發(fā)明因此還涉及一種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包括：
[0072] -從所述魚中獲得至少一個(gè)脊、鰭條或耳石，
[0073]-從所述脊、鰭條或耳石中萃取糖皮質(zhì)激素，
[0074]-將從所述脊、鰭條或耳石中萃取的糖皮質(zhì)激素純化，
[0075] _量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和
[0076] -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。
[0077] 現(xiàn)在將通過(guò)以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
[0078] 實(shí)施例1:用于量化歐洲海魚盧魚(Dicentrarchus labrax)的鱗片中糖皮質(zhì)激素的 UPLC-MS/MS方法的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證
[0079]方法和材料 [0080]儀器、材料、和試劑
[0081]在Acquity UPLC-MS/MS Premier XE上使用Acquity Ultra Performance LC BEH C18(l ? 7um; 2.1x100mm)柱(Waters，Milford，美國(guó)）進(jìn)行色譜分析。將樣品用Turbovap?氮蒸 發(fā)器（Biotage，瑞典）蒸發(fā)干燥。從Grace Davison Discovery Sciences(Lokeren，比利時(shí)） 獲得用于固相萃取（SPE)的 Grace Pure? SPE C18-Max(500mg、6ml)柱。從 VWR International BVBA(LeuVen，比利時(shí)）獲得作為萃取溶劑的高效液相色譜法(HPLC)-梯度 級(jí)甲醇（Hipersolv Chromanorm)，同時(shí)使用來(lái)自Biosolve BV(Valkenswaard，荷蘭）的無(wú)水 甲醇LC-MS以及甲酸ULC-MS級(jí)和來(lái)自Millipore(Billerica，美國(guó)）的Milli-Q梯度Q-Gard 2 的超純水作為流動(dòng)相溶劑。
[0082]化合物、標(biāo)準(zhǔn)品、和溶液
[0083]僅使用具有分析許可的產(chǎn)品。皮質(zhì)醇、可的松、17a-羥基孕酮、和11-脫氧皮質(zhì)醇來(lái) 自Sigma_Aldrich(Diegem，比利時(shí)）。四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松來(lái)自Sequoia Research Products Ltd(Pangbourne，英國(guó)）。使用來(lái)自 CDN Isotopes(Pointe_Claire，加拿大）的皮 質(zhì)醇-ck作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。
[0084]在甲醇中制備lmg ml/1的全部化合物和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的單獨(dú)的儲(chǔ)存標(biāo)準(zhǔn)溶液并且在 4°C儲(chǔ)存。通過(guò)將10yl的0.5yg L-1的皮質(zhì)醇-ck溶液分別添加至0.5yL、lyL、2.5yL、5yL、和10 此的在100此出0/]\^011(80:20 ;￥八）中的1邱1/1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制備在0.00511^1/1至0.111^ 廠 1范圍內(nèi)的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。在使用100mg的樣品時(shí)，這對(duì)應(yīng)于在基質(zhì)中5yg kg^1至lOOyg kg^1 的范圍。
[0085] 取樣
[0086] 從使用2-苯氧乙醇深度麻醉并且通過(guò)脊髓橫切殺死的處死歐洲海鱸魚 (Dicentrarchus labrax)中取樣全部|丐化結(jié)構(gòu)。所有魚重約100g。用細(xì)鑷子將來(lái)自胸鰭背 側(cè)的左中背腹區(qū)域的六十個(gè)鱗片從皮膚移除。使用剪子從尾鰭獲取四根背脊和六個(gè)軟鰭 條。從打開(kāi)的頭顱中取兩個(gè)矢狀(sagittal)耳石。將所有樣品用超純水沖洗并且在室溫下 在面巾紙上風(fēng)干。
[0087] 樣品制備
[0088] 使用剪子將鱗片、脊、和軟鰭條切成細(xì)塊。將耳石在研缽中研磨。將剪子和研缽用 乙醇沖洗，接著用超純水沖洗，并且用面巾紙干燥。將均化的樣品0.1g±0.001g稱重至l〇ml 試管中。隨后，添加8ml甲醇作為萃取溶劑并且添加10此的0.5yg I/1的皮質(zhì)醇_d4溶液作為 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。將樣品渦旋混合30s，在室溫下置于60rpm的架空搖床上lh，并且以3500g在7°C 離心10分鐘。取全部上清液，在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥，并且在5ml H20/Me0H (80:20;￥八）中重構(gòu)。在用31111甲醇接著31111超純水調(diào)節(jié)(：183?￡柱之后，加載樣品。將柱用 4.5ml H20/Me0H(65:35; v/v)洗滌并且將殘留的化合物用2.5ml H20/Me0H(20:80; v/v)洗脫 至10ml試管中并且在氮下在60°C使用氮蒸發(fā)器蒸發(fā)干燥。最終在小瓶中將樣品在100yL H 20/Me0H( 80:20; v/v)中重構(gòu)并且借助UPLC-MS/MS進(jìn)行分析。
[0089] LC-MS/MS 分析
[0090] 使用流動(dòng)相A和B的梯度洗脫將糖皮質(zhì)激素分離。流動(dòng)相A是超純水與0.1%甲酸的 混合物，而流動(dòng)相B是甲醇與0.1%甲酸的混合物。最初，以20% (v/v)的流動(dòng)相B開(kāi)始梯度洗 脫。隨后，在1.5分鐘時(shí)將流動(dòng)相B增加至56%，在6.5分鐘時(shí)增加至63%，在7.5分鐘時(shí)增加 至99.1 %，之后將其保持在99.1 %至8分鐘，并且最終在9分鐘時(shí)減小至20 %并且以這種方 式保持至10分鐘。將流量保持恒定在0.4ml分鐘4，得到了 10分鐘的運(yùn)行時(shí)間。將樣品在7 °C 在自動(dòng)取樣器中冷卻。將注射體積設(shè)定為4〇yL，同時(shí)將柱溫維持在30°C。
[0091]在以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式使用的質(zhì)譜儀上進(jìn)行色譜分析從而實(shí)現(xiàn)最佳靈敏度和 選擇性。對(duì)于每個(gè)靶標(biāo)分析物，測(cè)定兩個(gè)前體片段離子躍迀。通過(guò)以1〇此mirT1的流量直接 輸注在甲醇+0.1 %甲酸中的1 Oyg I/1標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)優(yōu)化儀器參數(shù)。兩個(gè)前體片段離子躍迀的 使用允許測(cè)定兩個(gè)躍迀之間的比率，其與相對(duì)保留時(shí)間一起用于根據(jù)Commi s s i 〇n Decision No.2002/657/EC61的要求鑒別和確認(rèn)每個(gè)分析物的特性。質(zhì)譜儀以正離子電噴霧 離子化模式(ESI+)使用。所有化合物作為其質(zhì)子加合物[M+H]+進(jìn)行分析。將MS檢測(cè)器設(shè)置設(shè) 定為以下值：120 °C的源溫度，在800L h-1的氣流下300 °C的去溶劑化溫度，50L h-1的錐孔氣 流，和3kV的毛細(xì)管電壓。在1.11.1(T2毫巴的壓力下使用氬作為碰撞氣體。在表1中給出了具 有所有化合物的保留時(shí)間、前體離子、產(chǎn)物離子、錐孔電壓、和碰撞能量的指標(biāo)的優(yōu)化的 UPLC-MS/MS 條件。
[0092] 表1.每個(gè)化合物的優(yōu)化的UPLC-MS/MS條件
[0094]使用來(lái)自Waters的Quan/Targetlynx軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；分析結(jié)果報(bào)告為值(yg kg一〇±擴(kuò)展的測(cè)量不確定度(yg kg-D以及2的包含因數(shù)(k)(95%置信區(qū)間）。
[0095] 驗(yàn)證
[0096]通過(guò)分別集中（pooling)來(lái)自在相似條件下飼養(yǎng)的51、51、57、和118只魚的鱗片、 脊、軟鰭條、和耳石來(lái)制備每種鈣化結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證樣品。不存在認(rèn)證的參考材料、實(shí)驗(yàn)室間比 較試驗(yàn)或任何其他用于上述分析物/基質(zhì)組合的驗(yàn)證方法，并且因此使用向驗(yàn)證樣品的標(biāo) 準(zhǔn)添加來(lái)完成驗(yàn)證。對(duì)于每種鈣化結(jié)構(gòu)，對(duì)在1至50yg kg<范圍內(nèi)的五個(gè)濃度水平測(cè)試五 次，并且其在一個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)的四個(gè)不同日期在內(nèi)部再現(xiàn)性（intra-reproducibi 1 i ty) 條件下重復(fù)，即由兩個(gè)人使用不同溶液和一個(gè)UPLC-MS/MS系統(tǒng)。所有驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)由授權(quán)人員 在具有校準(zhǔn)的設(shè)備和受控溶液的受控環(huán)境中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)EN IS0/IEC 17025: 2005的要求進(jìn) 行62。使用由不同校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品、空白、陰性和陽(yáng)性對(duì)照（均在稀釋劑中）組成的標(biāo)準(zhǔn)化工序完 成分析。通過(guò)評(píng)估化合物和片段的（相對(duì))保留時(shí)間和相對(duì)離子強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)每種化合物的結(jié) 果。根據(jù)Commission Decision No.2002/657/EC的要求測(cè)定和評(píng)價(jià)所有驗(yàn)證參數(shù):真實(shí)性、 精確度、工作范圍、線性度、判定限(CCa)、檢測(cè)能力(CCP)、靈敏度、和選擇性。
[0097]在內(nèi)部再現(xiàn)性條件下測(cè)定所有化合物的表觀回收率以及精確度(可重復(fù)性和實(shí)驗(yàn) 室內(nèi)再現(xiàn)性），對(duì)于每個(gè)濃度水平得到20個(gè)分析，以及每種化合物和基質(zhì)總計(jì)100個(gè)分析。由 于低濃度水平，進(jìn)行Dixon異常值檢驗(yàn) 63以及Grubbs64檢驗(yàn)以檢測(cè)可能的異常值。判定限(CC a)以校準(zhǔn)曲線的截距加2.33倍實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算(a = l%)，而檢測(cè)能力(C〇3) 以CCa的濃度加1.64倍實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性的標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算⑴= 5%)。擴(kuò)展測(cè)量不確定度基于真 實(shí)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性的驗(yàn)證數(shù)據(jù)并且使用兩種不同的方法，通過(guò)線性加和和通過(guò)二次加 和或Nordtest法測(cè)定。此外，在方法進(jìn)行期間監(jiān)測(cè)方法的穩(wěn)健性和分析物在稀釋劑中以及 在基質(zhì)中的穩(wěn)定性。最終，通過(guò)線性加和以及通過(guò)二次加和或Nordtest法 4742測(cè)定擴(kuò)展測(cè)量 不確定度(在文獻(xiàn)中對(duì)優(yōu)選方法不一致）。
[0098] 結(jié)果
[0099] 魚鱗中的皮質(zhì)醇、其前體17a_羥基孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇、可的松和關(guān)鍵代謝物四 氫皮質(zhì)醇和四氫可的松的即^：-1^/^3量化方法在￡~130/此(：17025 :2005認(rèn)證環(huán)境中進(jìn)行 并且根據(jù)Commission Decision No.2002/657/EC的要求驗(yàn)證。作為被認(rèn)為在大多數(shù)魚類中 反映應(yīng)激反應(yīng)的經(jīng)典參數(shù)，皮質(zhì)醇被釋放至血流中使得結(jié)合入鈣化結(jié)構(gòu)中成為可能，并且 因此是用于慢性應(yīng)激研究的靶標(biāo)分析物。在分析中包括其前體17a-羥基孕酮和11-脫氧皮 質(zhì)醇以涵蓋對(duì)可能的額外腎間通路的檢測(cè)。還包括代謝物四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松，因?yàn)?外源糖皮質(zhì)激素(在水中）可以起內(nèi)分泌干擾劑的作用并且影響所研究的鈣化結(jié)構(gòu)的糖皮 質(zhì)激素分布。還針對(duì)脊、軟鰭條、和耳石測(cè)試和驗(yàn)證了所述方法。說(shuō)明了鱗片取樣的便利性。
[0100] 方法開(kāi)發(fā)
[0101] 取樣和樣品制備
[0102] 對(duì)于每種鈣化結(jié)構(gòu)，確定用于取樣的位置。鱗片是后變態(tài)發(fā)育魚類中的中胚層骨 元件。在從魚的各個(gè)側(cè)邊(例如，背部、顱腹部、中腹部、或尾部)取的鱗片中，或者從左側(cè)和 側(cè)選取的鱗片之間，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇含量的差異。應(yīng)當(dāng)避免側(cè)線的鱗片，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)構(gòu)上不 同。處于容易程度和將來(lái)研究的目的（考慮到水產(chǎn)養(yǎng)殖中的適用性），鱗片選自胸鰭背側(cè)的 中背腹區(qū)域。其中發(fā)現(xiàn)海鱸魚中的脊在第一背鰭的顱部中（8至10根脊）。脊不是區(qū)段化的， 而是在基部融合南區(qū)因此比軟鰭條更具剛性。在脊中在其需要在該組織中隨時(shí)間更好地精 細(xì)調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇結(jié)合的基部發(fā)現(xiàn)了較高濃度的糖皮質(zhì)激素。此外，除了遠(yuǎn)端部之外的所有脊 均被上皮覆蓋。在從背部、顱腹部、中腹部、和尾部的鰭中取的軟鰭條中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇含 量的差異。考慮到水產(chǎn)養(yǎng)殖中的適用性，軟鰭條選自尾鰭。選擇矢狀耳石，因?yàn)樗鼈冏畲蟛?且最容易移除。
[0103] 就邏輯可行性和分析性能的最佳組合而言，通過(guò)摻加不同量的樣品（即來(lái)自相同 的魚的不同數(shù)量的鱗片、脊和軟鰭條，以及5yg kg^1的靶標(biāo)分析物)對(duì)每種鈣化結(jié)構(gòu)確定用 于分析的基質(zhì)的最佳的量。在圖3中給出了鱗片、脊和軟鰭條的結(jié)果?？紤]到將來(lái)在水產(chǎn)養(yǎng) 殖和野生中的適用性，選擇O.lg的每種鈣化結(jié)構(gòu)用于驗(yàn)證。
[0104] 圖3.針對(duì)用于驗(yàn)證的鱗片、脊和軟鰭條的基質(zhì)的最佳量
[0105] 為了移除已知含有內(nèi)源65以及外源糖皮質(zhì)激素的黏液，用超純水對(duì)所有樣品進(jìn)行 強(qiáng)力洗滌。
[0106] 測(cè)試四種具有不同萃取效率的溶劑：甲醇、2-丙醇、乙腈、和二乙醚。對(duì)于鱗片以及 脊和軟鰭條中各種糖皮質(zhì)激素，甲醇得到最佳結(jié)果;在耳石中，溶劑之間沒(méi)有看到明顯的差 異(數(shù)據(jù)未示出）。
[0107] 接下來(lái)，測(cè)試?yán)眉状紲赜臅r(shí)間依賴性（15、60、120min和16h)以及重復(fù)萃取。對(duì) 于魚鱗中的皮質(zhì)醇來(lái)說(shuō)，在溫育60min之后沒(méi)有看到萃取的改善。沒(méi)有看到第二次萃取的改 善，也沒(méi)有看到15min 2次循環(huán)的組合(相對(duì)于60min的1次循環(huán)）的改善。在圖4中給出了鱗 片、脊、和軟鰭條的結(jié)果。
[0108] 圖4.鱗片、脊和軟鰭條中皮質(zhì)醇的萃取時(shí)間和重復(fù)的優(yōu)化
[0109] 因?yàn)樾枰咄亢统杀居行У姆椒?，將鱗片中的萃取用8ml甲醇在架空搖床上在 室溫下標(biāo)準(zhǔn)化lh。
[0110] SPE 操作
[0111] C18相SPE筒成功用于從生物樣品如血漿66、尿液67、排泄物 68中萃取糖皮質(zhì)激素，并 且因此選擇這種柱類型以優(yōu)化本研究中來(lái)自鈣化結(jié)構(gòu)的所選糖皮質(zhì)激素的萃取和純化。
[0112] Grace Pure?SPE C18-Max(500mg、6ml)柱是在二氧化娃系支持物上具有聚合結(jié)合 的17.1%碳負(fù)載的反相吸附劑。選擇反相萃取操作，是因?yàn)槠湟赃m度的極性與來(lái)自極性樣 品基質(zhì)的非極性化合物結(jié)合。500mg的床尺寸得到25mg的吸附保持容量?？紤]到鱗片中以及 其他鈣化結(jié)構(gòu)中糖皮質(zhì)激素的預(yù)測(cè)的濃度范圍，這種保持容量將足以結(jié)合所有目標(biāo)分析 物。針對(duì)溶劑類型和體積優(yōu)化SPE的調(diào)節(jié)、樣品加載、洗滌、和洗脫步驟。利用3ml甲醇以活化 吸附劑配體接著利用3ml超純水以平衡吸附劑床的調(diào)節(jié)步驟得到了最佳結(jié)果(皮質(zhì)醇的平 均回收率>90% )。對(duì)于兩種溶劑來(lái)說(shuō)最小體積為2.5ml，而使用超過(guò)3ml的體積的試驗(yàn)未改 善純化。其中將蒸發(fā)的樣品在5ml H20/Me0H(80: 20; v/v)中重懸的樣品加載步驟得到了最 佳結(jié)果。在其中超純水和/或甲醇的比例變化的溶劑組合得到了非最佳的結(jié)果。對(duì)于糖皮質(zhì) 激素回收率來(lái)說(shuō)，利用4.5ml H20/Me0H(65: 35; v/v)的柱的洗滌得到了最佳結(jié)果。較高的甲 醇濃度導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的洗脫，而較低的甲醇濃度引起噪聲的增加。將殘留的化合物用 2.5ml H20/Me0H(20:80; v/v)洗脫至10ml試管中。分別地，較低的洗脫體積或超純水的增加 未回收所有的糖皮質(zhì)激素，而就成本有效性而言，并且因?yàn)槠鋸幕|(zhì)洗脫更多的干擾化合 物，較高的洗脫體積或甲醇的增加是非最佳的。在蒸發(fā)之后，在小瓶中將樣品在l〇〇yL H20/ 1^011(80:20;￥八）中重構(gòu)并且借助1(：-1^/^3進(jìn)行分析。選擇在100此中重構(gòu)以具有雙倍 (duplo)注射的可能性。在其中超純水與甲醇的比例改變的溶劑組合得到了非最佳的結(jié)果， 因?yàn)閮?yōu)化了用于色譜分析的梯度從而以出0/^011(80:20 ;￥八)開(kāi)始。在高達(dá)1120/也011(20: 80; v/v)的濃度中的重構(gòu)是可能的，但是對(duì)色譜峰的形狀具有負(fù)面影響。
[0113] 色譜分析
[0114] 在使用Acquity Ultra Performance LC BEH C18( 1 ? 7um;2? lxlOOmm)柱優(yōu)化色譜 分析的第一步中，使用質(zhì)譜儀以正離子(Esr)和負(fù)離子(Esn電噴霧離子化模式調(diào)節(jié)所有 化合物以及內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品。在Esr中得到的結(jié)果得到了小峰但是較少的噪聲，而ESI+得到了整 體上更好的結(jié)果并且選擇其用于進(jìn)一步測(cè)試。
[0115] 在第二步中，測(cè)試使用超純水和非極性溶劑如甲醇和乙腈連同0.1%甲酸的不同 梯度體系。首先，測(cè)試使用超純水和乙腈的梯度:較高的乙腈起始濃度得到了較短的保留時(shí) 間并且僅看到皮質(zhì)醇、可的松和17a-羥基孕酮的分離;運(yùn)行緩慢增加乙腈濃度的梯度導(dǎo)致 了 17a-羥基孕酮峰的喪失，以及12min的運(yùn)行時(shí)間，使得乙腈不適合作為流動(dòng)相。隨后，測(cè)試 使用超純水和甲醇的梯度:在運(yùn)行甲醇濃度從緩慢到非?？焖僭黾臃秶鷥?nèi)的不同梯度之 后，所有化合物完全分離并且測(cè)試不同添加劑的可變濃度。使用0.5%乙酸得到了比pH 3.0 的2mM甲酸銨或pH 5.0的乙酸銨更好、但是比0.1 %甲酸差的結(jié)果。隨后，優(yōu)化甲酸的濃度并 且選擇〇. 1 %甲酸;歸因于來(lái)自使用其他添加劑的方法的遺留物(carry-over )，較低的甲酸 濃度導(dǎo)致不穩(wěn)定的結(jié)果。最終，分別將柱溫和流量?jī)?yōu)化為30°C和0.4ml mirT1，以具有l(wèi)Omin 的總運(yùn)行時(shí)間。
[0116] 在最后一步中，優(yōu)化MS/MS方法:針對(duì)最佳靈敏度增加駐留時(shí)間以確保橫跨所有化 合物的每個(gè)離子的峰的點(diǎn)由至少20個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)組成并且因此優(yōu)化MS框架窗口。
[0117] 驗(yàn)證
[0118] 在公開(kāi)的文獻(xiàn)中不能得到鱗片(或任何其他鈣化結(jié)構(gòu)）中的糖皮質(zhì)激素的濃度值， 這使得我們選擇在lyg kg"1至50yg kg<范圍內(nèi)的初步工作。
[0119] 低于、等于和高于CCP水平的魚鱗中皮質(zhì)醇的表觀回收率范圍為88. 14%至 98.85%，全部在根據(jù)Commission Decision NO.2002/657/EC的要求的80%至 110%性能標(biāo) 準(zhǔn)內(nèi)。無(wú)需考慮集中的驗(yàn)證樣品的均質(zhì)化不是最佳的（即，其不是均勻的粉末，而是一灘非 常細(xì)的碎片）的事實(shí)，魚鱗中的皮質(zhì)醇的可重復(fù)性范圍為12.36%至17.15%。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn) 性范圍為14.63%至20.02%。在表2中給出了魚鱗中被分析的化合物的真實(shí)性、精確度和測(cè) 量不確定度的結(jié)果。
[0120] 表2:魚鱗中所有化合物的真實(shí)性的值(表觀回收率AR，百分?jǐn)?shù)）、精確度(可重復(fù)性 CVr和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性CV R)的變化值系數(shù)(CV，百分?jǐn)?shù))和擴(kuò)展測(cè)量不確定度(U，百分?jǐn)?shù)）
[0123] 1使用線性加和分別利用2(95%置信區(qū)間）和3(99%置信區(qū)間）的包含因數(shù)(k)的 擴(kuò)展測(cè)量不確定度的計(jì)算
[0124] 2使用二次加和(Nordtest法)利用2的包含因數(shù)(k)(95%置信區(qū)間）的擴(kuò)展測(cè)量不 確定度的計(jì)算
[0125] 3對(duì)合格離子的不足的反應(yīng)
[0126] 因?yàn)樵趯?lái)的研究中基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)曲線實(shí)際上是不可行的，對(duì)于每種鈣化結(jié)構(gòu) 中的所有化合物，通過(guò)比較在5yg kg^1至50yg kg^1范圍內(nèi)的從稀釋劑中的校準(zhǔn)曲線到基質(zhì) 匹配的校準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)來(lái)確定可能的基質(zhì)影響。圖5表明對(duì)于魚鱗中的皮質(zhì)醇沒(méi)有明顯影 響（考慮到樣品的生物學(xué)變異），但是因?yàn)橄♂寗┖突|(zhì)中的校準(zhǔn)曲線通常是分開(kāi)的，使用 稀釋劑中的校準(zhǔn)曲線的量化是可能的。
[0127] 圖5.在稀釋劑中和在用于魚鱗中的皮質(zhì)醇的基質(zhì)中的校準(zhǔn)曲線
[0128] 隨后，使用由在5iig kg<至lOOiig kg<范圍內(nèi)的五個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)組成的稀釋劑中的四 倍校準(zhǔn)曲線測(cè)試每種鈣化結(jié)構(gòu)中的所有化合物的反應(yīng)的線性度，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性條件下 分析。當(dāng)在該范圍內(nèi)評(píng)估線性度時(shí)，對(duì)于所有化合物來(lái)說(shuō)，未發(fā)現(xiàn)低于0.99的判定系數(shù)(R 2) 值。此外，計(jì)算的模型對(duì)于所有化合物表現(xiàn)出正態(tài)分布。在表3中給出魚鱗中所有化合物的 線性度、CCa，和C邙的結(jié)果。
[0129] 表3:魚鱗中所有化合物的校準(zhǔn)曲線的判定系數(shù)(R2)以及判定限(CCa，yg kg<)和 檢測(cè)能力(Cdyg kg"1)的值
[0132]通過(guò)對(duì)空白基質(zhì)樣品制備稀釋系列來(lái)確定方法的靈敏度，當(dāng)考慮到預(yù)測(cè)的工作范 圍時(shí)，得到了對(duì)魚鱗中的所有化合物具有良好靈敏度的方法。通過(guò)分析空白和摻加的樣品 證實(shí)了方法的選擇性。在摻加的樣品中，所有化合物在預(yù)測(cè)的保留時(shí)間出現(xiàn)，伴隨它們的兩 個(gè)離子躍迀。將離子比與標(biāo)準(zhǔn)注射比較，并且發(fā)現(xiàn)其根據(jù)Commission Decision No .2002/ 657/EC的要求是可接受的。此外，未觀察到干擾峰。
[0133] 在方法開(kāi)發(fā)期間通過(guò)改變最佳值針對(duì)所有重要步驟如萃取和SPE純化測(cè)試方法的 穩(wěn)健性。
[0134] 對(duì)于魚鱗中的皮質(zhì)醇、其前體（17a-羥基孕酮和11-脫氧皮質(zhì)醇）、可的松和代謝物 (四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松）的1^(^5/^方法在￡~150/此(：17025 :2005認(rèn)證環(huán)境中開(kāi)發(fā) 并且根據(jù)Commission Decision No.2002/657/EC的要求驗(yàn)證，并且被證實(shí)適用于其預(yù)期的 目的。此外，針對(duì)三種其他鈣化結(jié)構(gòu)，即脊、軟鰭條和耳石，測(cè)試和驗(yàn)證所述方法。
[0135] 實(shí)施例2:應(yīng)激的與未應(yīng)激的海6盧魚(Dicentrarchus labrax)的鱗片中糖皮質(zhì)激 素水平的
[0136] 方法和材料(參見(jiàn)實(shí)施例1)
[0137] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0138] 試驗(yàn)存在3個(gè)條件的2次重復(fù):對(duì)照（低應(yīng)激、中應(yīng)激和高應(yīng)激）。應(yīng)激是在3周的時(shí) 間段期間隨機(jī)施用的各種類型應(yīng)激物(擁擠、追捕和空氣暴露）的組合。在一天的多個(gè)不可 預(yù)測(cè)的時(shí)刻，如指出的施用應(yīng)激物：
[0139] ?低應(yīng)激:每2天限制(25體積％)30min
[0140] ?中應(yīng)激:每2天限制(25體積％ )30min，追捕5min
[0141] ?高應(yīng)激:每2天限制（10體積％ )30min，追捕5min，每周一次空氣暴露lmin
[0142] 根據(jù)Gorissen等人69使用RIA在96孔板中一式兩份測(cè)量血漿皮質(zhì)醇。一抗顯示與皮 質(zhì)醇100%的交叉反應(yīng)性，與11-脫氧皮質(zhì)醇0.9%的交叉反應(yīng)性，與皮質(zhì)酮0.6%的交叉反 應(yīng)性，和與11-脫氧皮質(zhì)酮、孕酮、17-羥基孕酮、睪酮和雌二醇<0.01 %的交叉反應(yīng)性。除了 "非特異性孔(non-specifics)"之外的所有孔接收100iil皮質(zhì)醇抗體(皮質(zhì)醇抗體[xm210] 單克隆和純化的IgG(Abcam);在50mM NaH⑶3、50mM NaH2⑶3、0.02%NaN3，pH = 9.6*l: 2000)并且在4°C溫育過(guò)夜。之后一天，將板用200yl/孔的洗滌緩沖液（100mM Tris、0.9% 他(：1、0.02%似似）洗滌三次。隨后，通過(guò)向每個(gè)孔添加10(^1封閉緩沖液（10011^1>18、 0.9%他(：1、0.02%似吧、0.25%普通牛血清)來(lái)封閉非特異性位點(diǎn)。將板覆蓋并且在37°(：溫 育一小時(shí)。隨后，將l〇yl標(biāo)準(zhǔn)品（4pg-2048pg皮質(zhì)醇/10yl含有100mM Tris、0.9%NaCl、 0.1%8_苯胺基-1-萘磺酸、0.02%NaN3的測(cè)定緩沖液)或10yl未稀釋的血漿或灌流介質(zhì)添 加至指定孔。非特異性孔和B0接收10yl測(cè)定緩沖液。在添加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之后，將90iU (333Bq)的3h-氫化可的松(PerkinElmer，美國(guó)，在測(cè)定緩沖液中1:10，000)溶液添加至所有 孔。將板在室溫下溫育四小時(shí)，或者在4°C儲(chǔ)存過(guò)夜。之后將板用洗滌緩沖液洗滌三次。在最 終的洗滌步驟之后，所有孔接收200yl的"Optiphase hisafe-3閃爍液體"（PerkinElmer，美 國(guó)）并且將其覆蓋。使用Microbeta Plus(Wallac/PerkinElmer，美國(guó)）通過(guò)3min計(jì)數(shù)/孔量 化0發(fā)射。內(nèi)和外測(cè)定變化分別為12.5和3.5%。
[0143] 結(jié)果
[0147] 實(shí)施例3:鯉魚(Cyprinus carpio L.)的鱗片中糖皮質(zhì)激素水平的量化
[0148] 方法和材料(還參見(jiàn)實(shí)施例1并且進(jìn)一步)
[0149] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0150] 利用鯉魚的試驗(yàn)存在4個(gè)條件的2次重復(fù)，各自具有6條魚:對(duì)照（未應(yīng)激的）、地塞 米松(dexamethasone)(應(yīng)激通路的抑制）、皮質(zhì)醇(應(yīng)激通路的活化)和通過(guò)以隨機(jī)施用方 式提供6周的各種應(yīng)激物誘導(dǎo)的應(yīng)激。
[0151] 方法
[0152] 實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)荷蘭法規(guī)并且由當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)。在Nijmegen的Radboud大學(xué) 飼養(yǎng)常見(jiàn)的鯉魚(Cyprinus carpio L.)以確保歷史。將維持在12:12h光亮:黑暗下、每天以 體重的0.9%喂食2餐(09.30am和15.30pm)的生長(zhǎng)中的成年魚（在第21天時(shí)：340 ±92g和 24.6 ± 2.4cm;在第42 天時(shí)：377 ± 108g 和 25.4 ± 2.5cm)在 20.0 ± 0.4 °C 保持6 周。分別設(shè)置四 組，每組2個(gè)重復(fù)的箱，每個(gè)140-L箱6只魚。留下CTR組的魚不受打擾。DEX和⑶RT組接收以 500mg kg"1摻加的飼料。使STRESS組每天應(yīng)激一次;應(yīng)激物的類型、持續(xù)時(shí)間和時(shí)機(jī)隨機(jī)應(yīng) 用并且包括：網(wǎng)捕（15-60min)、空氣暴露（l-3min)、溫度下降（高達(dá)5°C )、追捕(高達(dá)lOmin) 和限制(在具有低水位的桶中）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，沒(méi)有注意到受損害的健康和行為的跡象。 在42天之后，將魚在2-苯氧基-乙醇(0.1 % v/v)中麻醉并且處死，從尾部血管取血并收集鱗 片(個(gè)體發(fā)育的和21天再生的鱗片）。分析血漿的皮質(zhì)醇69、葡萄糖 '乳酸鹽'總鈣71、和同 滲質(zhì)量摩爾濃度7()。從側(cè)線背側(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化的排對(duì)鱗片進(jìn)行取樣。使用eeflal rps5和肌動(dòng) 蛋白作為參比基因評(píng)估靶基因的MNE72。使用線性混合模型在SAS 9.4(SAS Institutelnc.， Cary，NC)中以處理、取樣日期和它們的相互作用（在適當(dāng)時(shí)）作為固定影響對(duì)所有參數(shù)建 模。在模型中引入箱的隨機(jī)截距以校正魚在箱中的聚集。進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn)以將處理組與對(duì) 照比較。
[0153] 結(jié)果
[0154] 1)原理的控制和實(shí)驗(yàn)設(shè)置的執(zhí)行
[0155]在6周的試驗(yàn)期間，我們比較了不受打擾的（CTR)和每日應(yīng)激的（STRESS)鯉魚。地 塞米松(DEX)或皮質(zhì)醇(C0RT)喂食的魚類分別充當(dāng)對(duì)于鱗片中結(jié)合皮質(zhì)醇的陰性和陽(yáng)性對(duì) 照。在所有處理中，所提供的喂食量在5分鐘內(nèi)消耗，如通過(guò)條件因素 73表明的，所有魚保持 臨床健康，并且未觀察到死亡。通過(guò)每日（PH、溫度、溶解氧)或每周（亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨） 監(jiān)測(cè)維持足夠的水質(zhì)。可以排除水性糖皮質(zhì)激素(作為從飼料泄漏的結(jié)果)對(duì)所觀察到的效 果的影響。借助內(nèi)部開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的(參見(jiàn)鱗片皮質(zhì)醇)超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)分析皮質(zhì)醇、其前體和代謝物，揭示在喂食之后2.5h內(nèi)水中提高的皮質(zhì)醇濃度恢復(fù) 至基線。
[0156]通常用作應(yīng)激指標(biāo)的五個(gè)血液參數(shù)的結(jié)果確認(rèn)，可以分別認(rèn)為DEX魚類是陰性對(duì) 照并且C0RT魚類是陽(yáng)性對(duì)照（圖6)。血漿皮質(zhì)醇在C0RT組(C0RT相對(duì)于CTR: P<0.0001)中提 高，確認(rèn)了皮質(zhì)醇從飼料吸收到血液中；在STRESS魚中，皮質(zhì)醇水平與陰性對(duì)照沒(méi)有區(qū)別， 表明了后者不適用于慢性應(yīng)激評(píng)估。次要應(yīng)激參數(shù)血漿葡萄糖(反映了預(yù)測(cè)的糖皮質(zhì)激素 作用（糖原異生））在DEX(DEX相對(duì)于CTR:P<0.0001)中增加，而C0RT(C0RT相對(duì)于CTR:P = 0.2004)和STRESS(STRESS相對(duì)于CTR:P = 0.0531)沒(méi)有顯著差異，與DEX的更強(qiáng)效的作用一 致。血漿乳酸鹽在DEX(DEX相對(duì)于CTR:P<0.0001)和C0RT(C0RT相對(duì)于CTR:P = 0.0004)中增 加，但是在STRESS (STRESS相對(duì)于CTR :P = 0.4224)中不顯著，與DEX和CORT的下游效應(yīng)一致。 血漿總鈣和同滲質(zhì)量摩爾濃度不受影響，表明處理未超過(guò)魚類的恢復(fù)力(resilience)并且 不產(chǎn)生痛苦(distress)。我們得出結(jié)論：（i)CTR、DEX和C0RT處理引起了預(yù)期的糖皮質(zhì)激素 作用；（ii)在STRESS魚類的血漿中，沒(méi)有觀察到HPI軸的活化的跡象；（iii)血漿參數(shù)是慢性 應(yīng)激的差的預(yù)測(cè)物，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮o定時(shí)刻反映出不多于一張的應(yīng)激反應(yīng)的快照。
[0157] 根據(jù)以上得出，慢性應(yīng)激的魚類中的血漿皮質(zhì)醇值未提供對(duì)于所經(jīng)歷的應(yīng)激來(lái)說(shuō) 足夠的讀數(shù)。然而，圖7顯示，內(nèi)分泌應(yīng)激軸是最確定被活化的。下丘腦、垂體遠(yuǎn)側(cè)部、和腎間 組織各自的關(guān)鍵基因erf (STRESS相對(duì)于CTR:P = 0.0002)、pomc( STRESS相對(duì)于CTR:P< 0.0001)、和star(STRESS相對(duì)于CTR:P = 0.0140)的表達(dá)確實(shí)顯著上調(diào)。由顯著降低的pome 表達(dá)(DEX相對(duì)于CTR: P = 0.0236)表明了負(fù)糖皮質(zhì)激素反饋。
[0158] 在血漿皮質(zhì)醇的水平不可見(jiàn)的慢性應(yīng)激的第二條證據(jù)是編碼鰓Na+/K+-ATP酶的al 亞基的基因的上調(diào)74(圖8)。在DEX (DEX相對(duì)于CTR: P = 0.0001 )、CORT (C0RT相對(duì)于CTR: P < 0.0001)和STRESS(STRESS相對(duì)于CTR:P = 0.0215)魚類中，發(fā)現(xiàn)了顯著增強(qiáng)的表達(dá)水平，表 明了皮質(zhì)激素作用。
[0159]總而言之，結(jié)果表明，STRESS組的魚類是慢性應(yīng)激的。我們之后著手于骨鱗中皮質(zhì) 醇的量化。
[0160] 2)作為慢性應(yīng)激的生物標(biāo)記物的魚類的個(gè)體發(fā)育鱗片中的皮質(zhì)醇
[0161] 利用驗(yàn)證的 UPLC-MS/MS 方法（根據(jù) Commission Decision No. 2002/657/EC 的要 求)在NBN EN IS0/IEC 17025監(jiān)管環(huán)境中分析五個(gè)(第21天）至六個(gè)(第42天)鱗片的皮質(zhì) 醇。所有CTR和DEX魚類顯示出低于檢測(cè)能力(CCf3)的鱗片皮質(zhì)醇值；12只C0RT魚中的10只在 第21天顯示出高于CCf3的值并且全部在第42天高于CCf3; 11只STRESS魚中的7只在第21天顯 示出高于CC0的值并且全部在第42天高于C〇3(圖9)。在對(duì)處理進(jìn)行比較時(shí)，在第21天，對(duì)于 ⑶RT魚類（C0RT相對(duì)于CTR: P<0.0001)發(fā)現(xiàn)了明顯的累積；在第42天，對(duì)于STRESS魚類 (STRESS相對(duì)于CTR: P = 0.0001)發(fā)現(xiàn)了明顯的累積。當(dāng)在從21至42天的處理內(nèi)進(jìn)行比較時(shí)， 分別在STRESS(P = 0.0031)和C0RT(P = 0.0026)魚類中發(fā)現(xiàn)了鱗片皮質(zhì)醇的明顯增加。這些 發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)的鱗片中皮質(zhì)醇隨時(shí)間的結(jié)合和累積一致，并且驗(yàn)證了鱗片皮質(zhì)醇含量為慢性 應(yīng)激的生物標(biāo)記物。與通過(guò)DEX阻斷內(nèi)源皮質(zhì)醇產(chǎn)生的預(yù)測(cè)效果一致，我們發(fā)現(xiàn)在DEX處理 的魚類的鱗片中沒(méi)有皮質(zhì)醇結(jié)合。另一方面，喂食皮質(zhì)醇和使魚類物理應(yīng)激增強(qiáng)了鱗片皮 質(zhì)醇水平。
[0162] 總而言之，個(gè)體發(fā)育鱗片中皮質(zhì)醇的結(jié)果確認(rèn)了，鱗片中的皮質(zhì)醇反映了魚類隨 時(shí)間經(jīng)歷的應(yīng)激水平。我們著手于作為用于慢性應(yīng)激量化的額外工具的再生鱗片中皮質(zhì)醇 的量化及其與最充足的基質(zhì)蛋白質(zhì)膠原蛋白la的基因表達(dá)水平的相關(guān)性。
[0163] c)在個(gè)體發(fā)育鱗片之后，皮質(zhì)醇還在再生鱗片中積累
[0164] 在移除個(gè)體發(fā)育鱗片之后21天，在每只魚5個(gè)再生鱗片中測(cè)定皮質(zhì)醇濃度（圖10)。 發(fā)現(xiàn)collal的MNE在個(gè)體發(fā)育鱗片中受到抑制并且與高血漿皮質(zhì)醇水平相關(guān)，與糖皮質(zhì)激 素對(duì)骨形成的公知的抑制效果一致。如由在所有處理中相似的collal表達(dá)所示出的，在再 生鱗片中，造骨細(xì)胞(形成鱗片的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞 75)似乎對(duì)糖皮質(zhì)激素反饋不敏感。形態(tài)學(xué) 上，發(fā)現(xiàn)CTR、STRESS、和⑶RT的再生鱗片是相似的，而DEX魚類的鱗片的面積、周長(zhǎng)和隆起 (ridge)的數(shù)量顯示出明顯更低的值，表明受打擾的和延緩的再生。在第42天，在再生和個(gè) 體發(fā)育鱗片取樣時(shí)CORT魚類中的高皮質(zhì)醇血漿水平與高鱗片皮質(zhì)醇含量相關(guān)，并且這確認(rèn) 了游離的皮質(zhì)醇在鱗片中結(jié)合。此外，STRESS魚類中的再生鱗片皮質(zhì)醇含量似乎還沒(méi)有明 顯高于CTR但是低于C0RT，表明基質(zhì)中皮質(zhì)醇的最大隔離（sequestering)尚未未達(dá)到。在此 應(yīng)當(dāng)注意所分析的基質(zhì)的極其低的量(平均4mg的鱗片）。觀察到C0RT魚類(C0RT相對(duì)于CTR: P<0.0001)中鱗片皮質(zhì)醇的明顯增加。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與鱗片中皮質(zhì)醇隨時(shí)間的結(jié)合和累積一 致，并且可以得到較高的血漿皮質(zhì)醇水平，因此再次確認(rèn)了我們關(guān)于個(gè)體發(fā)育鱗片的發(fā)現(xiàn)。 再生鱗片的結(jié)果證實(shí)了個(gè)體發(fā)育鱗片的結(jié)果，以及因此證明了鱗片中的皮質(zhì)醇反映魚類隨 時(shí)間經(jīng)歷的應(yīng)激水平的事實(shí)。
[0165] 實(shí)施例4:羅非魚(莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus))的鱗片中糖皮質(zhì) 激素水平的量化
[0166]方法和材料(參見(jiàn)實(shí)施例1并且進(jìn)一步)
[0167] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0168] 利用羅非魚的試驗(yàn)存在4個(gè)條件的2次重復(fù)，各自具有6條魚:對(duì)照（未應(yīng)激的）、地 塞米松(dexamethasone)(應(yīng)激通路的抑制）、皮質(zhì)醇(應(yīng)激通路的活化)和通過(guò)以隨機(jī)施用 方式提供的各種應(yīng)激物6周誘導(dǎo)的應(yīng)激。
[0169] 方法
[0170] 實(shí)驗(yàn)操作根據(jù)荷蘭法規(guī)并且由Radboud大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)（Animal Ethics Committee of the Radboud University)批準(zhǔn)（許可編號(hào)：RU-DEC2013-192)。在Nijmegen 的Radboud大學(xué)飼養(yǎng)常見(jiàn)的羅非魚（莫桑比克羅非魚(Oreochromis mossambicus))以確保 歷史。將維持在12:12h光亮:黑暗下、每天以體重的0.9%喂食2餐(09.30am和15.30pm)的生 長(zhǎng)中的成年魚（在第21天時(shí)：321 ±37g和26.0 ± 0.9cm;在第42天時(shí)：328 ±38g和26.5 土 0.9cm)在20.0 ± 0.4 °C保持6周。分別設(shè)置兩組，每組2個(gè)重復(fù)的箱，每個(gè)140-L箱6條魚。留下 CTR組的魚不受打擾。使STRESS組每天應(yīng)激一次;應(yīng)激物的類型、持續(xù)時(shí)間和時(shí)機(jī)隨機(jī)應(yīng)用 并且包括：網(wǎng)捕（15-60min)、空氣暴露（l-3min)、溫度下降（高達(dá)5°C)、追捕(高達(dá)10min)和 限制(在具有低水位的桶中）。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，沒(méi)有注意到受損害的健康和行為的跡象。在 42天之后，將魚在2-苯氧基-乙醇(0.1 % v/v)中麻醉并且處死，從尾部血管取血并收集鱗片 (個(gè)體發(fā)育的和21天再生的鱗片）。分析血漿的皮質(zhì)醇、葡萄糖7()、總鈣 71、和同滲質(zhì)量摩爾濃 度7()。從側(cè)線背側(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化的排對(duì)鱗片進(jìn)行取樣并且使用超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法 (UPLC-MS/MS)分析。
[0171] 結(jié)果
[0172]原理的控制和實(shí)驗(yàn)設(shè)置的執(zhí)行
[0173] 在6周的試驗(yàn)期間，我們比較了不受打擾的（CTR)和每日應(yīng)激的（STRESS)羅非魚。 在所有處理中，所提供的喂食量在5分鐘內(nèi)消耗，如通過(guò)條件因素 73表明的，所有魚保持臨床 健康，并且未觀察到死亡。通過(guò)每日（pH、溫度、溶解氧）或每周（亞硝酸鹽、硝酸鹽、銨）監(jiān)測(cè) 維持足夠的水質(zhì)?？梢耘懦蕴瞧べ|(zhì)激素(作為從飼料泄漏的結(jié)果)對(duì)所觀察到的效果的 影響。借助內(nèi)部開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的UPLC-MS/MS分析皮質(zhì)醇、其前體和代謝物，揭示在喂食之后 2.5h內(nèi)水中提高的皮質(zhì)醇濃度恢復(fù)至基線。
[0174] 分析通常用作應(yīng)激指標(biāo)的四個(gè)血液參數(shù)（圖11)。血漿皮質(zhì)醇在STRESS組(STRESS 相對(duì)于CTR:P = 0.0014)中提高，表明了后者適用于急性應(yīng)激評(píng)估。次要應(yīng)激參數(shù)血漿葡萄 糖(反映了預(yù)測(cè)的糖皮質(zhì)激素作用(糖原異生））在STRESS(STRESS相對(duì)于CTR:P = 0.0006)中 增加并且差異顯著。血漿總鈣和同滲質(zhì)量摩爾濃度不受影響，表明處理未超過(guò)魚類的恢復(fù) 力并且不產(chǎn)生痛苦(distress)。我們得出結(jié)論：（i)在STRESS魚類的血漿中觀察到HPI軸的 活化的跡象時(shí)，STRESS處理引起了預(yù)期的糖皮質(zhì)激素作用;并且（ii)血漿參數(shù)是慢性應(yīng)激 的差的預(yù)測(cè)物，因?yàn)樗鼈冊(cè)诮o定時(shí)刻反映不多于一張的應(yīng)激反應(yīng)的快照。
[0175] 作為慢性應(yīng)激的生物標(biāo)記物的魚類的個(gè)體發(fā)育鱗片中的皮質(zhì)醇
[0176] 利用驗(yàn)證的 UPLC-MS/MS 方法（根據(jù) Commission Decision No. 2002/657/EC(EC， 2002)的要求)在NBN EN IS0/IEC 17025(EN IS0/IEC，2005)監(jiān)管環(huán)境中分析五個(gè)(第21天） 至六個(gè)(第42天)鱗片的皮質(zhì)醇。
[0177] 在第21天，所有CTR和STRESS魚類顯示出低于判定限(CCa)的鱗片皮質(zhì)醇值，而在 第42天，STRESS魚類的水平大多高于CCa(圖12)。
[0178] 在對(duì)處理進(jìn)行比較時(shí)，在第21天，對(duì)于STRESS魚類(STRESS相對(duì)于CTR: P = 0.0590) 發(fā)現(xiàn)了接近明顯的累積;在第42天，對(duì)于STRESS魚類(STRESS相對(duì)于CTR: P = 0.0515)發(fā)現(xiàn)了 接近明顯的累積。當(dāng)在從21至42天的處理內(nèi)進(jìn)行比較時(shí)，在CTR(P = 0.3962)中發(fā)現(xiàn)了鱗片 皮質(zhì)醇沒(méi)有明顯增加，而在STRESS(P = 0.0020)魚類中發(fā)現(xiàn)了鱗片皮質(zhì)醇的明顯增加。這些 發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)的鱗片中皮質(zhì)醇隨時(shí)間的結(jié)合和累積一致，并且進(jìn)一步驗(yàn)證了鱗片皮質(zhì)醇含量 為慢性應(yīng)激的生物標(biāo)記物。與對(duì)照組中的預(yù)測(cè)效果一致，我們發(fā)現(xiàn)CTR魚類(CTR21相對(duì)于 CTR42: P = 0.0770)的鱗片中沒(méi)有明顯的皮質(zhì)醇結(jié)合。另一方面，使魚類物理應(yīng)激增強(qiáng)了鱗 片皮質(zhì)醇水平（STRESS21 相對(duì)于STRESS42 :P<0 ? 0001)。
[0179] 總而言之，個(gè)體發(fā)育鱗片中皮質(zhì)醇的結(jié)果確認(rèn)了我們最初在鯉魚中的發(fā)現(xiàn)，鱗片 中的皮質(zhì)醇反映了魚類隨時(shí)間經(jīng)歷的應(yīng)激水平。我們著手于作為用于慢性應(yīng)激量化的額外 工具的再生鱗片中皮質(zhì)醇的量化。
[0180] 在個(gè)體發(fā)育鱗片之后，皮質(zhì)醇還在再生鱗片中積累
[0181] 在移除個(gè)體發(fā)育鱗片之后21天，在每只魚5個(gè)再生鱗片中測(cè)定皮質(zhì)醇濃度(圖13)。
[0182] 觀察到STRESS魚類（STRESS相對(duì)于CTR:P = 0.0105)中再生鱗片皮質(zhì)醇的明顯增 加。在第42天取樣再生和個(gè)體發(fā)育鱗片時(shí)STRESS魚類中的高皮質(zhì)醇血漿水平與高鱗片皮質(zhì) 醇含量相關(guān)，并且這確認(rèn)了我們的假設(shè)，游離的皮質(zhì)醇結(jié)合在鱗片中。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)的鱗 片中皮質(zhì)醇隨時(shí)間的結(jié)合和累積一致，具有高的血漿皮質(zhì)醇水平，因此再次確認(rèn)了我們關(guān) 于個(gè)體發(fā)育鱗片的發(fā)現(xiàn)。再生鱗片的結(jié)果證實(shí)了個(gè)體發(fā)育鱗片的結(jié)果以及我們之前關(guān)于鯉 魚的發(fā)現(xiàn)，并且因此確認(rèn)了鱗片中的皮質(zhì)醇反映魚類隨時(shí)間經(jīng)歷的應(yīng)激水平的事實(shí)。
[0183] 血漿中以及備選基質(zhì)如排泄物、黏液和水中的皮質(zhì)醇的測(cè)定不適用于慢性應(yīng)激的 評(píng)估。我們示出了，鱗片皮質(zhì)醇含量高度適用于魚類中慢性應(yīng)激的量化，這種想法使得鱗片 皮質(zhì)醇成為與魚類相關(guān)的科學(xué)和行業(yè)(例如，生理學(xué)、毒理學(xué)、免疫學(xué)、行為研究等）中具有 高潛在影響的創(chuàng)新的和超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)水平的生物標(biāo)記物。對(duì)于鯉魚和對(duì)于羅非魚給出的發(fā) 現(xiàn)適用于所有具有骨鱗的魚類(例如，鯉魚）。在較廣泛的意義上，盾鱗(例如，鯊魚)和硬鱗 (例如，舞魚）也是適合的，使這種生物標(biāo)記物的用途擴(kuò)展到其他輻鰭亞綱 (8(：1：；[110卩丨6巧〖1311)物種和甚至軟骨魚綱（011011(11'；[011丨5^11)物種。最后，這種用于慢性應(yīng)激 監(jiān)測(cè)的新型工具具有可能用于大范圍的政府、學(xué)術(shù)和工業(yè)環(huán)境的巨大價(jià)值，如對(duì)動(dòng)物友好 的水產(chǎn)養(yǎng)殖做決策(例如再循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的基于動(dòng)物的優(yōu)化和產(chǎn)品質(zhì)量的改善）、野生 魚類種群的監(jiān)測(cè)（例如基于生態(tài)學(xué)的種群動(dòng)態(tài)）、在公共水族館和在動(dòng)物試驗(yàn)中的魚類福 利。保證了用于對(duì)魚類鱗片中皮質(zhì)醇的現(xiàn)場(chǎng)分析的經(jīng)濟(jì)上、邏輯上、且廣泛適用的可行的測(cè) 定的開(kāi)發(fā)。
[0_ 實(shí)施例5:鮭魚的鱗片中糖皮質(zhì)激素水平的量化
[0185] 方法和材料(參見(jiàn)實(shí)施例1)
[0186] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0187] 針對(duì)鮭魚中的慢性應(yīng)激，在與美國(guó)的拓展合作框架內(nèi)，盲法分析大鱗大麻哈魚 (Chinook salmon)的十二只樣品(預(yù)應(yīng)激和應(yīng)激(1小時(shí)限制））的鱗片糖皮質(zhì)激素。
[0188] 莖里
[0190] 實(shí)施例6:海鯛魚和海鱸魚的鱗片中糖皮質(zhì)激素水平的量化
[0191] 方法和材料(參見(jiàn)實(shí)施例1)
[0192] 實(shí)驗(yàn)設(shè)置
[0193] 利用海f盧魚（歐洲海f盧魚（Dicentrarchus labrax))和海鯛魚（赤鯛（Pagrus pagrus))測(cè)試魚類的調(diào)節(jié)的影響(第一天與第3天）。
[0194] 莖里
[0195] 海鱸魚
[0199] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包括： -從所述魚中獲得至少一個(gè)鱗片， _從所述鱗片中萃取糖皮質(zhì)激素， -將從所述鱗片中萃取的糖皮質(zhì)激素純化， -量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和 -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，糖皮質(zhì)激素是皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、17α-羥基孕酮、11-脫氧 皮質(zhì)醇、11-脫氧皮質(zhì)酮、可的松、20-二氫可的松、四氫皮質(zhì)醇和/或四氫可的松。3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的方法，其中所述魚屬于真骨魚類(Teleostei)的次綱。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的方法，其中所述從所述魚中獲得至少一個(gè)鱗片是從所述魚 中獲得40至80個(gè)之間的鱗片。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述萃取糖皮質(zhì)激素通過(guò)加入甲醇作為萃取溶 劑進(jìn)行。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述用甲醇萃取之后進(jìn)行固相萃取。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述萃取的糖皮質(zhì)激素的量化通過(guò)與串聯(lián)質(zhì)譜 法偶聯(lián)的液相色譜法、與紫外線偶聯(lián)的高效液相色譜法、二極管陣列或熒光檢測(cè)、氣相色譜 法、放射性免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定或基于傳感器的技術(shù)進(jìn)行。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述與串聯(lián)質(zhì)譜法偶聯(lián)的液相色譜法是超高效液 相串聯(lián)質(zhì)譜法。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述免疫測(cè)定是放射性免疫測(cè)定或酶免疫測(cè)定。10. 從魚中取樣的魚鱗用于量化所述魚的慢性應(yīng)激水平的用途。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述量化通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的方法進(jìn) 行。12. 從魚中取樣的脊、鰭條或耳石用于量化所述魚的慢性應(yīng)激水平的用途。13. -種用于量化魚中慢性應(yīng)激水平的體外方法，所述方法包括： -從所述魚中獲得至少一個(gè)脊、鰭條或耳石， -從所述脊、鰭條或耳石中萃取糖皮質(zhì)激素， -將從所述脊、鰭條或耳石中萃取的糖皮質(zhì)激素純化， -量化所述純化的糖皮質(zhì)激素，和 -將所述量化的糖皮質(zhì)激素與慢性應(yīng)激水平相關(guān)聯(lián)。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK105899950SQ201480068751
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年12月17日
【發(fā)明人】約翰·阿茲, 薩拉·德·賽杰
【申請(qǐng)人】根特大學(xué), 農(nóng)業(yè)漁業(yè)研究所