本發(fā)明涉及一種檢測人附睪蛋白4(HE4)的化學發(fā)光酶免疫檢測試劑盒，用于檢測卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的濃度，可用作監(jiān)測卵巢癌的疾病狀態(tài)、反映治療療效、早期發(fā)現(xiàn)、癌癥復發(fā)情況，屬于免疫學檢測領(lǐng)域。

技術(shù)背景

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，也是婦科腫瘤死亡率最高的腫瘤類型。卵巢癌高危人群包括：50歲以上的絕經(jīng)女性；未婚或晚婚、不育或少育、不哺乳的女性；使用促排卵藥物的不孕癥者；有遺傳性卵巢家族史的女性，有乳腺癌家族史者，有非息肉性結(jié)腸癌家族史者。卵巢癌通常表現(xiàn)為附件腫塊，因臨床癥狀不明顯，容易造成漏診與誤診。因此，超過70-75％的卵巢癌患者確診時已處于癌癥晚期，并已擴散到其他器官，錯過了最佳治療時機。

目前，卵巢癌的診斷主要依據(jù)兩種檢測手段。一種是經(jīng)陰道超聲檢查。這種方法盡管應用較為普遍，但并不能準確檢測出該腫塊是良性還是惡性；另一種方法是檢測生物標志物CA125，但是CA125的特異性及敏感度較低，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性。大約50％的卵巢癌I期患者并沒有CA125水平升高的現(xiàn)象，也就是說有一半的卵巢癌患者可能被漏診。

人附睪蛋白4(human epididymis gene product 4,HE4)為WFDC2基因的編碼產(chǎn)物，是一種分泌蛋白，屬于乳酸蛋白結(jié)構(gòu)域家族蛋白，是很有診斷潛力的卵巢腫瘤標志物。正常生理情況下，HE4在人體中有非常低水平的表達，但在卵巢癌組織和患者血清中均高度表達，可用于卵巢癌的早期診斷、鑒別、治療監(jiān)測及預后評估。88％的卵巢癌患者都會出現(xiàn)HE4升高的現(xiàn)象。

與CA125相比，HE4的靈敏度更高、特異性更強，尤其在疾病初期無癥狀表現(xiàn)階段。HE4在良性腫瘤患者和正常人血清中含量極低，而在93％的卵巢漿液性癌及100％的卵巢子宮內(nèi)膜樣癌中呈陽性表達。HE4在鑒別卵巢腫瘤的良惡性質(zhì)時靈敏度達到72.9％，明顯優(yōu)于CA125的43.3％((特異度為95％時)；單一HE4對I期卵巢癌診斷的靈敏度45.9％也明顯優(yōu)于單一CA125對I期15.1％(特異度為95％時)HE4與CA125是相互補充的標志物，兩者聯(lián)合應用，敏感性可增加到92％，能將假陰性結(jié)果減少30％，大大增加了卵巢癌診斷的準確性。CA125和HE4聯(lián)合檢測是卵巢癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期診斷的敏感性達到60.0％、77.80％、95.20％和100.00％.

鑒于此，建立一種有效、快速、簡單、靈敏的檢測HE4的方法具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種人附睪蛋白4(HE4)的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒及應用。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特點，用于檢測卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的濃度。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用了化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法，該方法是化學發(fā)光法和酶聯(lián)免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時具有化學發(fā)光法的高靈敏性和免疫分析法的高特異性。該方法采用了一步雙抗體夾心法，主要原理是將包被抗體包被于微孔板中形成固相抗體，在包被后的微孔中加入標準品、質(zhì)控品、樣品，再加入生物素標記抗HE4抗體，再加入HRP-鏈酶親和素反應后，棄上清洗滌，最終形成固相抗體—抗原—生物素標記抗HE4檢測抗體—HRP-鏈酶親和素復合物，加入發(fā)光液A液、B液，立刻讀數(shù)獲得RLU值。在整個反應過程中，樣品中HE4含量越高，反應體系中發(fā)光強度越強RLU值越高；反之，樣品中HE4含量越少，發(fā)光強度越弱RLU值越低。

本發(fā)明提供了HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)測定方法及其檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內(nèi)的化學發(fā)光板和設在盒體內(nèi)的試劑，包括：

1.化學發(fā)光板。為白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化學發(fā)光板，各孔包被有抗HE4的抗體，抗體包被濃度為5.0μg/mL。

2.HE4系列標準品溶液。濃度分別為：0、50、70、250、500、1800pmol/L。

3.HE4系列質(zhì)控品溶液。濃度分別為：250±80、70±14pmol/L。

4.生物素標記抗HE4抗體。由抗HE4抗體與生物素偶合制成的偶聯(lián)物作為檢測抗體。

5.辣根過氧化物酶(HRP)標記的鏈酶親和素。

6.化學發(fā)光溶液A、B液。A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.001M pH＝8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為每100mL溶液含檸檬酸2.1g，無水Na₂HPO₄ 2.82g，0.75％的過氧化氫脲0.64mL的水溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。

7.濃縮洗滌液。濃縮洗滌溶液具體為含有吐溫-20(Tween-20)緩沖液的20倍濃縮磷酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于實驗過程中洗滌化學發(fā)光板。

本發(fā)明提供的HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的制備過程對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度以及相關(guān)性能影響很大，其制備關(guān)鍵步驟如下：

1.預包被化學發(fā)光板的制備：采用將抗HE4抗體置于設定的包被溶液中，以設定的濃度，在37℃恒溫箱中反應2小時包被。采用的抗體包被濃度為5.0μg/mL，采用的是pH＝9.5的碳酸鈉—碳酸氫鈉緩沖溶液。微孔板中所包被的抗HE4抗體在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上，可以經(jīng)受多次洗板。包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，在37℃恒溫箱中反應2小時封閉。

2.HE4系列標準品溶液的制備：HE4抗原溶液濃度是決定本發(fā)明中HE4酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。將HE4抗原溶液可以用抗原稀釋液稀釋成1:1000的工作濃度，而后按照倍比稀釋的方法稀釋抗原至終濃度為0、50、70、250、500、1800pmol/L的系列標準品溶液。

3.HE4系列質(zhì)控溶液的制備：HE4質(zhì)控溶液濃度是本發(fā)明中HE4酶聯(lián)免疫檢測試劑盒實驗操作質(zhì)控的重要因素。將HE4抗原純品溶液用抗原稀釋液稀釋成1:1000的工作濃度，而后稀釋至終濃度為250、70pmol/L的質(zhì)控溶液。

4.生物素標記抗HE4抗體的制備：10μl標記抗體加1μl溶解后的生物素，用標記液稀釋至100μl，37℃水浴鍋中反應1小時，而后轉(zhuǎn)移至準備好的透析袋中，置于透析液中，置在磁力攪拌器上進行透析，透析液需4～6h更換一次，更換5次后即可收抗體。

本發(fā)明提供的HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的內(nèi)設以及制備過程中的試劑溶液對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度影響很大，所涉及相關(guān)溶液的配制方法如下：

1.HE4標準品溶液：以既定方法將HE4抗原純品用抗原稀釋液配制成濃度分別為0、50、70、250、500、1800pmol/L的HE4系列標準溶液。

2.HE4質(zhì)控品溶液：以既定方法將HE4抗原純品用抗原稀釋液配制成濃度分別為250、70pmol/L的質(zhì)控品溶液。

3.生物素標記抗HE4抗體：按照既定方法將生物素與抗體進行偶聯(lián)透析后獲得的生物素標記抗HE4抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:2000的工作濃度作為檢測抗體。

4.抗原稀釋液：為含有BSA，蔗糖的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有20g BSA，50g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄的水溶液。

5.抗體稀釋液：為含有蔗糖的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH＝7.4，是每升含有50g蔗糖，8g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，1.44g Na₂HPO₄的水溶液。

6.化學發(fā)光溶液：A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.001M，pH＝8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為每100mL溶液含檸檬酸2.1g，無水Na₂HPO₄ 2.82g，0.75％的過氧化氫脲0.64mL的水溶液。

7.濃縮洗滌液：按體積分數(shù)0.05％將吐溫-20添加至pH＝7.4，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液中。

8.包被溶液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH＝9.5。

9.封閉溶液：10g BSA溶于1L洗滌溶液中，再加入重量比為5‰的P300。

10.標記液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH＝9.5。

11.透析液：0.24g磷酸二氫鈉、1.44g磷酸氫二鈉、8g氯化鈉、0.2g氯化鉀溶于1L水中，調(diào)節(jié)PH＝7.4。

本發(fā)明提供了HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)測定方法的檢測步驟如下：

1.使用前，將試劑盒所有組分于室溫下放置20分鐘，清洗液(20×)在使用前必須用純化水稀釋20倍，鏈霉親和素-HRP用酶稀釋液稀釋1000倍后使用，避光存放。

2.化學發(fā)光板使用前每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干)。重復此操作2次。

3.將校準品、質(zhì)控品或血清樣本各10μl分別加入化學發(fā)光板微孔中，再加入生物素標記的抗HE4抗體50μl，再加HRP標記的抗HE4抗體50μl，震蕩混勻后，用封板膜封板，37℃水浴10分鐘。

4.甩去化學發(fā)光板孔內(nèi)液體，每孔加200μl清洗液，等待30秒后甩盡清洗液，并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干)。重復此操作5次。

5.加入100μl發(fā)光液A發(fā)光液B混合液(A、B液體積比例為1:1)立刻置于化學發(fā)光儀上讀數(shù)，獲得RLU值。

6.根據(jù)標準品的RLU值和濃度為坐標軸，選擇合適的數(shù)學模型建立標準曲線。將樣本的RLU值，代入上述的標準曲線中，得出樣本濃度。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有高靈敏度、簡便快速、準確度高的特點，與傳統(tǒng)的ELISA法比較，操作時間大幅度減少?？捎米鳈z測卵巢癌的輔助診斷。

附圖說明：

圖1：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的原理概述圖。

圖2：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的工藝流程圖。

圖3：為HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的標準曲線。

圖4：為HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的線性考察結(jié)果圖。

圖5：為HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒測定病人血清與正常人的血清HE4含量的散點圖。

具體實施方式

實施例一：抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣法)

縱向用每種包被抗體按80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625μg/mL的系列稀釋度包被化學發(fā)光板，100μl/孔，置于37℃恒溫箱2小時后，拍干；以150μl/孔封閉溶液封閉，37℃恒溫箱放置2小時，洗板一次，拍干；加入50μl/孔一系列稀釋的HE4抗原(1:1000至1:512000)，再加生物素標記抗HE4抗體，再加入鏈酶親和素-HRP，37℃水浴10分鐘，洗板五次，最后一次拍干；分別加入100μl發(fā)光液A發(fā)光液B混合液(比例為1:1)測定發(fā)光強度值RLU值。以發(fā)光強度值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進行特異性測定。

根據(jù)上述對包被抗體及抗原濃度的優(yōu)選實驗中確定，包被抗體濃度為5.0μg/mL，抗原標準品的最高點工作濃度為1:1000，即800pmol/L。

實施例二：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的標準曲線

根據(jù)HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)測定方法的檢測步驟，獲得HE4系列標準品的發(fā)光值RLU。根據(jù)標準品的RLU值和濃度為坐標軸，選擇合適的數(shù)學模型建立標準曲線，

標準曲線如圖2所示，其相關(guān)系數(shù)r＝0.9999。

實施例三：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的準確度

根據(jù)HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)測定方法的檢測步驟，取定值樣本進行檢測。重復測量3次后，其平均結(jié)果記為M，根據(jù)公式(1)計算測量濃度的相對偏差。

B＝(M-T)/T×100％·················公式(1)

式中：

B—相對偏差；

M—測量濃度3次結(jié)果的平均值；

T—定值樣本的濃度。

準確度結(jié)果如表1所示，其相對偏差為3.06％，小于10％，顯示該試劑盒在檢測樣本時具有較好的準確度：

表1：

實施例四：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的最低檢測限

用零濃度樣本作為樣本進行檢測，重復測定20次，得出20次測量結(jié)果的發(fā)光值值(RLU值)，計算其平均值(M)和標準差(SD)，得出M+2SD所對應的RLU值，根據(jù)試劑盒所用校準品的定標曲線方程，將M+2SD所對應的RLU值帶入上述方程中，求出對應的濃度值，即為檢測限。

檢測限結(jié)果如表2所示，檢測限為1.84pmol/L。

表2：

實施例五：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的線性

用樣本稀釋液將接近線性范圍上限的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度，其中低值濃度樣本須接近線性范圍的下限。將每一濃度樣本重復檢測2次，計算其濃度的平均值，將結(jié)果平均值和稀釋后的樣本濃度用最小二乘法進行直線擬合，并計算線性相關(guān)系數(shù)r。

線性考察圖如圖3所示，其r＝0.999，相關(guān)系數(shù)大于0.9900，試劑盒線性相關(guān)性較好。

實施例六 HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的重復性

用兩個濃度水平的樣本各重復檢測10次，計算10次測量濃度結(jié)果的平均值M和標準差SD，根據(jù)公式(2)得出變異系數(shù)CV。

CV＝SD/M×100％····················公式(2)

式中：

CV—變異系數(shù)；

SD—10次測量結(jié)果的標準差；

M—10次測量結(jié)果的平均值。

重復性結(jié)果如表3所示，變異系數(shù)CV均小于15％，顯示該試劑盒在檢測樣本時具有較好的重復性：

表3：

實施例六：HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)檢測試劑盒的臨床樣本檢測情況

根據(jù)HE4的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)測定方法的檢測步驟，選擇了34例病人(臨床診斷為卵巢癌)，29例正常人(臨床診斷為健康人群)的血清樣本，進行檢測，獲得了血清中HE4的濃度值，繪制散點圖。

測定結(jié)果圖4所示，該試劑盒測定的病人和正常人的血清中HE4的濃度值，具有明顯差異性，病人血清中HE4的濃度均值明顯高于血清中HE4的濃度均值。該試劑盒是一種較好的HE4濃度測定試劑盒。

本發(fā)明公開了人附睪蛋白4(HE4)的化學發(fā)光酶免疫(CLEIA)定量測定試劑盒，試劑盒用于檢測卵巢癌病人血清中的HE4蛋白的濃度，適用于卵巢癌的輔助診斷，對于監(jiān)測疾病狀態(tài)、反映治療療效、早期發(fā)現(xiàn)、癌癥復發(fā)檢查有所裨益。該試劑盒的擬合標準曲線相關(guān)系數(shù)可達r＝0.9999，大于0.9900；準確性結(jié)果相對偏差為3.06％，小于10％；檢測限為1.84pmol/L；線性考察，濃度值擬合直線的相關(guān)系數(shù)r＝0.999，相關(guān)系數(shù)大于0.9900；重復性結(jié)果的變異系數(shù)CV均小于10％；在應用于臨床樣本的檢測中能夠明顯的區(qū)分正常人和病人。該試劑盒展示了良好的準確性、線性、重復性、最低檢測限，具有良好的測定血清中的HE4蛋白的濃度的能力，可作為檢測卵巢癌的輔助診斷。本發(fā)明的試劑盒在2～8℃干燥避光可保存6個月，在2～8℃條件下運輸72小時可保持性能穩(wěn)定。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。