檢測瘧原蟲感染的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種識別患有瘧原蟲感染的受試者的方法。本發(fā)明還涉及一種用于監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者的方法，例如，在用抗瘧疾化合物治療之后進行監(jiān)測。還提供了識別治療瘧原蟲感染的化合物的方法。
【專利說明】檢測瘧原蟲感染的方法 發(fā)明領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種識別患有皰原蟲(Plasmodium)感染的受試者的方法。本發(fā)明還涉 及一種用于監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者的方法，例如，在用抗瘧疾化合物治療之后進行 監(jiān)測。還提供了識別治療瘧原蟲感染的化合物的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 皰原蟲屬種(Plasmodium spp.)是寄生原生動物，并且由這些生物體導致的人類 感染被稱為瘧疾。瘧疾是一種烈性傳染病。全世界每年存在超過3億病例，并且導致每年大 約6600億死亡。感染人類的瘧原蟲屬種是通過被感染按蚊的叮咬來傳播。惡性瘧原蟲 (Plasmodium falciparum)引起因皰疾所致的大部分死亡。然而，間日皰原蟲（Plasmodium vivax)是世界范圍內(nèi)最普遍的瘧原蟲屬種，并且導致巨大發(fā)病率。惡性瘧原蟲(導致毒力最 強的瘧疾)已發(fā)展出對當前使用的藥物的耐藥性。這又導致瘧疾的發(fā)生率增加，并且導致用 于治療和預防該疾病的藥物較少。瘧原蟲的其它屬種(諸如，諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)和卵 形瘧原蟲(P.ovale))也可能導致人類的疾病，雖然它們主要感染其它動物。
[0004] 在蚊子食血期間，當被感染按蚊將子孢子注入受試者中時，開始瘧疾感染。在注入 之后，寄生蟲進入血流，并且作為其生命周期的一部分而經(jīng)歷一系列改變。子孢子行進至肝 臟，在其中它侵襲肝細胞。一個子孢子可產(chǎn)生超過10，〇〇〇個裂殖子，所述裂殖子隨后將從肝 細胞中破裂并且侵襲紅細胞，但間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲可在肝臟中保持休眠(休眠體)并 在初始感染數(shù)年之后導致復發(fā)。在其紅細胞內(nèi)階段中，裂殖子經(jīng)歷各種形式(環(huán)形物、營養(yǎng) 體、裂殖體）以形成平均20個子系裂殖子，所述子系裂殖子被釋放至血流中并且感染新紅血 細胞(Biamonte等人，2013)。這導致癥狀性高燒和相關病狀。
[0005] 瘧疾病通常是通過血涂片的顯微鏡檢查或通過基于抗原的迅速診斷性試驗(RDT) 來確認。顯微術是最常用于檢測瘧原蟲的方法一 2010年針對瘧疾檢查了約1.65億血涂片 (Aregawi等人，2011)。盡管其被廣泛使用，但通過顯微術進行診斷受到兩個主要缺點的困 擾:執(zhí)行該試驗的許多裝置(尤其是農(nóng)村）尚未配備，并且結(jié)果的精確度取決于檢查血涂片 的人員的技術和寄生蟲在血液中的水平。血涂片的靈敏度的范圍在最佳條件下為從75%至 90%，到低至50%。市售可用的RDT可能在預測瘧疾寄生蟲的存在方面比血涂片更為精確， 但它們的診斷靈敏度和特異性根據(jù)廠商不同有很大變化，并且不能告知存在多少寄生蟲 (Wilson,2012)〇
[0006] 作為當今瘧疾防治所面臨的最大挑戰(zhàn)之一，已出現(xiàn)對抗瘧疾藥的耐藥性。耐藥性 已涉及到瘧疾向新區(qū)域的傳播以及在已根除瘧疾的區(qū)域中再度出現(xiàn)瘧疾。在世界上某些地 方，耐藥性還在流行病的出現(xiàn)和嚴重度方面起到顯著作用(Bloland，2001)。令人遺憾地，目 前檢測耐藥性的技術(諸如PCR分析)需要數(shù)周來完成。
[0007] 需要提供更快、更廉價且非侵襲性的方式來檢測瘧原蟲感染，尤其是孕婦體內(nèi)小 孩所存在的低水平感染，以及監(jiān)測治療的效力，特別是在面對瘧原蟲屬種的耐藥菌株時。還 需要篩選治療瘧原蟲感染的化合物的新的方式。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明人已識別出可用于識別和監(jiān)測受試者中的瘧原蟲感染的新標識物。
[0010] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于識別患有瘧原蟲感染的受試者的方法，所述方 法包括在所述受試者或得自其的樣本中檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物，所述揮發(fā)性有 機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和（Z)-1-甲硫 基-1-丙烯組成的組，其中一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平指示瘧原蟲感染。
[0011] 在實施方案中，一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平還指示瘧原蟲感染的狀態(tài)。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明提供一種用于監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者的方法，所述方 法包括在所述受試者或得自其的樣本中檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物，所述揮發(fā)性有 機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和（Z)-1-甲硫 基-1-丙烯組成的組，其中所述受試者先前已知具有瘧原蟲感染，并且其中所述一種或多種 揮發(fā)性有機化合物的水平指示所述瘧原蟲感染的狀態(tài)。
[0013] 可在施用化合物以治療感染之后對受試者進行監(jiān)測。這允許確定該治療是否有 效，以及該受試者是否經(jīng)歷進一步的或變更的治療和/或監(jiān)測。
[0014] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，在施用化合物來治療感染之后短時間內(nèi)，一種或多種揮發(fā)性有 機化合物的水平在回到正常(健康)水平附近之前有所增加，并且最顯著的增加是(z)-i-甲 硫基-1-丙烯。不希望受理論限制，這可能是瘧原蟲細胞死亡的結(jié)果。因此，在實施方案中， 當與治療之前的水平相比時，在治療之后，所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平初始 增加指示所述治療是有效的。在實施方案中，至少通過檢測(z)-i-甲硫基-1-丙烯的水平監(jiān) 測初始增加。
[0015] 在用于監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者的方法的一個實施方案中，在施用所述治療 之后0.5至72小時之間，監(jiān)測受試者的所述初始增加。
[0016] 在用于監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者的方法的另一實施方案中，一種或多種揮發(fā) 性有機化合物的水平的降低指示所述治療已經(jīng)有效。在實施方案中，至少通過檢測(E)-1-甲硫基-1-丙烯的水平，監(jiān)測對所述感染有效的治療。
[0017] 在其它實施方案中，一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平降低是在一種或多種揮 發(fā)性有機化合物的水平初始增加之后。
[0018] 因為一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平可用于指示瘧原蟲感染的狀態(tài)，這允許 確定用于選擇對感染的合適治療的水平。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種選擇用于瘧原 蟲感染的合適治療的方法，所述方法包括:在受試者或得自其的樣本中檢測一種或多種揮 發(fā)性有機化合物的水平，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、 (E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯組成的組；以及基于一種或多種揮發(fā)性有機 化合物的水平來選擇合適的治療。
[0019] 合適樣本的實例包括但不必限于：呼出氣（exhaled breath )、呼吸冷凝物 (condensate breath)、唾液、血液、汗水、皮膚微生物、皮膚揮發(fā)性樣本和尿。在一個實施方 案中，樣本是呼出氣。在另一實施方案中，樣本是排除了肺泡氣的呼出氣。
[0020] 在一個實施方案中，本發(fā)明的方法還包括將一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平 與合適對照物比較。例如，當識別瘧原蟲感染時，該對照物可能與得自已知不受瘧原蟲感染 的個體的樣本(例如呼出氣）的類型相同。在另一實例中，當監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者 時，該對照物可能與得自用治療感染的化合物進行治療之前的受試者的樣本(例如呼出氣） 的類型相同。在一個實例中，受試者的呼出氣排除了肺泡氣。
[0021] 受試者可以是可能被瘧原蟲感染的任何物種。在實施方案中，受試者是動物，優(yōu)選 是哺乳動物。該動物可以是人或非人動物。例如，受試者可以選自鳥類、大鼠、小鼠、靈長類、 非人靈長類(NHP)以及人。在一些實施方案中，動物可以是人源化動物，諸如人源化小鼠或 大鼠。在一個實施方案中，受試者為人。
[0022] 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物還可以用在篩選新型抗瘧疾化合物的方法中。 因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種識別治療瘧原蟲感染的化合物的方法，所述方法包括： [0023] i)將候選化合物施用于受瘧原蟲感染的受試者；以及
[0024] ii)針對一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平來監(jiān)測所述受試者或得自其的樣 本，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙 烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯組成的組；
[0025] 其中在步驟i)之后，所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的初始增加，和/或 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的降低，指示所述化合物可用于治療瘧原蟲感 染。
[0026] 在上述方面的一個實施方案中，該受試者是實驗室動物，所述實驗室動物是瘧疾 的模式生物體。此類模式生物體是本領域已知的，并且包括轉(zhuǎn)基因的人源化小鼠和大鼠。
[0027] 此外，所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物還可以用于識別對抗瘧原蟲化合物已發(fā) 展出耐藥性的瘧原蟲的菌株。因此，在其它方面，本發(fā)明提供一種識別對抗瘧原蟲化合物已 發(fā)展出耐藥性的瘧原蟲的菌株的方法，該方法包括
[0028] i)將所述抗瘧原蟲化合物施用于受瘧原蟲菌株感染的受試者，以及
[0029] ii)針對一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平來監(jiān)測所述受試者或得自其的樣 本，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙 烯和(z)-i-甲硫基-1-丙烯組成的組，
[0030] 其中在步驟i)之后，所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平缺乏顯著改變指示 該瘧原蟲菌株具有對抗瘧原蟲化合物的耐藥性。
[0031 ]在兩個上述方面的實施方案中，該方法包括確定一種或多種揮發(fā)性有機化合物在 步驟i)之前的水平，以及將這些水平與步驟i)之后獲得的那些水平相比較。
[0032] 在兩個上述方面的另一實施方案中，該方法還包括在步驟i)之前：
[0033] 1)獲得未受瘧原蟲感染的受試者，并且在該受試者或得自其的樣本中確定所述一 種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平，以及
[0034] 2)用瘧原蟲或瘧原蟲菌株感染該受試者，并且在被感染的受試者或得自其的樣本 中確定所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平。
[0035] 在實施方案中，該方法包括將來自步驟1)和/或2)的一種或多種揮發(fā)性有機化合 物的水平與施用候選化合物或抗瘧原蟲化合物之后的所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物 的水平相比較。
[0036] 在其它實施方案中，該方法包括確定一種或多種揮發(fā)性有機化合物在步驟1)和2) 以及ii)的一個或多個之間的水平的倍數(shù)差異。
[0037] 本發(fā)明人還已識別出哪個可被認為是可用于本發(fā)明方法的二級揮發(fā)性有機化合 物。因此，在其它實施方案中，本發(fā)明的方法還包括確定一種或多種額外的揮發(fā)性有機化合 物的水平，所述額外的揮發(fā)性有機化合物選自由二氧化碳、異戊二烯、丙酮、苯和環(huán)己酮組 成的組。
[0038] 或類似通過本領域已知的任何技術可檢測/監(jiān)測一種或多種揮發(fā)性有機化合物。 實例包括但不限于以下中的一種或多種:氣相色譜質(zhì)譜學(GCMS)、液相色譜質(zhì)譜學(LCMS)、 電子鼻裝置、生物傳感器、基于抗體的檢測系統(tǒng)、比色測定、近紅外(NIR)、選擇離子流動管 質(zhì)譜學(SIFT)和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應質(zhì)譜學(PTR-MS)。在一個實例中，或類似使用氣相色譜質(zhì)譜 學(GCMS)或電子鼻裝置來檢測/監(jiān)測一種或多種揮發(fā)性有機化合物。
[0039] 所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物可被用作試劑來識別可用于本發(fā)明方法的化 合物(其可以呈組成物的形式），例如用作傳感器化合物（sensor compound)。因此，在其它 方面，本發(fā)明提供一種篩選用于識別患有瘧原蟲感染的受試者的化合物的方法，該方法包 括：
[0040] i)使候選化合物與揮發(fā)性有機化合物接觸，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基 甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯組成的組，以及
[0041] ii)確定所述化合物是否與所述揮發(fā)性有機化合物結(jié)合或反應，
[0042] 其中與揮發(fā)性有機化合物結(jié)合或反應的化合物可被用在用于識別和/或監(jiān)測患有 瘧原蟲感染的受試者的本發(fā)明方法中，和/或用在選擇合適治療的本發(fā)明方法中。
[0043] 候選化合物可能是任何類型的化合物，諸如低碳基分子或蛋白質(zhì)。在實施方案中， 該蛋白質(zhì)是抗體或受體，諸如G蛋白偶聯(lián)受體。在另一實施方案中，該候選化合物是固態(tài)傳 感器組成物。例如，該候選化合物是摻雜和無摻雜金屬氧化物傳感器。
[0044] 本發(fā)明人已識別出適合于檢測烯丙基甲基硫化物的存在的傳感器化合物。在一個 實施方案中，候選化合物是選自二氧化錫(Sn0 2)和三氧化鎢(W03)的金屬氧化物傳感器，其 中該氧化物傳感器任選地摻雜有金屬，所述金屬選自由鈀(Pd)、鉑(Pt)、銀(Ag)、銅(Cu)、或 其組合(諸如鉑銀化合物(PtAg))組成的組。在一個實施方案中，該候選化合物是摻雜有銀 的二氧化錫(摻雜有Ag的Sn0 2)。
[0045] 對2種、3種或4種揮發(fā)性有機化合物的檢測可以（例如)是烯丙基甲基硫化物、1-甲 硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯的任何組合。
[0046] -個實施方案涉及對(Z)-1-甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫基-1-丙烯、1-甲硫基丙 烷和烯丙基甲基硫化物的檢測。另一實施方案涉及對(Z)-1-甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫 基-1-丙烯和1-甲硫基丙烷的檢測。另一實施方案涉及對(Z)-1-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲 硫基-1-丙烯的檢測。
[0047] 瘧原蟲可以是其實例包括但不必限于以下的任何屬種:惡性瘧原蟲、諾氏瘧原蟲、 間日皰原蟲、卵形皰原蟲curtisi亞種（Plasmodium ovale curtisi)、卵形皰原蟲 wallikeri亞種（Plasmodium ovale wallikeri)或三日癥原蟲（Plasmodium malariae) 〇在 實施方案中，該瘧原蟲是惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲。
[0048] 在其它實施方案中，如果瘧原蟲是間日瘧原蟲，則本發(fā)明的方法至少包括檢測 (z)-i-甲硫基-1-丙烯的水平。
[0049] 除非另外明確陳述，否則本文任何實施方案都應被視為向任何其它實施方案施加 必要的變更。
[0050] 本發(fā)明在范圍上不受限于本文所述的具體實施方案，所述實施方案僅意圖用于例 示性目的。功能上等效的產(chǎn)物、組合物以及方法明顯在如本文所描述的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0051] 在本說明書中，除非另外明確陳述或上下文另外要求，否則提及單個步驟、物質(zhì)的 組合物、步驟的組或物質(zhì)組合物的組應視為涵蓋那些步驟、物質(zhì)組合物、步驟的組或物質(zhì)組 合物的組中的一個和多個(即一個或多個）。
[0052] 在下文中，本發(fā)明是借助于以下非限制性實施例且參照附圖加以描述。
[0053] 附圖簡述
[0054]圖1-從志愿者收集呼吸的照片。
[0055] 圖2-使用電動栗(c)將呼吸揮發(fā)物從呼吸袋(a)轉(zhuǎn)移至吸附管(b)的照片。
[0056] 圖3-環(huán)境空氣收集系統(tǒng)的照片。
[0057]圖4-通過直接從呼吸袋（2)對喘出氣取樣來由電子鼻（1)進行直接呼吸分析的照 片。
[0058]圖5-將具有瘧疾生物標記的加標呼吸制備為患者模擬器的示意圖，所述患者模擬 器包括健康呼吸袋（1)、微量栗(2)、兩頸圓底長頸燒瓶(3)、加標點(4)、"加標呼吸"袋(5)和 熱板加熱器(6)。
[0059] 圖6-1組的單一離子(m/z 88)GCMS色譜，示出分析時間的第一個6分鐘。在基準日 (第〇天(a))收集的樣本的色譜，當志愿者被瘧疾感染時(第4天(b))收集的樣本的色譜，注 入抗瘧疾藥之后不久(第7天-PM(c))收集的樣本的色譜，和在恢復時(第28天，（d))收集的 樣本的色譜。
[0060] 圖7-2組的單一離子(m/z 88)GCMS色譜，示出分析時間的第一個6分鐘，分別是在 基準日（第0天(a))，當志愿者被瘧疾感染時(第4天(b))，注入抗瘧疾藥不久之后(第7天-PM (c) )收集的樣本，和在恢復時(第28天(d))收集的樣本。
[0061] 圖8-1組的PCA得分圖，其基于4種硫醚(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯)和在基準日（第0天）（BL)(a)、在瘧疾感染期間(第 7天-AM)(If)(b)、在抗瘧疾藥施用之后(第7天-PM)(藥物）（c)、在恢復期(第28天）（Rec)(d) 收集的呼吸樣本的GC-MS數(shù)據(jù)（峰下面積）；以及1組的圖8a至圖8d的PCA得分圖的覆蓋圖 (e) 〇
[0062] 圖9-使用峰下面積計算的各化合物在呼吸收集的不同日間的1組的箱線圖。箱線 圖對應于（自上而下）：（Z)-1_甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫基-1-丙烯、1-甲硫基丙烷以及烯 丙基甲基硫化物。在各箱線上，中央標記是中值，該箱線的邊緣是第25和第75百分位，須線 延伸至認為不是離群值的最極端數(shù)據(jù)點，并且單獨繪出離群值。在各箱線圖之上示出的P值 對應于AN0VA試驗，并且拒絕的無效假設在于所有樣本(來自不同收集日）是抽取自具有相 同平均值的群體。
[0063] 圖10-1組針對(Z)-1-甲硫基-1-丙烯的多重比較試驗表明，在第7天-pm，藥物治療 之后6.5小時，存在顯著較高水平的化合物(無重疊區(qū)間）。
[0064] 圖11-1組的PCA得分圖，其基于4種硫醚(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯)和在基準日（第0天）（BL)(a)、在瘧疾感染期間 (第7天-AM)(If)(b)、在抗瘧疾藥施用之后(第7天-PM)(藥物）（c)、在恢復期(第28天）（Rec) (d) 收集的呼吸樣本的GC-MS數(shù)據(jù)(峰下面積）；以及2組的圖11a至圖lid的PCA得分圖的覆蓋 圖(e)。
[0065] 圖12-2組的箱線圖對應于（自上而下）：（Z)-1_甲硫基-1-丙烯、（E)-1-甲硫基-1-丙烯、1-甲硫基丙烷以及烯丙基甲基硫化物。在各箱線上，中央標記是中值，該箱線的邊緣 是第25和第75百分位，多個須延伸至認為不是離群值的最極端數(shù)據(jù)點，并且個別地繪出離 群值。在各箱線圖之上示出的P值對應于AN0VA試驗，并且拒絕的無效假設在于所有樣本(來 自不同收集日）是抽取自具有相同平均值的群體。
[0066] 圖13-2組針對(Z)-1-甲硫基-1-丙烯的多重比較試驗表明，在第8天-pm，藥物治療 之后6.5小時，存在顯著較高水平的化合物(無重疊區(qū)間）。
[0067] 圖14-對在瘧疾研究不同階段處收集的呼吸樣本診斷電子鼻響應。
[0068]圖15-針對對照呼吸樣本和具有烯丙基甲基硫化物的加標呼吸樣本（lOppb)這兩 種類別的平均分類向量的平均配對距離(average pairwise distances)。各片表示診斷電 子鼻的特征，并且示出針對各虛擬傳感器的兩種樣本之間的差異。
[0069] 圖16-使用診斷電子鼻傳感器編號2314所得的箱線圖，其對應于在時間步長6及熱 回路10處的傳感器1 (摻雜Ag的Sn02)。
[0070] 圖17-使用診斷電子鼻傳感器編號2314所得的多重比較試驗，其對應于在時間步 長6及熱回路10處的傳感器1 (摻雜Ag的Sn02)。
[0071] 圖18-(a)針對2組中收集的不同環(huán)境空氣樣本在硫醚:烯丙基甲基硫化物、(E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯）區(qū)域內(nèi)的單一離子(m/z 88)GCMS色譜。未能觀察 到峰，表明它們不存在于環(huán)境空氣樣本中（或處于非可檢測水平）。(13)針對不同環(huán)境空氣樣 本在1-甲硫基-1-丙烯的區(qū)域內(nèi)的單一離子(m/z 90)GCMS色譜。
[0072] 圖19-示出分析時間的第一個5分鐘的單一離子(m/z 88)色譜。在抗瘧疾藥注射和 呼吸加標了烯丙基甲基硫化物（lOppb)(烯丙基甲基硫化物約RT 3.75*)之后6.5小時收集 的呼吸樣本的色譜的覆蓋圖。
[0073]圖20-在瘧疾過程中針對兩個組的呼吸中揮發(fā)物與血液中寄生蟲水平。組中各參 加者在第0天被接種約1，800個靜脈內(nèi)施用的有活力的惡性瘧原蟲感染的人類紅細胞。在瘧 疾過程中收集呼吸和血液樣本。1組在第7天開始藥物治療(n = 7,左圖），并且2組在第8天開 始(n = 6,右圖），通過圖中虛豎線所示。寄生蟲血癥的生長和清除是通過藍色圓圈表示，并 且化合物的豐度是通過正方形表示:烯丙基甲基硫化物(m/z 88)、（E)-1-甲硫基-1-丙烯 (m/z 88)、（Z)-1_甲硫基-1-丙稀(m/z 88)和 1-甲硫基-丙烷(m/z 90)。
[0074]圖21-在對兩個組進行治療之前a)和之后b)，寄生蟲水平與瘧疾揮發(fā)物的豐度的 相關性。在1組中，快速作用合成臭氧化物藥物是在第7天使用，并且2組中，哌喹是在第8天 施用。
[0075]圖22-在瘧疾間日瘧原蟲感染過程中，在人類志愿者中，RBC中寄生蟲血癥的生長 和清除，以及烯丙基甲基硫化物(m/z 88)、（E)-1-甲硫基-1-丙烯(m/z 88)、（Z)-1-甲硫基-1-丙稀(m/z 88)和1-甲硫基-丙烷(m/z 90)的呼吸豐度。
[0076]發(fā)明詳述 [0077 ] 通用技術和選定的定義
[0078]除非另外明確定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都應視為具有與由本領 域(例如在細胞培養(yǎng)、寄生蟲學、瘧疾檢測、分子遺傳學、揮發(fā)性化合物檢測方法、免疫學、免 疫組織化學、蛋白質(zhì)化學和生物化學中）普通技術人員通常所理解的含義相同的含義。
[0079] 術語"和/或"，例如"X和/或Y"應理解為意指"X和Y"或"X或Y"，且將用以對于兩種 含義或?qū)τ谌我缓x提供明確的支持。
[0080] 在整篇本說明書中，用詞"包含(comprise)"或變化形式(如"包含(comprises)"或 "包含(comprising)"）應理解為暗示包括所述要素、整數(shù)或步驟、或成組要素、整數(shù)或步驟， 而非排除任何其它要素、整數(shù)或步驟、或成組要素、整數(shù)或步驟。
[0081] 如本文所用，術語"識別患有瘧原蟲感染的受試者"還指診斷該感染。例如，該方法 可用于辨別瘧疾發(fā)熱與非瘧疾發(fā)熱，因為瘧疾的癥狀可能類似于許多不同傳染性疾病或其 它病的那些癥狀，所述疾病或病包括病毒性疾病，諸如感冒或流感、蜱叮咬所致疾病(立克 次氏體）、胃部感染(腸胃炎）、肝臟的炎癥(肝炎）、細菌導致的嚴重發(fā)熱(傷寒）、腦或脊髓的 細菌感染或炎癥(細菌性腦膜炎）、寄生蟲導致的其它感染。
[0082] 如本文所用，術語"監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者"是指經(jīng)過一段時間，諸如數(shù)小 時、數(shù)日、數(shù)周或數(shù)月，觀察該感染。如本文概述，在施用化合物以圖治療該疾病之后，可監(jiān) 測受試者。
[0083] 如本文所用，術語"指示該狀態(tài)"是指受試者的疾病負擔水平。這尤其與受試者是 否經(jīng)歷針對瘧原蟲感染的治療，或何時決定對感染的合適治療有關。如本文所述，V0C水平 的初始增加表明治療正在起作用，而水平到達健康受試者中所見的類似水平則表明該治療 已有效，或者可能治愈所有瘧原蟲屬。此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，除初始治療之后的短期波動 以外，所定義V0C(尤其烯丙基甲基硫化物）的水平指示受試者中瘧原蟲的總數(shù)。因此，術語 "指示該狀態(tài)"還指受試者中瘧原蟲(寄生蟲)的總數(shù)。
[0084] 術語"揮發(fā)性有機化合物"，也可縮寫為"V0C"，是指在普通室溫條件下具有高蒸氣 壓的有機化學品。因此，應理解單個"揮發(fā)性有機化合物"可以縮寫成V0CJ0C的高蒸氣壓由 低沸點引起，其導致大量分子從化合物的液體形式或固體形式蒸發(fā)或升華成氣態(tài)。
[0085]如本領域中理解的，與1-甲硫基-1-丙烯有關的"E"和"Z"的使用是用于描述1-甲 硫基-1-丙烯中雙鍵的幾何異構、或立體化學的注釋。
[0086] 如本領域中理解的，使用術語"硫(su 1 f ur) "和"硫化物（su 1 f i de) "時可能也分別 是指"硫(sulphur)" 和"硫化物(sulphide)"。
[0087]如本文所用，術語"步驟i)之后，一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的初始增 加，和/或一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的降低，指示該化合物可用于治療瘧原蟲感 染"意指取決于受試者或樣本在用候選化合物治療之后何時被分析，如果化合物具有抗瘧 疾效應，則可以觀察到一種或多種V0C的較高或較低水平（與施用該化合物之前的水平相 比）。如本文所述，一般在施用有效治療(尤其是快速作用藥物)之后不久觀察到初始增加， 然后降低至與施用該化合物之前相比更低的量。如果監(jiān)測該受試者，則可觀察到有規(guī)律地 增加，隨后減少（降低）。然而，有可能（例如）在單個時間點（例如從施用化合物起30日）監(jiān) 測，以確定治療是否已具有任何效果。
[0088]如本文所用，術語"一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平缺乏顯著改變"意指一種 或多種揮發(fā)性有機化合物的水平未變化至足夠程度來表明治療已有效，或者即便觀察到初 始增加，但一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平恢復至與治療之前幾乎相同。例如，顯著改 變的缺乏可能是（例如）當與治療之前相比時，在治療之后，所述水平少于+/-20%，或少于 +/ _10 % 〇
[0089] 如本文所用，術語"治療（treating/treat/treatment)"包括施用治療有效量的化 合物來試圖減小受試者中瘧原蟲感染(諸如瘧疾)的嚴重度或者消除至少一種癥狀，諸如例 如，衰竭、意識損害、呼吸窘迫(酸中毒呼吸）、胃腸疾病（惡心、嘔吐、腹瀉）、多重驚厥、循環(huán) 性虛脫、肺水腫(放射性）、異常出血、黃疸、神經(jīng)病學疾病(眩暈、紊亂、定向力障礙、昏迷）、 頭痛、背痛、肌痛、寒戰(zhàn)、咳嗽和/或血紅素尿。此類術語還涵蓋寄生負載的降低和/或抑制復 制和/或寄生蟲在被治療受試者中傳播的減少。
[0090]題
[0091]該樣本可能是得自已知或被確定具有一種或多種揮發(fā)性有機化合物的受試者的 任何材料。
[0092]在一個實施方案中，樣品是氣態(tài)?；蛘撸摌颖究梢允菑闹T如來自身體來源的固體 或液體樣本(諸如來自身體的組織或流體)收集的揮發(fā)性有機化合物。該樣本可包括來自受 試者的體液或固體物質(zhì)。來自受試者的合適樣本的實例包括但不必限于:呼出氣、呼吸冷凝 物、唾液、血液、汗水、皮膚微生物、皮膚揮發(fā)性樣本和尿。在一個實施方案中，樣本是呼出 氣。在另一實施方案中，樣本是其中已排除了肺泡氣的呼出氣。
[0093]樣本收集的一個示范性實施方案示于圖1中，其中從疑似瘧原蟲感染的受試者中 收集呼出氣。使用如圖2所示電動栗可將呼出氣揮發(fā)物從呼吸袋轉(zhuǎn)移至吸附管，或可以直接 使用呼吸袋。
[0094] 在某些實施方案中，在氣相中檢測到一種或多種揮發(fā)性有機化合物。樣本本身可 能是氣相，例如是來自個體的呼出氣，或該氣體可以與固體或液體樣本混合或產(chǎn)生自固體 或液體樣本，所述樣本諸如是在培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中生長的樣本。
[0095] 在其它實施方案中，可在樣本的液相或固相中檢測到一種或多種揮發(fā)性有機化合 物。
[0096] 在一個實施方案中，可以直接從受試者中檢測到一種或多種V0C，例如，疑似具有 或已知具有瘧原蟲感染的人的呼出氣可以被直接地呼出至檢測或診斷設備中。
[0097] 在另一實施方案中，可將樣本(諸如皮膚拭子或尿樣本)放置于容器中，并且使用 在容器內(nèi)（諸如在容器的蓋子的內(nèi)側(cè)上)的合適傳感器來檢測V0C。
[0098] 該樣本立即針對揮發(fā)性有機化合物進行分析，或存儲在適宜條件下以便稍后分 析。
[0099]可在檢測一種或多種V0C之前，將樣本預先濃縮。預先濃縮步驟包括技術人員已知 的各種不同程序，諸如對吸附管、固相微萃取(SPME)、或低溫濃縮的使用。
[0100] 吸附管通常由玻璃構成并且含有各種類型的固體吸附劑材料(吸附劑）。通常使用 的吸附劑包括活性炭、硅膠和組織多孔聚合物，諸如Tenax和Amberlite XAD樹脂。吸附管可 以附接至電動栗。用流速ml/min校準的栗通過該吸附管抽取預定體積的氣態(tài)樣本。在該轉(zhuǎn) 移或取樣周期期間，V0C被捕集在吸附劑材料上。
[0101] 使用SPME技術來收集低濃度的V0C以用于分析。SPME是在實驗室中和現(xiàn)場使用的 樣本制備技術。SPME涉及使用涂布有提取相的纖維，所述提取相可以是液體(聚合物)或固 體(吸附劑），其從不同種類的培養(yǎng)基中提取不同種類的分析物(包括揮發(fā)物和非揮發(fā)物）， 并且可以是液相、固相或氣相。由該纖維提取的分析物的數(shù)量與其在樣本中的濃度成比例， 只要在對流或攪動幫助下達到平衡，或假設短時預平衡。提取之后，將SPME纖維轉(zhuǎn)移至單獨 儀器(諸如氣相色譜儀)的注射口，其中發(fā)生對分析物的解吸并且進行分析。SPME的吸引力 在于，該提取是快速且簡單的，并且可通常在無溶劑情況下完成，并且檢測限對某些化合物 可達到兆分率(ppt)水平。SPME還具有現(xiàn)場應用的巨大潛力;現(xiàn)場取樣甚至可由非科學工作 者完成，而無需在各個位置具有氣相色譜-質(zhì)譜分析法設備。
[0102]低溫濃縮是一種允許回收V0C以便再使用的工藝。冷凝過程需要極低溫度，以便 V0C可被濃縮。當前，在低溫(少于-160°C冷凝過程中使用液氮。
[0103] 揮發(fā)性有機化合物和瘧原蟲感染
[0104] 如技術人員將理解，生物系統(tǒng)隨許多因素而高度變化，諸如年齡、性別、遺傳因素、 一般健康、感染水平、感染階段、感染歷史等等，所有都潛在地影響生物標記在個體中的水 平。類似地，瘧原蟲的屬種還可能相關，因為已知的是，間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲在其血液 階段循環(huán)中比惡性瘧原蟲更慢，所以間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲可能花費不同時間來釋放揮 發(fā)性有機化合物。
[0105] 此外，瘧疾感染直至癥狀顯現(xiàn)的時間(潛伏期)一般在以下范圍：
[0106] ?惡性瘧原蟲，9至14天，
[0107] ?間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲，12至18天，
[0108] ?三日瘧原蟲，18至40天，和
[0109] ?諾氏瘧原蟲，11至12天。
[0110] 此外，傳統(tǒng)上與瘧疾相關的發(fā)作或周期性發(fā)熱發(fā)生在紅細胞破裂之前不久或紅細 胞破裂時。感染三日瘧原蟲導致每72小時發(fā)作(三日瘧）。感染卵形瘧原蟲或間日瘧原蟲導 致每48小時發(fā)作的間日瘧。惡性瘧原蟲往往產(chǎn)生無規(guī)律發(fā)熱高峰，疊加有每48小時發(fā)作的 稽留熱或間日瘧。因此，取決于感染的階段，V0C的水平可能變化。具體而言，如果有可能該 受試者只是最近感染，則可能必需例如在9至40天時間內(nèi)重復該方法，以雙重核查陰性結(jié) 果。
[0111] 本發(fā)明人已示出了瘧原蟲感染與揮發(fā)性有機化合物烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基 丙烷、(E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯水平之間的明確相關性。
[0112] 本發(fā)明人已示出，烯丙基甲基硫化物的水平與對瘧原蟲感染的存在的檢測具有最 強相關性。
[0113] 本發(fā)明的方法可以各種方式執(zhí)行。例如，可使用定義水平來作為瘧原蟲感染的指 標，諸如烯丙基甲基硫化物在呼出氣樣本中大于15兆分率(ppt)。在另一實施方案中，可將 V0C在試驗受試者中的水平與來自已知不具有瘧原蟲感染的對照受試者的相同類型樣本中 的水平相比較，并且來自指示瘧原蟲感染的試驗受試者的樣本中的水平更高（例如至少兩 倍的更高水平）。在實施方案中，來自一個或多個對照樣品的數(shù)據(jù)可以存儲為參考收集數(shù) 據(jù)。
[0114] 本發(fā)明人還已示出，在針對瘧原蟲感染治療該受試者之后，在恢復至無瘧原蟲感 染的受試者的水平，或接近該水平之前，這些V0C的水平通常增加。不僅因為如上所述因素， 而且因為所述治療，初始增加的時間將在一定程度上變化。例如，緩慢作用治療可能意指與 使用更快作用治療的情況相比，"初始"增加發(fā)生在治療之后更晚時。如技術人員將理解，對 患者的有規(guī)律監(jiān)測將確保檢測到"初始增加"。在實施方案中，初始增加發(fā)生在施用所述治 療之后約0.5小時與約7天之間，或約0.5小時與約5天之間，或約0.5小時與約3天之間，或約 0.5小時與約24小時之間，或約0.5小時與約12小時之間，或約0.5小時與約8小時之間。
[0115] 此外，本發(fā)明人已示出，（Z)-1-甲硫基-1-丙烯的水平與施用化合物來治療該感染 之后的初始增加具有最強相關性。因此，在與本文所述瘧原蟲感染相關的V0C中，（Z)-1-甲 硫基-1-丙稀是治療效力（即，殺死寄生蟲的治療能力）的最佳標識物。
[0116] 在實施方案中，當使用快速作用治療時，觀察到初始增加?？焖僮饔每汞懠菜幬锏?實例包括氯喹、奎寧、甲氟喹、阿托瓦醌(atovaquone)和青蒿素，而緩慢作用抗瘧疾藥物的 實例包括氯胍、乙胺嘧啶、硫酰胺和四環(huán)素。可使用Le Manach等人(2013)描述的方法(諸如 少于1.5的IC50速度測定)來識別快速作用藥物。
[0117] 另外，本發(fā)明人已示出，（E)-1-甲硫基-1-丙烯的水平與感染的有效治療具有最強 相關性，并由此是用于確定治療之后寄生蟲清除（即，治療結(jié)束之后寄生蟲負載降低或完全 不存在)的動力學的最佳標識物。
[0118] 在另一實施方案，一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平可以指示寄生蟲的生命周 期階段和寄生負載。例如，當前數(shù)據(jù)表明，硫醚水平可能與環(huán)形物、營養(yǎng)體、裂殖體和裂殖子 循環(huán)中的特定時期有關聯(lián)。雖然發(fā)明人取樣方案不具有精確定義該關聯(lián)性的分辨率，但從 極大寄生蟲血癥180°相移以及在藥物治療之后不久發(fā)生的硫醚的峰值表明，紅細胞的脹裂 (裂殖體破裂)而釋放裂殖子并感染新紅血細胞可能是觸發(fā)最大硫醚釋放的事件。
[0119] 基于本文提供的實驗數(shù)據(jù)，技術人員可容易地執(zhí)行常規(guī)試驗以確定V0C的水平，或 一種或多種V0C的組合，所述水平指示瘧原蟲感染。在一個實施方案中，例如在呼出氣樣本 中檢測到大于15兆分率(ppt)的烯丙基甲基硫化物指示瘧原蟲感染。在另一實例中，例如在 呼出氣樣本中至少300ppt烯丙基甲基硫化物的水平指示所述治療正在生效。
[0120]在實施方案中，尤其當監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者或識別化合物以治療瘧原蟲 感染時，該方法可以比較一種或多種V0C的倍數(shù)改變。例如，當識別化合物來治療瘧原蟲感 染時，可以確定和比較V0C在以下中的一個或多個之間的倍數(shù)改變:i)感染之前的受試者或 來自其的樣本;ii)感染之后且藥物施用之前的受試者或來自其的樣本;iii)在施用候選化 合物之后的各種階段(時間）。
[0121] 因為一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平可用于指示瘧原蟲感染的狀態(tài)，這允許 確定用于選擇對感染的合適治療的水平。如技術人員將明白的，
[0122] 1)當寄生蟲血癥為〈1 %時，可以口服方式治療輕癥瘧疾，
[0123] 2 )當認為皰疾很嚴重時，通常給予靜脈內(nèi)治療（www .cdc.gov/malaria/ diagnosis_treatment/clinicians3 .html)。重癥癥疾的WHO標準為>10，000個寄生蟲/yl 〇 一旦寄生蟲密度為〈1%時，患者可以采取口服法，以及
[0124] 3)當寄生蟲血癥為10%時，考慮換血療法(Hanscheild，1999)。
[0125] 在用于實施例中描述研究的誘發(fā)血液階段瘧疾（IBSM)規(guī)程中，出于倫理原因，允 許的極大寄生蟲血癥水平為僅0.001 %。因此，尚未確定用于選擇合適治療的V0C的精確水 平和寄生蟲負載。雖然如此，發(fā)明人已示出V0C的水平與寄生蟲負載之間的明確相關性，且 由此，可以容易地使用很簡單且常規(guī)的程序，按照本公開，確定出允許準確確定哪個V0C水 平是與小于〈1 %寄生蟲血癥（由此選擇口服治療)相關、與1 %至少于10%寄生蟲血癥（由此 選擇靜脈內(nèi)治療)相關以及與10%或更大寄生蟲血癥（由此選擇輸血)相關的合適數(shù)據(jù)。對 稀丙基甲基硫化物的估計可能是約300ppt的值將對應于約0.001 %寄生蟲血癥，由此，在這 種情況下將推薦口服干預。
[0126] 獅
[0127] 或類似可通過本領域已知的任何技術來檢測/監(jiān)測一種或多種揮發(fā)性有機化合 物。實例包括但不限于諸如以下的光譜學中的一種或多種:質(zhì)譜學(MS)(諸如氣相色譜質(zhì)譜 學(GCMS)、液相色譜質(zhì)譜學(LCMS)和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應質(zhì)譜學(PTR-MS))，離子迀移光譜學，場 非對稱離子迀移光譜學，差分迀移光譜學(DMS);電子鼻裝置;生物傳感器;基于抗體的檢測 系統(tǒng)；比色測定；紅外光譜學（IR光譜學）（諸如近紅外（NIR)、選擇離子流動管質(zhì)譜學 (SIFT)、傅里葉變換-紅外線(FTIR)光譜學和衰蕩腔光譜學）；燃料電池電極;光吸收光譜 學;納米粒技術;柔性平板波(FPW)傳感器;電化學傳感器;光聲設備;基于激光的設備;各種 電離技術和馴養(yǎng)動物檢測或其組合。在一個實例中，或類似使用氣相色譜質(zhì)譜學(GCMS)、電 子鼻裝置或生物傳感器來檢測/監(jiān)測一種或多種揮發(fā)性有機化合物。
[0128] 質(zhì)譜學通過使分子電離來工作，以產(chǎn)生帶電分子或分子片段，并且測量它們的質(zhì) 荷比。檢測技術的質(zhì)譜學組件包括四極桿、飛行時間、串聯(lián)質(zhì)譜學、離子回旋共振、和/或扇 形(磁性和/或靜電性）。
[0129] 可以與色譜分離技術串聯(lián)來使用質(zhì)譜學。例如，GCMS是一種將氣相色譜和質(zhì)譜學 的特征組合來識別化合物的分析法。類似地，液相色譜質(zhì)譜學(LCMS)是一種將液相色譜和 質(zhì)譜學的特征組合來識別化合物的分析法。這些技術的色譜分離組件依靠混合物中不同分 子的化學性質(zhì)的差異，并且當樣本行進通過柱體時，允許分子分離。各分子具有特征性停留 時間，其中所述分子在設定條件下穿過柱體。這允許所述技術的質(zhì)譜儀組件分別地俘獲、電 離、加速、偏斜并且檢測電離化分子、或分子片段。
[0130] 質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應質(zhì)譜學(PTR-MS)是用于在線監(jiān)測揮發(fā)性有機化合物(V0C)的極靈敏 技術。PTR-MS儀器由離子源組成，所述離子源直接連接至漂移管和質(zhì)譜儀。
[0131] 離子迀移光譜學（IMS)是一種分析技術，其用于基于電離化分子在載體緩沖氣體 中的迀移來分離和識別氣相中的電離化分子。該技術可以與質(zhì)譜學和/或色譜分離技術聯(lián) 合。例如，離子迀移光譜學-質(zhì)譜學(MS-MS)是這樣的技術，其中離子在被引入質(zhì)譜儀之前， 在施加電勢梯度下穿過某中性氣體，根據(jù)漂移時間而首先分離。漂移時間是相對于離子的 電荷來對半徑的度量。頂S的工作循環(huán)比大多數(shù)質(zhì)譜技術更久，從而使得質(zhì)譜儀可以沿IMS 分離的過程取樣。這以類似于LC/MS的方式產(chǎn)生關于IMS分離和離子質(zhì)荷比的數(shù)據(jù)。頂S的工 作循環(huán)相對于液相色譜或氣相色譜分離而言很短，并且可因此聯(lián)合此類技術，產(chǎn)生三重模 式，諸如 LC/1MS/MS。
[0132] 差分迀移光譜學離子是通過高和低電場下迀移之間的差異來區(qū)分，因為事實上離 子迀移值取決于施加的場強度。該方法易于使用，靈敏，快速，并且相對有選擇性。
[0133] FTIR是用于獲得固體、液體或氣體的吸收、發(fā)射、光電導性或拉曼散射的紅外光譜 的技術。任何吸收光譜法的目標是測量樣本在多大程度上吸收各波長下的光。這樣做的一 種方法是在樣本上照耀單色光束，測量多少光被吸收，并且針對各個不同波長進行重復。傅 里葉轉(zhuǎn)換譜是獲得相同信息的不那么直觀的方式。不在樣本上照耀單色束的光，這種技術 同時照耀含有許多頻率的光的光束，并且測量所述光束中多少被樣本吸收。接下來，改變該 光束以含有頻率的不同組合，從而提供第二數(shù)據(jù)點。將該過程重復多次。然后，電腦取得所 有這些數(shù)據(jù)，并且逆操作以推斷各波長下吸收的是什么。
[0134] 選擇的離子流動管質(zhì)譜學（SIFT-MS)是用于痕量氣體分析的定量質(zhì)譜學技術，其 涉及在定義明確的時間周期期間，沿著流動管，通過所選正前體離子來對痕量揮發(fā)性化合 物的化學電離。
[0135] 衰蕩腔光譜學是紅外光譜學的另一變型，其對痕量水平的氣體特別地靈敏，并且 可能尤其適合于使用請求保護的化合物來在呼吸中診斷瘧疾。
[0136] 電子鼻(還稱為電子鼻(E-nose))是檢測氣味的裝置。該技術可能還稱為"電子感 測"或"e_感測"。電子鼻包括3種主要部件:樣本輸送系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、計算系統(tǒng)。樣本輸送系 統(tǒng)允許生成樣本的頂部空間（揮發(fā)性化合物），其為被分析級分。該系統(tǒng)隨后將該頂部空間 注入電子鼻的檢測系統(tǒng)中。由傳感器裝置組成的檢測系統(tǒng)是所述儀器的"反應性"部件。當 與揮發(fā)性化合物接觸時，傳感器反應，其意指它們經(jīng)歷電氣性質(zhì)的改變。在大多數(shù)電子鼻 中，各傳感器對所有揮發(fā)性分子靈敏，但各傳感器以其特定方式工作。然而，在生物電子鼻 中，使用對特定氣味分子作出響應的蛋白質(zhì)。大多數(shù)電子鼻使用傳感器陣列，其在接觸時與 揮發(fā)性有機化合物反應，和/或揮發(fā)性有機化合物在傳感器表面上的吸附導致傳感器的物 理變化。通過使信號變換成為數(shù)值的電子接口來記錄特定響應。記錄資料隨后基于統(tǒng)計學 模式來計算。
[0137] 用于電子鼻的傳感器包括金屬氧化物半導體(M0SFET)、金屬氧化物傳感器(M0X)、 導電聚合物、聚合物復合物、石英晶體微量天平、表面聲波(SAW)。
[0138] 在金屬氧化物半導體(M0SFET)裝置中，將晶體管用于擴大或切換電子信號。此舉 工作的原理在于，進入傳感器區(qū)域的分子主動或被動帶電，產(chǎn)生M0SFET信號的改變，該改變 隨后通過模式識別計算機系統(tǒng)來解讀。因此，各個可檢測分子具有其自己的獨特信號。
[0139] 金屬氧化物半導體(M0X)傳感器使用沉積在Si-微電機基板(微傳感器)上的基于 金屬氧化物的感測厚膜。該基板含有：電極，其測量感測層的電阻;和加熱器，其將感測層加 熱到200°C至400°C。傳感器用感測層電阻的改變來對環(huán)境大氣的組成物的改變作出響應。
[0140] 導電聚合物是導電的有機聚合物。聚合物復合物在使用上類似于導電聚合物，但 由不導電聚合物添加諸如炭黑的導電材料來配制。
[0141]石英晶體微量天平是通過測量石英晶體諧振器的頻率的改變來測量單位面積質(zhì) 量的一種方式。單位面積質(zhì)量可存儲在數(shù)據(jù)庫中并且用于將來參考。
[0142] 表面聲波(SAW)是一類微型機電系統(tǒng)(MEMS )，其依靠對表面聲波的調(diào)制來感測物 理現(xiàn)象。
[0143] 納米粒傳感器具有獨特的物理、化學和生物學性質(zhì)以及功能活性。納米粒大小與 形狀與表面面積和量子效應有關。降低納米粒的大小導致事實上與內(nèi)部含量相比，顯著更 大比例的原子(納米粒的組分)是在表面上。
[0144] 生物傳感器具有含物理化學檢測器的生物學組件。因此，含生物學組件的電子鼻 是一種生物傳感器。生物傳感器通常由生物識別組件、生物轉(zhuǎn)導器組件和電子系統(tǒng)組成，所 述電子系統(tǒng)包括信號放大器、處理器和顯示器。
[0145] 生物學組件可以是例如細胞或蛋白質(zhì)。合適蛋白質(zhì)的實例包括但不限于:抗體或 其片段，其結(jié)合本文定義的V0C;或受體，諸如G偶聯(lián)蛋白受體（GPCR)(例如嗅覺或味覺 GPCR)，其結(jié)合本文定義的V0C。在實施方案中，蛋白質(zhì)用可檢測標簽標記。例如，G偶聯(lián)蛋白 受體可用RET對標記，從而使得當V0C結(jié)合GPCR時，RET供體分子(諸如生物發(fā)光蛋白）相對于 RET受體分子的空間位置和/或偶極取向被改變（參見，例如，WO 2004/057333和WO 2010/ 085844)。在替代性實施方案中，該蛋白質(zhì)為抗體或其片段，并且通過使用如本領域已知的 標記的二級藥劑(例如二級抗體)來檢測該抗體或其片段的結(jié)合。
[0146] 可能適合于在本發(fā)明方法中使用的生物傳感器的實例描述在W0 2013/155553中。
[0147] 如技術人員將了解，結(jié)合本文定義的V0C的抗體或其片段還可以用于各式各樣的 不同標準檢測系統(tǒng)中，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫組織化學著色。
[0148] 在實施方案中，使用諸如W0 2013/155553中所述的微流體來執(zhí)行方法。
[0149] 在實施方案中，生物傳感器可能涉及如澳大利亞臨時專利申請2014904612中所述 的螯合金屬離子。
[0150] 在某些實施方案中，使用即時(point-of-care)診斷設備來識別一種或多種V0C。 優(yōu)選地，即時診斷工具為便攜式，并且可以在探測的下限程度上檢測V0C。
[0151] 抗瘧原蟲化合物
[0152] 抗瘧原蟲化合物也可稱為抗瘧疾化合物或抗瘧疾藥。
[0153] 抗瘧原蟲化合物是用于治療和/或預防瘧原蟲感染的化合物。術語"抗瘧原蟲化合 物"還可指用于治療和/或預防瘧原蟲感染的化合物的組合(即，組合療法）。
[0154] 抗瘧原蟲化合物的實例包括但不限于：蒿甲醚-苯芴醇、蒿甲醚、阿莫地喹、青蒿 素、青蒿酯、克林霉素、氯喹、強力霉素、二氫青蒿素、甲氟喹、naphroquine、氯胍、哌喹、伯氨 喹啉、咯萘啶、奎寧、磺胺多辛-乙胺嘧啶、四環(huán)素、0Z439、及其組合。如本文所述，患有瘧原 蟲感染的受試者可用諸如上述那些的抗瘧原蟲藥施用，并且使用本發(fā)明的方法監(jiān)測以確定 治療成功。
[0155] 治療未成功，例如，通過在治療之前和之后一種或多種或所有V0C的水平相似(例 如+/-20%或+/-10%)來確定的，可能指示受試者受治療抗性的瘧原蟲菌株感染(并由此， 應該施加替代性治療），或所用治療的活性組分已被折損（超過有效期限和/或未恰當存 儲），或不存在足夠濃度或完全缺乏(抗皰疾藥物偽造是嚴重的問題一參見Karunamoorthi， 2014)。
[0156] 如本文所述，V0C的水平可用于決定用于被感染受試者的大多數(shù)恰當治療。
[0157] 在篩選新抗瘧疾化合物的背景下，所謂"候選化合物"意指用于治療或預防瘧原蟲 感染(諸如治療瘧疾）的待評估藥劑。候選化合物(可能也稱為藥物候選物)包括正經(jīng)歷藥物 發(fā)現(xiàn)過程的化合物。候選化合物可以包括(例如)小分子、肽或其模擬物、多肽、抗體、核酸分 子諸如適配體、肽核酸分子及其組分、組合和衍生物。
[0158] 候選化合物可在人類和非人類中進行評價。非人類(諸如小鼠或大鼠）可以是轉(zhuǎn)基 因的。
[0159] McCarthy等人（2011)描述了一種用于評價治療惡性皰原蟲感染的新藥候選物的 效力的研究。該研究證明了 19位試驗志愿者的安全性，以及在13位可評估志愿者中所述藥 物之間寄生蟲血癥的清除動力學的顯著差異，其中蒿甲醚-苯芴醇(A/L)的平均寄生蟲降低 比率為759,并且阿托瓦醌-氯胍(A/P)為17(分別地，95%CI 120-4786和7-40$，0.01)。本 發(fā)明的方法可與例如McCarthy等人所述那些一起使用來識別新型抗瘧原蟲化合物。
[0160]人源化小鼠已被開發(fā)來用于識別新型抗瘧疾藥化合物(參見，例如，Vaughan等人， 2012)。本發(fā)明的方法可與例如Vaughan等人(2012)所述那些一起使用來識別新型抗皰原蟲 化合物。
[0161] US
[0162] 本發(fā)明可用于篩選用于識別患有瘧原蟲感染的受試者的化合物。此類化合物可以 與本文定義的V0C結(jié)合或反應。因此，在篩選用于識別患有瘧原蟲感染的受試者的化合物的 背景下，所謂"候選化合物"意指用于識別或監(jiān)測瘧原蟲感染的方法中的待評估藥劑。候選 化合物可以包括(例如)小分子、肽或其模擬物、多肽、抗體、核酸分子諸如適配體、肽核酸分 子及其組分和衍生物。在一個實施方案中，候選化合物是固態(tài)傳感器組成物。例如，該固態(tài) 傳感器組成物可以是摻雜和無摻雜的金屬氧化物傳感器。在一個實施方案中，固態(tài)傳感器 組成物是選自二氧化錫(Sn0 2)和三氧化鎢(W03)的金屬氧化物傳感器，其中該氧化物傳感器 任選地摻雜有金屬，所述金屬選自由鈀(Pd)、鉑(Pt)、銀(Ag)、銅(Cu)、或其組合(諸如鉑銀 化合物(PtAg))組成的組。在一個實施方案中，該傳感器組成物是摻雜有銀的二氧化錫(摻 雜有Ag的Sn0 2)。
[0163] 如技術人員將了解的，存在各式各樣的可適合于篩選與本文定義的V0C結(jié)合或反 應的化合物的不同篩選程序。實例包括但不限于:受體蛋白（諸如GPCR)文庫篩選、表面等離 子體共振、高分辨率NMR、噬菌體顯示、親和色譜法、等溫滴定量熱學（ITC)、免疫沉淀法和與 質(zhì)譜學聯(lián)合的GST沉降技術(GST pull downs)。
[0164]在一個實施方案中，使用高通量篩選法，其涉及提供含有大量候選化合物的文庫。 此類文庫隨后在一種或多種測定中被篩選，以識別顯示所需的特征性結(jié)合或活性的那些文 庫成員（具體的化學物種或子類）。
[0165] 高通量篩選系統(tǒng)是市售可用的，并且通常使全部程序自動化，包括所有樣本和試 劑移液、液體分配、定時孵育、適合于該測定的檢測器中的微板的最終讀數(shù)。這些可配置系 統(tǒng)提供高通量并且迅速啟動以及高度的靈活性和定制性。此類系統(tǒng)的制造商提供用于各種 高通量系統(tǒng)的詳細規(guī)程。
[0166] 表面等離子體共振(SPR)或生物分子相互作用分析(BIA;例如，Biacore)實時檢測 生物特異相互作用，而不對任何相互作用物加標記。BIA芯片的結(jié)合表面處的質(zhì)量改變(指 示結(jié)合事件)導致該表面附近的光的折射率變化。折射性的變化產(chǎn)生可檢測信號，其作為生 物分子之間的實時反應的指示來加以測量。
[0167] 在一個實施方案中，該篩選法包括使烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲 硫基-1-丙烯和（z)-i-甲硫基-1-丙烯中的一種或多種與細胞（諸如酵母細胞）中表達的 GPCR的文庫（例如，味覺GPCR或嗅覺GPCR，或其組合，來自線蟲或昆蟲的GPCR)接觸，并且識 別結(jié)合一種V0C的特異性受體。此類酵母細胞將通常包括基因工程化的報告系統(tǒng)以檢測受 體結(jié)合（參見，例如，F(xiàn)ukutani等人，2012;與Dowell和Brown，1999)。 實施例
[0168] 實施例1-材料和方法
[0169] 受控制的人類瘧疾感染
[0170] 該研究經(jīng)醫(yī)療研究人類研究倫理委員會昆士蘭研究所(Queensland Institute of Medical Research Human Research Ethics Committee)(QIMR_HREC)批準，并且由 CSIR0動物、食品和健康科學人類研究倫理委員會（CSIR0 Animal,Food and Health Sciences Human Research Ethics Committee)資助(計劃編號：13/03)。
[0171]該研究是控制性研究，使用血液階段惡性瘧原蟲(BSPC)接種體攻毒來表征兩種抗 瘧疾藥物針對早期惡性瘧原蟲血液階段感染的效力。將呼吸揮發(fā)物的研究"加入"該抗瘧疾 效力研究。使用不同抗瘧疾藥物，在兩個組（1組n = 8,并且2組n = 7)中進行該研究。1組中研 究的抗瘧疾藥物是0Z439,并且2組中所用藥物是哌喹。0Z439,作為青蒿素(artemisin)衍生 物，迅速被吸收，迅速起作用，并且在身體內(nèi)壽命短。哌喹被緩慢吸收并且在身體內(nèi)具有長 半衰期哌喹從60年代到80年代被廣泛用作抗瘧疾藥，但已發(fā)展出耐藥性并且不再受歡迎。 然而，其現(xiàn)在作為與青蒿素的組合療法來試驗，以平衡其短期活性。
[0172] 組中各參加者在第0天被接種約1，800個有活力的惡性瘧原蟲-靜脈內(nèi)施用來感染 人類紅細胞?；陂T診患者，從第3天，每日（AM)或早上(AM)和傍晚（PM)監(jiān)測參加者，直至 PCR針對瘧疾寄生蟲的存在，針對不良事件和瘧疾的癥狀、跡象或寄生蟲學證據(jù)的意外早期 發(fā)作為陽性。
[0173] 如通過qPCR結(jié)果確定，在指定開始治療的當天(通常第7/8天AM)，容許參加者進入 研究單位并限制行動以便安全監(jiān)測和抗瘧疾藥物施用，并且監(jiān)測寄生蟲負載和藥物水平。 治療開始的閾值是當PCR定量被證實為2 1，000個寄生蟲/mL。如果存在瘧疾的臨床特征或 寄生蟲學證據(jù)，或在第7天(AM)上午之前檢測到2 1，000個寄生蟲/mL的PCR定量，指定的治 療在這時候開始(表1和2)。
[0174] 在用抗皰疾藥治療之后，參加者作為住院患者被追蹤至少48小時，以確保治療和 臨床響應的容許偏差，隨后，如果基于門診患者，經(jīng)由PCR，針對安全性和瘧疾寄生蟲的連續(xù) 存在臨床上良好。在第24/25天開始用Riamet? (活性成分為蒿甲醚和苯芴醇)強制開始治 療。如果在抗瘧疾治療之后觀察到弱響應或快速響應，可進行早期干預。完成此舉以確?；?者安全。表3歸納1組和2組的瘧疾研究的事件。
[0175] 表1:針對用抗瘧疾藥物0Z439治療的1組，呼吸收集的日期（如勾號指示）。呼吸收 集是在基準日（第0天AM)，在瘧疾感染之后和在施用抗瘧疾藥之前(第0天PM-第7天AM)，在 施用抗瘧疾藥物之后(第7天PM-第9天PM)和在恢復期(第28天AM)。
[0177]表2:針對用抗瘧疾藥物哌喹治療的2組，呼吸收集的日期(如勾號指示）。呼吸收集 是在基準日（第0天AM)，在瘧疾感染之后和在施用抗瘧疾藥之前(第0天PM-第8天AM)，在施 用抗瘧疾藥物之后(第8天PM-第10天PM)和在恢復期(第29天AM)。
[0180] 呼出氣收集
[0181] 要求志愿者正常呼吸，并且在幾秒鐘后志愿者被要求使用"ha"呼氣呼出少量，暫 停，然后連續(xù)呼出，只要他們可以舒適地執(zhí)行。為了呼吸收集，要求志愿者重復所述"ha"并 且在暫停期間在嘴唇間放入硬紙板。要求志愿者通過呼出來完成向袋內(nèi)呼氣，只要他們可 以舒適地進行。一旦他們結(jié)束呼出，則他們關閉閥門（d)(圖1)。未使用鼻夾，也未使用V0C過 濾器。
[0182] 表3:1組和2組中瘧疾研究的事件歸納。
[0184] 通過溶劑管吸附
[0185] 使用含有200mg TenaxTA和200mg Sulficarb(Markes International Limited， UK)的雙層吸附管。將管暴露于1L呼吸樣本。用于將呼吸揮發(fā)物轉(zhuǎn)移到該管的方法是通過使 用在5分鐘內(nèi)將呼吸樣本從袋中抽取并且穿過該管的電動栗來進行（圖2)。將管存儲在冷藏 箱中4°C下，直至進一步分析。將含有小體積呼吸氣的袋子保持在低溫室中，并且?guī)П幕?Canberra,Aus tra1i a 〇
[0186] 環(huán)境空氣樣本
[0187] 收集環(huán)境空氣的方法如下:針對2組，空袋（用于呼吸收集的相同類型的袋)經(jīng)由其 一個閥門連接至吸附管，然后將吸附管連接至電動栗。將袋的兩個閥門打開，以允許環(huán)境空 氣被栗抽取來穿過該袋和吸附管。栗的流速為200ml/min，并且環(huán)境空氣收集5分鐘。發(fā)明人 使用袋來收集環(huán)境空氣以提供用于呼吸樣本的"背景"條件。
[0188] 針對1組，發(fā)明人使用與上文相似的方法來收集環(huán)境空氣，但無袋，替代地，栗直接 連接至吸附管。
[0189] 通過氣相色譜-質(zhì)譜分析法進行呼出氣分析
[0190]呼吸樣本的GC-MS分析使用吸附管，在280°C下經(jīng)過熱處理來解除吸附10分鐘 (Unity2，Markes International，UK)，并且轉(zhuǎn)移至冷講（用Tenax TA和Unicarb填充），保持 在30°C并且隨后加熱到300°C以使譜帶增寬最小化。施加冷阱之后的分流比為6:1。氣相色 譜儀（Bruker 451Model GC，Bruker Daltonik Inc.，USA)，其使用GC毛細管柱ZB-5MS (Phenomenex Australia Pty Ltd.)，使用長度 30m，內(nèi)徑 0.25mm 和薄膜厚度 0.25_ 以及以 下溫度程序:初始溫度35°C，5分鐘，并且保持5分鐘，以5°C/分鐘升高至250°C。最終溫度為 250°C保持2分鐘。該分析的總運行時間為50分鐘。氦載氣的流速為0.8ml/min。
[0191] 單個四極桿質(zhì)譜檢測器(Scion SQ，Bruker Daltonik Inc.，USA)設置有全掃描檢 測(掃描時間=250ms )，在正極性下覆蓋從35至350m/z的離子質(zhì)量范圍。
[0192]在針對2組的樣本的GCMS分析期間，離子源被污染并且儀器靈敏度降低。因此，組 間的絕對定量比較被認為是無效的，并且針對各組分別地進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明檢測到 揮發(fā)性有機化合物的相同一般模式。 _3] 通過電子鼻進行呼出氣分析
[0194] 僅針對1組:通過電子鼻的直接呼吸分析是通過直接從袋中取樣喘出氣來進行分 析(圖4)。針對各樣本，在40ml mirT1的流速下分析200ml的呼吸。
[0195] DiagNose(C_it，The如1:1161'1311(18)電子鼻由7個11型氧化物傳感器(摻雜和無摻雜 Sn02和W03)組成;一種傳感器類型是一式三份存在，三種傳感器類型是一式兩份，并且其它 三種類型為單個傳感器，得到總計12個傳感器的陣列（表4)。連續(xù)地調(diào)整傳感器陣列溫度。 以20秒的周期產(chǎn)生溫度波形，并且在所述周期期間收集32個數(shù)據(jù)點。總分析時間是5分鐘。 虛擬傳感器的總數(shù)為一個循環(huán)內(nèi)傳感器數(shù)目X時間步長X熱回路的組合，8卩，12 X 15 X 32 等于5760個虛擬傳感器。各時間步長代表20秒的分析。流速為400ml mirT1的儀器空氣被用 作載氣。各呼吸分析之后，該裝置用儀器空氣凈化大約35分鐘以允許基準恢復。 _6] 用瘧疾生物標記加標的呼吸
[0197] 純呼吸用不同濃度的烯丙基甲基硫化物加標。純呼吸如上所述那樣收集。在該情 況下，單個樣本代表三種呼吸呼氣(總計大約6L的呼吸）。
[0198] 表4:DiagNose中的傳感器類型。
[0200] 注意：除GC-MS分析以外，并非所有袋均含有足夠呼吸來執(zhí)行電子鼻分析。樣本大 小在n = 3至7之間。
[0201] 發(fā)明人稱之為患者模擬器的裝備示于圖5中。含有2L健康呼吸的袋（1)被連接至微 量栗（2)(SP 100EC，Schwarzer Precision)。微量栗的出口附接至兩頸圓底長頸燒瓶(3)的 側(cè)頸中。該燒瓶的直頸被用作加標點（4)，并且同時，作為將加標/抽吸的呼吸轉(zhuǎn)移至名為 "加標呼吸"的袋(5)的途徑。為確保燒瓶的底部達到至少250°C，將燒瓶放置入具有微粒并 且用熱板加熱器(6) (Haines Educational，Australia)加熱的床中。當達到燒瓶的所需溫 度時，在加標點(4)，用氣密注射器(SGE Analytical Science，Pty Ltd.，Australia)注入3 yl烯丙基甲基硫化物。立即蒸發(fā)化合物。不久之后，流速為180ml/min的栗（2)將純呼吸（1) 和瘧疾生物標記一起轉(zhuǎn)移至"加標呼吸"袋(5)。當初始健康呼吸袋清空時，停止所述栗。"加 標呼吸"袋中的最終烯丙基甲基硫化物濃度為330ppm。通過將300ml的濃縮加標呼吸注入填 充有2L純呼吸的二級袋中以達到43ppm的濃度來制備稀釋物。在新的個別袋中制備其它稀 釋物，以達到10ppm、500ppb和lOppb的三種最終加標濃度水平。使用這種方式來構建校準曲 線，以估計呼吸中揮發(fā)性有機化合物的絕對濃度。
[0202] 總計，為每個濃度(純、10ppb、500ppb、10ppm)制備三個重復。對于每個樣本，將1L 體積的純呼吸或加標呼吸轉(zhuǎn)移至吸附管中以用于GC-MS分析。對于電子鼻分析，直接從袋中 分析樣本。
[0203] 化學品
[0204] 來自Sigma-Aldrich(Belgium)的稀丙基甲基硫化物以及1-甲硫基-丙烷是購自 ABCR GmbH&Co(Karlsruhe，Germany)。（E)-l_甲硫基-1-丙稀和（Z)-l_甲硫基-1-丙稀由 Advanced Molecular Technologies Pty Ltd(Melbourne，Australia)合成。
[0205] 統(tǒng)計分析
[0206] 使用提供于MATLAB本身和MATLAB STATISTICS TOOLBOX中的標準程序，在MATLAB (MathWorks，Natick MA)中執(zhí)行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。使用UscramblerX(版本10? 2，CAM0軟件）來 進行主要組分分析。
[0207] 描述性水平
[0208] 使用箱線圖來評估抗瘧疾藥物治療之前和之后的差異。應用單向AN0VA，并且該函 數(shù)比較所述樣本的平均值，并且針對所有樣本抽取自相同群體的無效假設而得出P值。并且 為進一步評價揮發(fā)物的豐度是否與抗瘧疾治療之前或之后顯著不同，我們使用多重比較試 驗（Bonferroni校正）〇
[0209]多元分析
[0210] 主要組分分析(PCA)被用作降維技術，并且觀察組的不同階段之間是否存在差異。 借助于投射至PCA子空間中，進行數(shù)據(jù)簡化。使確定添加個別揮發(fā)物是否可以一致地鑒別樣 本的進一步多元統(tǒng)計分析經(jīng)受MAN0VA (MATLAB中Statistical Toolbox的工具）。
[0211] 電子鼻中的特征選擇
[0212] 用于確定響應瘧疾生物標記的最佳傳感器的數(shù)據(jù)是在10PPb的上文所述的呼吸加 標數(shù)據(jù)(2類)與Oppb的對照呼吸（1類)之間的響應差異。用于傳感器選擇的方法是Q_(F)值。 所謂特征F，我們意指從得自電子鼻的測量值的高維向量中求出的單個實值測量值。
[0213] 在預測一組樣本的類別時，針對任何特征F的質(zhì)量，具有Q的傳感器定義質(zhì)量指標q (F)：
[0214] 通過所考慮類別的樣本間F的平均值的距離除以每個類別中個別樣本的標準偏差 的乘積之商，計算q。在兩個類別情況下，例如對照物(1類)和感染樣本(2類），這等于：
[0216] 其中]ii(F)表不1類樣本的所有F值的平均值，U2(F)Error!Reference source not found.為2類樣本的平均值，并且cn(F)和〇2(F)為對應標準偏差。該測量的動機在于q(F)很 大，無論何時所考慮類別中F的平均值在各類別之間相異很大時，所述類別內(nèi)F值的散布(標 準偏差)都很小。在該情形下，F(xiàn)是用于區(qū)分所討論類別的良好特征。另一方面，如果不同類 別中F值的平均值(幾乎)相同，或所述類別中每者內(nèi)F的值的散布很大，則q為(接近于)零。 在那種情況下，F(xiàn)并非用于區(qū)分所述類別的良好特征。通常q值在區(qū)間[0，~]內(nèi)，并且值至少 大于1，指示F可以用于分類。
[0217] 對于該研究，q值高于5的傳感器被認為是所述兩個類別的最具信息量的傳感器和 潛在鑒別器。
[0218] 分類
[0219] 兩種常見分類器(支持向量機和k_最近鄰算法)經(jīng)訓練來分類樣本，使用〃留一法〃 交叉驗證結(jié)果(Wang等人，2014):
[0220] (1)支持向量機(SVM) (Cortes和Vapnik，1995)構造出超平面來將訓練數(shù)據(jù)分離入 不同類別中。我們使用C-SVC(成本參數(shù)C的SVM分類)使用libsvm文庫(Lin，2011)來執(zhí)行該 分類。使用兩種類型的SVM:使用高斯徑向基核函數(shù)的線性和非線性SVM。高斯徑向基核函數(shù) 是Error!Reference source not found.，其中Error!Reference source not found?是樣 本i的數(shù)據(jù)的向量，并且y是核寬度。發(fā)明人選擇y，使用特征數(shù)目的倒數(shù)(libsvm中的缺省 Y值），因為先前研究表明這提供最佳的分類性能(Wang等人，2014)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于該數(shù) 據(jù)集，徑向SVM比線性SVM執(zhí)行得更好，因此我們在這里使用徑向SVM且C = 256來報告分類結(jié) 果。
[0221] (2)k_最近鄰(kNN)算法通過計算距離度量來比較輸入數(shù)據(jù)與現(xiàn)有的一組訓練數(shù) 據(jù)(Russell和Norvig，1995)。輸入數(shù)據(jù)的鄰近值為具有最小距離度量的k數(shù)據(jù)點。輸入數(shù)據(jù) 的類別被確定為在鄰域中具有最多數(shù)據(jù)點的輸入數(shù)據(jù)類別。發(fā)明人針對1^={1，3,5,7}測試 鄰域大小。k的最大值設定為7,因為在該數(shù)據(jù)集中每個類別存在至多7個樣本，所以在可出 現(xiàn)于任何測試數(shù)據(jù)的鄰域中的訓練數(shù)據(jù)中，相同類別將有至多7個樣本。發(fā)明人在這里報道 k=l的結(jié)果，因為不同k值之間不存在顯著差異。
[0222] 交叉驗證
[0223] 發(fā)明人用數(shù)據(jù)集執(zhí)行兩種類型的交叉驗證。針對每個個別試驗，發(fā)明人執(zhí)行一對 全部（留一法)交叉驗證。也就是說，針對每個試驗的全部數(shù)據(jù)集被分割成訓練集(N-1個數(shù) 據(jù)樣本)和測試集(剩余1個數(shù)據(jù)樣本)的N個對，其中N為數(shù)據(jù)集的大小。該過程重復N次以覆 蓋集中的所有數(shù)據(jù)。分類器使用訓練集來訓練，并然后應用于測試集。
[0224] 除一對全部交叉驗證以外，發(fā)明人使用來自所述組中一者的數(shù)據(jù)來訓練分類器， 并且對剩余組上的數(shù)據(jù)進行測試。為了該測試，使用分析的每日空白樣本（即，空吸附管的 分析)來歸一化該數(shù)據(jù)，因為GC-MS靈敏度在兩個組之間有所變化。
[0225] 惡性瘧原蟲寄生蟲血癥的PCR定量
[0226] 修改其它地方所述的共有的瘧原蟲屬RT-PCR方法(McCarthy等人，2013)，以利用 TaqMan水解探針化學。該PCR測定被設計成擴增多拷貝的保守的199個-堿基對(bp)靶標以 及高度保守的18S核糖體RNA基因。從500yL濃集紅細胞中定量寄生蟲。在研究期間每個樣本 一式兩份地測試。研究完成之后，所有樣本一式三份再測試。當變異系數(shù)變化>20%時，再測 試樣本。
[0227] 來自細胞培養(yǎng)物的揮發(fā)物收集。
[0228] 使用用于呼吸收集的相同類型吸附管，執(zhí)行頂部空間收集。修改燒瓶口，以便吸附 管可連接。所述管一端連接至管，并且另一末端連接至電動栗（圖3S)，將200ml頂部空間以 200ml mirT1轉(zhuǎn)移至所述管。該系統(tǒng)未氣密封閉，所以在收集頂部空間的同時，存在稀釋效果 (來自環(huán)境的空氣也進入該系統(tǒng)）；進行此舉以允許收集用于GC-MS分析的足夠體積。管在4 °C下存儲，直至分析。在分析的時候還收集環(huán)境空氣樣本以檢測目標化合物是否不來自環(huán) 境。
[0229]實施例2-患有瘧原蟲感染的患者中水平增加的揮發(fā)性有機化合物
[0230] 使用氣相色譜-質(zhì)譜分析法，觀察到存在9種在瘧疾感染之后和抗瘧疾藥物注射之 后有改變的化合物(表5)。
[0231] 4種硫化合物，烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯具有極相似的模式，而表5中列出的其它化合物具有各種模式。雖然所有9種 揮發(fā)物都表現(xiàn)出變化，但分析集中在4種硫衍生的VOC，因為（1)在某些志愿者中，這些化合 物在第〇天時不存在或水平不可檢測，以及(2)所述化合物似乎作為整體移動，表明其生化 路徑中一些可能的連接。
[0232] 三種硫化合物烯丙基甲基硫化物、（E)-1-甲硫基-1-丙烯和(Z)-1-甲硫基-1-丙烯 的色譜以及其在該組過程中的變化被示于圖6和圖7(分別是1組和2組）。
[0233] 實施例3-統(tǒng)計分析
[0234] 組群 1
[0235] 多元分析
[0236] 為了可視化在瘧疾感染和藥物施用之后的變化，對所有個體和所有4種硫醚（圖8a 至8e)執(zhí)行PCA。為了使圖清晰明了，僅在PCA中使用來自第0天（圖8a)、第7天AM(圖8b)、第7 天PM(圖8c)和第28天（圖8d)的樣本?？勺⒁獾剑鲭A段間存在明確區(qū)別，并且V0C提供瘧 疾感染之后呼吸中存在變化的證據(jù)（圖8e)。
[0237] 表5:用于半定量的呼吸中瘧疾生物標記、停留時間和特征性質(zhì)荷比。
[0239] 描述性水平
[0240]使用峰下面積計算各化合物在呼吸收集的不同日的箱線圖（圖9) AN0VA測試表明 化合物在呼吸收集日（瘧疾階段)間的豐度平均值存在顯著差異。具體而言，第7天-PM，即抗 瘧疾藥物之后約6.5小時收集的樣本，示出最高的濃度增加。
[0241] 呼吸組成物中最顯著變化是由（Z)-1-甲硫基-1-丙烯示出（圖9)。針對(Z)-1-甲硫 基-1-丙烯的多重比較測試(圖10)表明，在第7天-PM(即，抗瘧疾藥施用之后6.5小時收集的 樣本)存在顯著更高水平的化合物(無重疊區(qū)間）。
[0242] 多元方差分析(MAN0VA)
[0243] 使用所有4種呼吸瘧疾生物標記(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（Z)-1-甲硫 基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯），使在第0天AM和第7天PM收集的樣本經(jīng)受MAN0VA，隨 后，每次移除一種化合物，并且再執(zhí)行MAN0VA來尋查差異是否仍顯著。結(jié)果表明，即便在僅 兩種化合物的情況下(表6)，差異也很顯著，提供最大差異的化合物為(Z)-1-甲硫基-1-丙 稀。
[0244]表6:用于執(zhí)行MANOVA的化合物(變量）以及該測試對1組的顯著性。用于分析的數(shù) 據(jù)來自第〇天AM和第7天PM。
[0246] 組群 2
[0247] 在2組中，收集了來自7位個體的呼吸樣本，然而，一位個體被從數(shù)據(jù)分析中排除， 因為該個體不能執(zhí)行"ha'呼氣以排除肺泡氣，這影響總色譜圖（樣本的稀釋效果=肺泡氣+ 肺氣）。下文所示數(shù)據(jù)分析因此來自6位個體。
[0248] 多元分析
[0249] 為了使在瘧疾感染和藥物注射之后的變化可視化，針對所有個體和針對所有4種 硫醚(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（Z)-1-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯） (圖11a至9e)執(zhí)行主組分分析(PCA)。為了圖清晰明了，僅在PCA中使用了基準日（第0天） (BL)(圖11a)、瘧疾感染期間（第6天）（If)(圖11b)、抗瘧疾藥施用之后(第8天-PM)(藥物） (圖11c)和恢復期（第29天）（Rec)(圖lid)的樣本?？勺⒁獾剑鲭A段間存在明確區(qū)別，并 且V0C提供瘧疾感染之后呼吸中存在變化的證據(jù)（圖11 e)。
[0250] 描述性水平
[0251] 在呼吸收集的不同日間的各化合物的箱線圖（圖12) jNOVA測試表明化合物在呼 吸收集日（瘧疾階段)間的豐度平均值存在顯著差異。具體而言，第8天-PM，即抗瘧疾藥物之 后約6.5小時收集的樣本，示出最高的濃度增加。
[0252] 呼吸組成物中最顯著變化是由（Z)-1-甲硫基-1-丙烯示出（圖12)。針對(Z)-1-甲 硫基-1-丙烯的多重比較測試（圖13)表明，在第7天PM(即，抗瘧疾藥施用之后6.5小時收集 的樣本)存在顯著更高水平的化合物(無重疊區(qū)間）。
[0253] 多元方差分析(MANOVA)
[0254] 使用所有4種呼吸瘧疾生物標記，使在第0天和第8天PM收集的樣本經(jīng)受MANOVA，隨 后，每次移除一種化合物，并且再執(zhí)行MANOVA來尋查差異是否仍顯著。結(jié)果表明，即便在僅 兩種化合物的情況下(表7)，差異也很顯著，提供最大差異的化合物為(Z)-l_甲硫基-1-丙 稀。
[0255] 在1組和2組兩者中，可在藥物施用6.5小時內(nèi)檢測到藥物的效果。
[0256] 表7:用于執(zhí)行MANOVA的揮發(fā)性有機化合物(變量）以及該測試對2組的顯著性。用 于該分析的數(shù)據(jù)來自第〇天和第8天-pm。
[0258] 實施例4-通過電子鼻(DiagNose)來檢測揮發(fā)性有機化合物
[0259] 本發(fā)明人還示出，電子鼻可用于檢測所述V0C。本發(fā)明人還示出，電子鼻可鑒別含 有較高水平的這些化合物的呼吸與具有較低水平、或零水平的這些化合物的呼吸。與GC-MS 分析相反，樣本直接從袋中分析。
[0260]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在呼吸收集的每一天觀察到V0C的不同模式（圖14)。例如，當與基 準日和瘧疾感染期間相比時，施用抗瘧疾藥之后的日子出現(xiàn)較高傳感器響應。
[0261] 發(fā)明人使用Q值來選擇對烯丙基甲基硫化物最靈敏的傳感器，（圖15)并且該方法 提供5760個傳感器中的118個能在呼吸樣本中鑒別烯丙基甲基硫化物的虛擬傳感器(表8)。 圖15中可見，具有最大距離的區(qū)域是在圖的右上角，其對應于傳感器1(摻雜Ag的Sn0 2)。
[0262] 表8:能夠鑒別對照呼吸與具有稀丙基甲基硫化物的加標呼吸的最佳虛擬傳感器。
[0264] 箱線圖（圖16)是針對在呼吸收集的不同日間的傳感器編號2314(具有最大距離的 傳感器hANOVA測試表明傳感器在呼吸收集日（瘧疾階段)間的響應存在顯著差異。特別地， 第0天顯著地不同于藥物治療之后收集的樣本。
[0265] 傳感器2314的多重比較測試（圖17)確認在第8天和第9天(AM和PM)存在顯著更高 的傳感器響應(無重疊區(qū)間）。
[0266] 實施例5-揮發(fā)性有機化合物的水平
[0267] 抗瘧疾藥注射之后6.5小時收集的呼吸樣本的GCMS光譜的覆蓋圖以及針對加標呼 吸樣本的校準曲線（圖19)確認在約RT 3.75下的V0C是烯丙基甲基硫化物。
[0268] 通過使用得自校準曲線的線性方程，計算2組(表9)的烯丙基甲基硫化物(AMS)的 絕對濃度。使用的方程如下：
[0269] Y = 3E-07x
[0270] 其中x是峰下面積，并且y是以ppb計的計算濃度。表9中計算的值是僅當制備標準 的濃度不很接近分析物在未知物中的期待濃度時的近似值。
[0271 ]表9:烯丙基甲基硫化物在來自2組的呼吸樣本中的近似絕對濃度。
[0273] *在第29天存在離群值，并且該數(shù)據(jù)點退出計算。
[0274] 檢測到>15ppt的AMS則指示瘧疾感染，并且高于300ppt的尖峰表明治療成功。
[0275] 表10和表11示出最高倍數(shù)變化、第X天/第0天曲線下面積比率(其中（X =不等于0 的一天），針對各揮發(fā)性有機化合物(烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（z)-i-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯)和各組之間，樣本是在藥物施用之后6.5小時收集(加粗）。存 在一個例外，針對1組中的化合物AMS，最高變化是在第4天。
[0276] 表10:1組揮發(fā)性有機化合物的倍數(shù)變化。
[0278]發(fā)明人預期，該倍數(shù)變化值可能在現(xiàn)場取得的瘧疾患者中更高，其中寄生蟲血癥 將在0.1%至10%之間。本樣本收集自先導物誘發(fā)的血液階段惡性瘧原蟲感染，其中志愿者 受低劑量感染并且感染限于〇. 001 %寄生蟲血癥，
[0279] 在第28天/第29天觀察到倍數(shù)變化升高，這可能是因為樣本收集之前4日剛進行了 Riamet (搶救藥物)治療。
[0280] 實施例6-鑒別診斷
[0281] 硫化物化合物是體外普遍細菌代謝物(例如二甲基硫化物）。為了排除所識別V0C 是感染的一般指標并且對瘧疾不具有選擇性的可能性，本發(fā)明人重新檢查醫(yī)院急診部提供 的細菌性誘發(fā)發(fā)熱的患者的呼吸色譜。他們發(fā)現(xiàn)烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（z)-i-甲硫基-1-丙烯和(E)-1-甲硫基-1-丙烯的各者的水平極低，并且在發(fā)熱和對照組中相同。 這些熱病非瘧疾患者中的微生物被識別為大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、大芬戈爾德菌（Finegoldia magna)、白色念珠菌（Candida albicans)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)、釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes)〇
[0282] 表11:2組揮發(fā)性有機化合物的倍數(shù)變化。
[0284] ZMP=(Z)-1_甲硫基-1-丙烯，AMS =烯丙基甲基硫化物，MP=1_甲硫基丙烷，EMP = (E)-l_甲硫基-1-丙稀
[0285] 應該注意到，為上述試驗取自患有細菌感染的患者的呼吸體積是用于瘧疾試驗 (1L)的一半體積(0.5L)，但即使藥物治療之后峰的強度值得注意，人們?nèi)钥蓤孕偶幢阍谒?分析呼吸的體積較低的情況下，那些硫醚大體上不存在。
[0286] 這些結(jié)果表明，對選自烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（Z)-1-甲硫基-1-丙烯 和(E)-1-甲硫基-1-丙烯的V0C中的一種或多種的水平的檢測可用于識別作為感染原因的 瘧疾。烯丙基甲基硫化物還已知由于大蒜食用而產(chǎn)生。發(fā)明人考慮化合物的水平的飲食來 源可能對瘧疾診斷造成困惑。發(fā)明人所進行的測試的結(jié)果表明，即便在食用高大蒜含量的 膳食之后，呼吸上的烯丙基甲基硫化物的水平比臨床試驗志愿者中觀察到的那些低得多。
[0287] 環(huán)境空氣的GCMS分析表明來自臨床的房間空氣中所述硫醚(Z)-1-甲硫基-1-丙 烯、烯丙基甲基硫化物和(E)-1-甲硫基-1-丙烯無顯著峰（圖18a)，指示環(huán)境空氣樣本中不 存在(可檢測水平的)這些V0C。對1-甲硫基丙烷(圖18b)獲得類似結(jié)果。
[0288] 實施例7-呼吸中揮發(fā)物與寄生蟲水平相關
[0289] 莖里
[0290] 發(fā)明人研究硫醚水平和寄生蟲血癥水平之間的關系。治療之前，存在硫醚(特別是 烯丙基甲基硫化物和(E)-甲硫基-1-丙烯）的水平與寄生蟲血癥的水平這兩者周期性改變 的證據(jù)（圖20)。在兩種情況下，該周期似乎大約48小時，雖然取樣方案不允許任何更大分辨 率，并且被強加于寄生蟲血癥的一般上升趨勢(如PCR確定）以及硫醚的水平。硫醚水平的周 期性變動似乎與寄生蟲血癥異相。向后相移硫醚數(shù)據(jù)24小時，揭示出寄生蟲血癥與揮發(fā)物 水平之間的直接相關（圖21a)。對于1組，烯丙基甲基硫化物與(E)-甲硫基-1-丙烯是具有最 高相關性的化合物，分別為:r 2 = 0.94和r2 = 0.97。對于2組，稀丙基甲基硫化物(r2 = 0.97)再 次與1-甲硫基-丙烷(r2 = 0.92)-起與寄生蟲血癥高度相關聯(lián)。
[0291] 在兩個組中，觀察到，最高水平的硫醚是出現(xiàn)于在藥物施用之后(6.5小時)收集的 第一呼吸樣本中（圖20)，這可能指示在驅(qū)動硫醚產(chǎn)生中寄生蟲死亡或溶解的作用。揮發(fā)物 水平在初始藥物治療之后單調(diào)下降，這與寄生蟲血癥的清除有關（圖20)。對于1組，與在2組 中用更慢作用的雙喹啉4-氨基喹啉觀察到的清除相比，快速作用合成臭氧化物的施用導致 寄生蟲血癥和硫醚水平的更快減少（圖20)。對于1組，治療后，寄生蟲血癥的水平與（Z)-甲 硫基-1-丙稀(r 2 = 0.76)、（E)-甲硫基-1-丙稀(r2 = 0.98)和1-甲硫基-丙烷(r2 = 0.99)的豐 度之間存在直接相關（圖3b)。對于2組，在硫醚的水平與寄生蟲血癥的水平之間存在較低但 仍顯著的相關性，特定而言對于(E)-甲硫基-1-丙烯而言為r 2>0.79并且對于烯丙基甲基硫 化物而言為r2>0.76(圖21b)。
[0292] 過造
[0293] 寄生蟲與揮發(fā)物水平之間觀察到的24小時相移表明，所述揮發(fā)物可能與血液階段 寄生蟲的48小時生命周期有關聯(lián)，并且該峰對應于被感染紅血細胞何時脹裂(裂殖體破裂） 而釋放裂殖子并且感染新紅血細胞以再開始紅血球循環(huán)。在惡性瘧原蟲感染中，裂殖體破 裂每48小時發(fā)生。
[0294] 實施例8-基于硫醚水平的機器學習瘧疾感染分類
[0295] 使用存在于第0天預感染和第7/8天PM的呼吸樣本中的4種硫醚的峰下面積，據(jù)發(fā) 現(xiàn)，使用留一法交叉驗證與支持向量機(SVM)或k最近鄰(KNN)分類器，所有樣本可基于揮發(fā) 物水平被完美地分類，這表明在基準日和藥物施用不久之后的統(tǒng)計顯著差異。理想地，有可 能在一個組上訓練分類器并且使用其來分類另一個組。這稍微有些復雜，因為事實上發(fā)明 人GC-MS離子源已被清潔并且在兩個組之間再校準。然而，在執(zhí)行數(shù)據(jù)歸一化來說明這些改 變之后，發(fā)明人使用1組數(shù)據(jù)來訓練所述分類器，并且所述分類器能夠完美地從2組中分類 數(shù)據(jù)。以同樣的方法，使用2組來訓練分類器，提供1組數(shù)據(jù)的完美分類。
[0296] 實施例9-體外揮發(fā)物
[0297] Wong等人(2012)先前報道，當體外紅細胞培養(yǎng)物受惡性瘧原蟲感染時，可能檢測 到頂部空間揮發(fā)物無變化。發(fā)明人明確地在100mL紅血細胞懸浮體（1 %紅細胞壓積，起始寄 生蟲血癥0.5%)的頂部空間中搜索4種硫醚，顯示最終寄生蟲血癥水平約39%。在用lOOOng mr1抗瘧疾哌喹四磷酸鹽四水合物治療之后，以及在用清潔劑使細胞膜破裂之后，在惡性瘧 原蟲受感染細胞培養(yǎng)物(5.5h)的頂部空間中也未檢測到硫醚。作為陽性對照物，發(fā)明人按 以下水平將4種硫醚加標至紅血細胞培養(yǎng)物中：烯丙基甲基硫化物:2.7nmol I/1; 1-甲硫基-丙烷:4.4nmol L'即，健康個體中先前檢測的值(Mochalski等人，2013);以及異構體(Z)-甲硫基-1-丙烯和(E)-甲硫基-1-丙烯各2.5nmol I/1。發(fā)明人隨后將樣本孵育4天，并且正常 收集頂部空間。所有硫醚均容易檢測到。體外樣本還示出了來源于塑料燒瓶的V0C，但它們 不妨礙對4種硫醚的檢測，此外，在收集的環(huán)境樣本中未檢測到硫醚。
[0298] 血液培養(yǎng)物中存在的寄生紅血細胞（RBC)的生物量（0.1L X 0.01紅細胞壓積X 0.39寄生蟲血癥=0.39g被感染紅細胞）比志愿者中存在的感染RBC的生物量(5L X 0.43紅 細胞壓積X 0.00001寄生蟲血癥= 0.02g被感染紅血細胞）高約18倍。在體外取樣可用的 400mL頂部空間中的大約200mL，與取樣自志愿者的1L呼吸進行比較。在人類志愿者中，每次 呼吸存在"吹走(blow off)"硫醚的可能性，所以必須假定志愿者中測量的硫醚水平代表生 成與耗散之間的暫時平衡，而在用于我們的體外研究的封閉燒瓶中存在硫醚累積的顯著可 能性。這些考慮表明，如果硫醚確實以相當水平在體內(nèi)產(chǎn)生，則該體外規(guī)程應該能夠檢測硫 醚。
[0299] 這些結(jié)果表明，宿主響應涉及在裂殖體破裂期間生產(chǎn)揮發(fā)物。以同樣的方法，在感 染RBC的溶解(裂殖體破裂)期間釋放的寄生蟲毒素與吞噬性人類細胞之間的交互作用在瘧 疾熱病發(fā)作中達到極點，其它分子事件可能發(fā)生在產(chǎn)生硫醚的裂殖體破裂期間。
[0300] 實施例10-患有間日瘧原蟲感染的患者中水平增加的揮發(fā)性有機化合物
[0301] 越
[0302] 在第0天用靜脈內(nèi)施用的約100個有活力的間日瘧原蟲感染的人類紅細胞來接種 志愿者。基于門診患者，直至第7天當志愿者每日訪問臨床單位以便血液收集，然后在每日 兩次(AM和PM)針對以下進行寄生蟲檢測之后通過電話每日監(jiān)測志愿者：
[0303] ?寄生蟲血癥的定量（如通過兩種寄生蟲基因組等效物的PCR并且針對配子母細 胞特異性轉(zhuǎn)錄物Pvs25進行評價），
[0304] ?暗示瘧疾的癥狀或跡象的意外早期發(fā)作，以及
[0305] ?不良事件。
[0306] 在開始治療之前3天或4天期間（約第11天、第12天、第13天和第14天），進行傳播研 究。在所述日期，將2X6ml血液收集(AM和/或PM)至肝素化真空采集管中以用于用斯氏按蚊 (八11.3丨6口116118；0進行膜飼養(yǎng)測定。為其它目的（寄生蟲定量的？〇?，根據(jù)需要的血液和安全 血液探索性研究）收集額外血液。為預防早熟小配子形成，將血液保持在38°C下（至多35分 鐘），直至分散至膜飼養(yǎng)器中。隨后將志愿者護送至位于昆士蘭醫(yī)學研究院（Queensland Institute of Medical Research)的檢疫昆蟲研究所，并且要求他們允許在其前臂或大腿 的掌側(cè)表面上飼養(yǎng)媒介蚊子持續(xù)1〇±5分鐘的周期(直接飼養(yǎng)測定）。通過參加者的直接飼 養(yǎng)，蚊子的實驗性感染執(zhí)行至多3次，并且通過人工膜飼養(yǎng)至多6次，直至抗瘧疾治療開始。 僅通過膜進行額外蚊子飼養(yǎng)是在Q-Pharm臨床點收集的傍晚樣本上進行。
[0307]在指定開始治療的那天，如通過臨床上明顯的瘧疾感染所確定（預期是約第14 天），容許志愿者進入研究單位并且限制行動以便安全監(jiān)測和抗瘧疾治療。允許轉(zhuǎn)入臨床單 位將是陽性寄生蟲血癥以及瘧疾臨床特征的發(fā)作，基于我們的先前研究(McCarthy等人， 2013)，預期是在約第14天發(fā)生。在治療之前執(zhí)行單個手指刺扎試驗來與周邊血液樣本比較 配子母細胞數(shù)。
[0308]在治療之后，志愿者作為住院患者被追蹤36小時以確保治療耐受性與臨床響應。 一旦臨床上良好，則針對抗瘧疾藥物的連續(xù)給藥基于門診患者追蹤安全性與瘧疾寄生蟲的 清除，如通過靈敏定量PCR評價。
[0309] 除血液收集以外，呼吸樣本在接種之前收集并且至多14次后感染。在預指定時間 點，要求志愿者通過附接至呼吸儲器(袋子)的單個吹口呼出（至多3次）。呼吸樣本被轉(zhuǎn)移至 吸附管，并隨后通過本文所述的氣相色譜-質(zhì)譜分析法分析，以評估揮發(fā)性有機化合物的存 在。
[0310] 為了代謝研究，在接種之前以及開始抗瘧疾治療24小時之后，收集第一天上午排 泄的尿。
[0311] 針對安全性評定的追蹤訪問是在瘧疾攻毒之后第28天執(zhí)行，并且需要志愿者在結(jié) 束研究訪問之后至多2周時是可接觸且可用的。
[0312] RiametK片劑（蒿甲醚(2〇mg)和苯芴醇（120mg))單個劑量4片每天兩次在時間0、 12、24、36、48和60小時處隨脂肪食品口服，總劑量為6劑24片，將此作為搶救治療。
[0313] ^
[0314] 可注意到，間日瘧原蟲寄生蟲血癥的生長和清除動力學不同于惡性瘧原蟲（圖 22)。該模式是該屬種典型的，并且先前已有所描述(McCarthy等人，2013)。
[0315] 關于揮發(fā)物，在治療之前，揮發(fā)物的水平存在增加和降低的48小時循環(huán)，隨后在治 療之后水平降低（圖22)。在該研究中，發(fā)明人未觀察到在治療之后V0C立刻較大初始增加， 這歸因于治療的性質(zhì)。
[0316] 本領域技術人員應了解的是，可在不脫離如廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍的情 況下對如特定實施方案中所示的本發(fā)明做出眾多變化和/或修改。因此，本實施方案視為在 所有方面是說明性的而不是限制性的。
[0317] 本申請要求于2013年11月28日提交的AU 2013904616的優(yōu)先權，所述申請的全部 內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0318] 本文所討論和/或參照的所有出版物都整體并入本文。
[0319] 對文件、法案、材料、裝置、物品等已包括在本說明書中的任何論述都僅出于提供 本發(fā)明的上下文的目的。不應視為認可的是任何或所有這些事項因為在本申請的各權利要 求的優(yōu)先日期之前存在而形成先前技術基礎的一部分或是與本發(fā)明相關的領域中的普通 常識。
[0320] 參考文獻
[0321] Aregawi et al.(2011)fforld Health Organization,Global Malaria Programme.World Malaria Report 2011，Geneva，World Health Organization.
[0322] Biamonte et al. (2013)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 23:2829-2843.
[0323] Bloland(2001)Drug resistance in malaria.ffH0/CDS/CSR/DRS/2001.4.
[0324] Cortes and Vapnik(1995)Mach.Learn.20(3)：273-297.
[0325] Dowell and Brown(2009)Methods in Molecular Biology 552:213-229.
[0326] Fukutani(2012)Biotechnology and Bioengineering 109:205-212.
[0327] Hanscheid et al.(1999)Clin.Lab.Haem.21：235-245.
[0328] Karunamoorthi(2014)Malaria Journal 13：209.
[0329] Le Manach et al.(2013)Malaria Journal 12:424.
[0330] Lin CCCCJ(2011)LIBSVM：a library for support vector machines (www.csie.ntu.edu. tw/~cjlin/libsvm).
[0331] McCarthy et al.(2011)Plos One.D0I：10.1371/joumal.pone.0021914.
[0332] McCarthy et al.(2013)J.Infect Dis.208：1688-1694.
[0333] Mochalski et al.(2013)Analyst 138:2134-2145.
[0334] Russell and Norvig(1995)Articial Intelligence:A Modern Approach.ed Pentice Hall EC?N.J..
[0335] Vaughan(2012)Future Microbiol.7:657-665.
[0336] Wang et al.(2014)PL〇S One 9(3)：e89840.
[0337] Wong et al.(2012)Malaria Journal 11:314.
[0338] Wilson(2012)Clinical Infectious Diseases 54:1637-1641?
【主權項】
1. 一種用于識別患有瘧原蟲感染的受試者的方法，所述方法包括在所述受試者或得自 其的樣本中檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基 硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯組成的組，其中所述 一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平指示瘧原蟲感染。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平還指示所 述瘧原蟲感染的狀態(tài)。3. -種用于監(jiān)測患有瘧原蟲感染的受試者的方法，所述方法包括在所述受試者或得自 其的樣本中檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基 硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯組成的組，其中所述 受試者先前已知具有瘧原蟲感染，并且其中所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平指示 所述瘧原蟲感染的狀態(tài)。4. 如權利要求3所述的方法，其中所述受試者已施用化合物來治療所述感染。5. 如權利要求4所述的方法，其中當與治療之前的水平相比時，在所述治療之后，所述 一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的初始增加指示所述治療是有效的。6. 如權利要求4或權利要求5所述的方法，其中在施用所述治療之后0.5至72小時之間， 監(jiān)測受試者的所述初始增加。7. 根據(jù)權利要求3至6中任一項所述的方法，其中一種或多種揮發(fā)性有機化合物的所述 水平的降低指示所述治療已經(jīng)有效。8. -種選擇用于瘧原蟲感染的合適治療的方法，所述方法包括:在所述受試者或得自 其的樣本中檢測一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙 基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯組成的組；以 及基于所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平來選擇合適的治療。9. 根據(jù)權利要求1至8中任一項所述的方法，其中在所述樣本中是選自由呼出氣、呼吸 冷凝物、唾液、血液、汗水、皮膚微生物、皮膚揮發(fā)性樣本和尿組成的組。10. 如權利要求9所述的方法，其中所述樣本是呼出氣。11. 根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的方法，其還包括將所述一種或多種揮發(fā)性有機 化合物的水平與合適對照物比較。12. 根據(jù)權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。13. -種識別用以治療瘧原蟲感染的化合物的方法，所述方法包括 i) 將候選化合物施用于受瘧原蟲感染的受試者，以及 ii) 針對一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平來監(jiān)測所述受試者或得自其的樣本，所 述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和 (Z)-I-甲硫基-1-丙烯組成的組， 其中在步驟i)之后，所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的初始增加，和/或所述 一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平的降低，指示所述化合物可用于治療瘧原蟲感染。14. 一種識別對抗瘧原蟲化合物已發(fā)展出耐藥性的瘧原蟲的菌株的方法，所述方法包 括 i) 將所述抗瘧原蟲化合物施用于受瘧原蟲菌株感染的受試者，以及 ii) 針對一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平來監(jiān)測所述受試者或得自其的樣本，所 述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和 (Z)-I-甲硫基-1-丙烯組成的組， 其中在步驟i)之后，所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的水平缺乏顯著改變指示該瘧 原蟲菌株具有對抗瘧原蟲化合物的耐藥性。15. 如權利要求1至14中任一項所述的方法，其中對所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物 的所述檢測或監(jiān)測包括使用選自由以下組成的組的至少一種技術:質(zhì)譜學(MS)(諸如氣相 色譜質(zhì)譜學(GCMS)、液相色譜質(zhì)譜學(LCMS)和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應質(zhì)譜學(PTR-MS));離子迀移光 譜學;場非對稱離子迀移光譜學;差分迀移光譜學(DMS);電子鼻裝置;生物傳感器;基于抗 體的檢測系統(tǒng)；比色測定;紅外光譜學（IR光譜學）（諸如近紅外(NIR)、傅里葉變換-紅外線 (FTIR)光譜學和衰蕩腔光譜學）；選擇離子流動管質(zhì)譜學(SIFT)，燃料電池電極;光吸收光 譜學;納米粒技術;柔性平板波(FPW)傳感器;電化學傳感器;光聲設備;基于激光的設備;各 種電離技術和馴養(yǎng)動物檢測或其組合。16. 如權利要求15所述的方法，其中對所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的所述檢測 或監(jiān)測包括使用選自由以下組成的組的至少一種技術:氣相色譜質(zhì)譜學(GCMS)、液相色譜 質(zhì)譜學(LCMS)、電子鼻裝置、生物傳感器、基于抗體的檢測系統(tǒng)、比色測定、近紅外(NIR)、選 擇離子流動管質(zhì)譜學(SIFT)和質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應質(zhì)譜學(PTR-MS)。17. 如權利要求16所述的方法，其中對所述一種或多種揮發(fā)性有機化合物的檢測包括 使用氣相色譜質(zhì)譜學(GCMS)或電子鼻裝置。18. -種篩選用于識別患有瘧原蟲感染的受試者的化合物的方法，所述方法包括 i) 使候選化合物與揮發(fā)性有機化合物接觸，所述揮發(fā)性有機化合物選自由烯丙基甲基 硫化物、1-甲硫基丙烷、（E)-I-甲硫基-1-丙烯和(Z)-I-甲硫基-1-丙烯組成的組，以及 ii) 確定所述化合物是否與所述揮發(fā)性有機化合物結(jié)合或反應， 其中與所述揮發(fā)性有機化合物結(jié)合或反應的化合物可被用于根據(jù)權利要求1至12中任 一項所述的方法。19. 根據(jù)權利要求1至18中任一項所述的方法，其中所述瘧原蟲是惡性瘧原蟲、諾氏瘧 原蟲、間日皰原蟲、卵形皰原蟲curt is i亞種、卵形皰原蟲wallikeri亞種或三日皰原蟲。20. 如權利要求19所述的方法，其中所述瘧原蟲是惡性瘧原蟲或間日瘧原蟲。
【文檔編號】G01N33/497GK105899948SQ201480070523
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月28日
【發(fā)明人】S·特羅威爾, A·伯納, B·帕多萬, V·洛克
【申請人】聯(lián)邦科學技術研究組織