豇豆疫霉菌lamp檢測引物及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明豇豆疫霉菌LAMP檢測引物及其檢測方法，專用于豇豆疫霉菌高靈敏度快速LAMP檢測，同時可用于田間豇豆疫病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定，屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]由5工豆疫霉菌Kinase)侵染所致的5工豆疫病是5工豆成株期主要病害，適宜發(fā)病溫度為25-28 °C，并且隨著雨水增多、濕度增大，病害亦趨嚴(yán)重，所以春季連續(xù)陰雨和梅雨期間是疫病高發(fā)期。其次，若通風(fēng)不好、排水不良、施用不腐熟基肥或連作地，發(fā)病亦較重。其病原5工豆疫霉菌{Phytophthora vignae)是疫霉屬卵菌，隸屬于藻菌界，卵菌門，卵菌綱，霜霉目，腐霉科。目前為止，對該病害的檢測診斷主要是癥狀診斷和病原分離鑒定。癥狀識別方法如下:(1)莖部發(fā)病癥狀:莖部發(fā)病多發(fā)生在節(jié)部，初呈水漬狀，無明顯邊緣，病斑擴展繞莖一周后，表皮變褐色，病莖以上葉片迅速萎蔫死亡；(2)葉片發(fā)病癥狀:葉片發(fā)病初生暗綠色水漬狀圓形病斑，邊緣不明顯，天氣潮濕時，病斑迅速擴大，可蔓延至整個葉片，表面有明顯的白色霉?fàn)钗铮鸶癄€，天氣干燥時，病斑變淡褐色，葉片干枯；(3)豆莢發(fā)病癥狀:豆莢產(chǎn)生暗綠色水漬狀病斑，邊緣不明顯，后期病部軟化，表面產(chǎn)生白霉；病原菌鑒定方法如下:在培養(yǎng)莖上菌絲體生長茂密；菌絲無隔透明，粗4-7 μm ;菌絲膨大體不規(guī)則結(jié)節(jié)狀。在皮氏液中形成大量孢子囊，孢囊梗不分枝，與菌絲無明顯區(qū)別。孢子囊多為卵形，橢圓形或倒梨形，形狀和大小變化較大，在PDA上為21-42 μ mX 10-19 μ m，平均 28.1 μ mX 16.3 μ m，在虹?病英上為 35-57 μ mX 25-38 μ m，平均 53.0 μ mX 33.8 μ m，長寬比值為1.4-2.2，平均1.65 ;絕大多數(shù)無乳突或無明顯乳突，平均高0.57 μ m ;成熟后不脫落，具內(nèi)層出現(xiàn)象。未見厚垣孢子。產(chǎn)生大量有性器官，藏卵器近球形，無色，直徑24-38(平均28.4) μπι。雄器近球形，圍生。卵孢子近球形，淡黃色，平滑，18-25 μ mX 14-24 μ m，平均23.0 μ mX 20.8 μ mD而關(guān)于虹疫霉菌的PCR分子檢測國內(nèi)外尚未見報道，傳統(tǒng)的病原菌檢測方法程序繁瑣，所需時間長，且必須擁有病原菌詳細(xì)的分類資料，滿足不了病害控制中快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測要求。因此，建立一套快速、靈敏、準(zhǔn)確的豇豆疫霉菌檢測技術(shù)非常必要且十分迫切。
[0003]目前，對植物病害的傳統(tǒng)檢測鑒定方法是首先進(jìn)行病菌分離，通過對已經(jīng)分離并純化的病菌進(jìn)行培養(yǎng)，觀察，完成形態(tài)上的鑒定工作。同時，將病原菌回接到植株中，進(jìn)行致病性的驗證。最后，對照已有的分類資料確定引起病害的病原菌的分類和地位。該法作為最基本的病原菌鑒定方法在一直以來被廣泛使用，有著很強實用性，是病原菌的鑒定及病害檢測的方法之一，但是該方法受人為因素和環(huán)境的影響，對操作者的實驗技能和實際經(jīng)驗有很高的要求，十分耗時，無法達(dá)到快速檢驗的要求。
[0004]免疫學(xué)檢測技術(shù)(Immunological technology)具有操作簡單、特異性強，以及檢測時間短的優(yōu)點，適合開發(fā)檢測試劑盒。但其不能對檢測對象進(jìn)行擴增，所以靈敏度不及核酸檢測技術(shù)高。另外，抗體的制作過程耗時、復(fù)雜，提高了檢測的成本。這兩點缺點限制了免疫學(xué)檢測技術(shù)的推廣使用。
[0005]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain React1n，PCR)是一種利用DNA聚合酶在體外大量擴增靶序列的技術(shù)，該技術(shù)是病原檢測最常規(guī)的方法之一，廣泛應(yīng)用于病原鑒定、變異檢測等分子生物學(xué)研究。PCR檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強，已成為病原菌檢測重要的技術(shù)之一，主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR (Nest-PCR)和實時熒光定量PCR等，主要的缺點是需要依靠PCR等儀器設(shè)備，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
[0006]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated Isthermal Amplificat1n，LAMP)技術(shù)是由日本科學(xué)家開發(fā)的一種最新的簡便、快速、準(zhǔn)確及廉價的核酸高效擴增方法(Notomi et al.，2000)o LAMP技術(shù)是一種新型的核酸恒溫擴增方法。該技術(shù)在等溫條件下，可在短時間內(nèi)使產(chǎn)物得到大量擴增，在短短的30min~60min內(nèi)就能實現(xiàn)109~101(]倍的擴增，同時具有很高的靈敏度和特異性，且操作簡便，檢測結(jié)果可肉眼判斷，反應(yīng)結(jié)束后用肉眼觀察是否產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，即可判斷靶序列是否存在。亦可在反應(yīng)液中加入熒光指示劑，使反應(yīng)結(jié)果的肉眼觀察更加的方便、直觀和可靠。LAMP技術(shù)操作簡單、快速高效，而且檢測特異性非常強，其最大的優(yōu)勢就是在恒溫條件即可進(jìn)行擴增反應(yīng)，無需特殊實驗設(shè)備，相較于普通PCR技術(shù)，其有很多優(yōu)點。
[0007]綜上，目前病害檢測方法主要采用傳統(tǒng)的病原分離檢測方法和分子檢測等技術(shù)。傳統(tǒng)檢測方法耗時、耗力，且檢測結(jié)果可靠性低，免疫學(xué)檢測技術(shù)的靈敏度較低，且抗體的制作過程耗時、復(fù)雜，檢測成本高，PCR技術(shù)雖然快速、準(zhǔn)確，但需昂貴的儀器設(shè)備，檢測成本高，不適宜在基層部門推廣應(yīng)用。而最近科學(xué)家們研發(fā)出的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)技術(shù)是一種高效率的核酸等溫擴增方法，該方法短時間內(nèi)實現(xiàn)產(chǎn)物的大量擴增，靈敏度比PCR高，且操作步驟簡便，無需特殊設(shè)備，檢測結(jié)果可由肉眼判斷，極適合于在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用?；诃h(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)，建立豇豆疫霉菌的LAMP檢測技術(shù)，根據(jù)LAMP技術(shù)原理，選取豇豆疫霉菌的核糖體基因上的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)革巴序列的6個區(qū)域，進(jìn)而設(shè)計出4條特異性引物，通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，以鈣黃綠素(Calcein)的熒光顯色指示劑作用，建立可視化LAMP檢測技術(shù)。該體系對豇豆疫霉菌檢測具有高的特異性與靈敏性。該技術(shù)是一種操作簡單、靈敏度和特異性高的快速檢測手段；無需特殊儀器設(shè)備，同時開發(fā)的快速檢測試劑盒適合田間作物生產(chǎn)中開展實地檢測與監(jiān)測，從而保障作物健康生產(chǎn)及食品安全。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中豇豆疫霉菌的傳統(tǒng)檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，PCR檢測需要依靠擴增儀等設(shè)備，且靈敏度低的問題，提供一種豇豆疫霉菌的LAMP檢測引物以及結(jié)果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的檢測方法。
[0009]實現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟:
1.LAMP引物的設(shè)計
根據(jù)豇豆疫霉菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-1TS)序列在疫霉菌種間高度變異和種內(nèi)穩(wěn)定性，采用PrimerExplorer V4軟件設(shè)計了對5工豆疫霉菌具有特異擴增作用的LAMP檢測引物，包括2條外引物(F3和B3)和2條內(nèi)引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG ；
B3: TCCTCCATTAAACGCCGC ；
FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG-TGTAGTCGGTGGATGGAGAC ；
BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG-AGCAGACAAACTGGTCGC ；
2.豇豆疫霉菌快速檢測體系的建立
LAMP檢測:25 μ 1反應(yīng)體系中F3和Β3引物濃度各為0.2 mmol/L，F(xiàn)IP和BIP引物濃度各 1.6 mmol/L, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4) 2S04，lOmM KCl，8mM MgS04，甜菜堿 0.8 mol/L, Bst 聚合酶為 8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，鈣黃綠素 50 μ mol/L，氯化錳 500 ymol/L,Tffeen-20 0.1%，模板DNA 50-100 ng，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應(yīng)條件為在63-65°C溫育 45-60 min，85°C滅活 5-lOmin。
[0010]所述的檢測方法為熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法。所述熒光染料目測觀察法:在LAMP反應(yīng)后，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。所述瓊脂糖凝膠電泳法:取2 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)擴增條帶判斷為陰性。
[0011]該方法可用于帶菌的植株的高靈敏度快速檢測。建立豇豆疫霉菌快速、簡便、特異性強、靈敏度高的監(jiān)測技術(shù)體系，對于豇豆疫病顯癥之前的早期監(jiān)測，確定病害防治最佳時期具有十分重要的意義。
[0012]本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)是豇豆疫霉菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。為了驗證豇豆疫霉菌檢測的特異性，本發(fā)明以采集分離的20株豇豆疫霉菌和25種其它疫霉菌或病原真菌為供試材料，對檢測的特異性進(jìn)行LAMP驗證。
[0013]LAMP檢測:25 μ 1反應(yīng)體系中F3和Β3引物濃度各為0.2 mmol/L, FIP和BIP引物濃度各 1.6 mmol/L, 20mM Tris-HCl, 10mM (NH4) 2S04，lOmM KCl，8mM MgS04，甜菜堿 0.8mol/L, Bst 聚合酶為 8 U，dNTPs 1.0 mmol/L，|丐黃綠素 50 μ mol/L，氯化猛 500 μ mol/L，Tffeen-20 0.1%，模板DNA 50-100 ng，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應(yīng)條件為在63-65°C溫育 45-60 min，85°C滅活 5-lOmin。
[0014]除了 20株豇豆疫霉菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 25種其它疫霉菌或病原真菌菌株的顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶。這說明該引物可被用于生產(chǎn)實踐中豇豆疫霉菌快速可靠的檢測和鑒定。
[0015]當(dāng)在用于豇豆組織中存在疫霉病菌的檢測時，采用NaOH快速裂解法提取豇豆疫霉菌的DNA，具體過程如下:(1)將豇豆病葉或病莖洗凈、晾干，剪取發(fā)病部位；(2)按lmg病葉加入1