本發(fā)明涉及一種高通量高回收的槍頭式固相萃取方法。

背景技術：

1、在生物、藥物分析中，固相萃取是一種從各種復雜樣本中提取有效目標物質(zhì)的最佳方法之一，能夠降低基質(zhì)效應，提高樣品清潔度以及有利于低濃度分析物/代謝物的分析。市面上常用的是硅膠鍵合的c18小柱以及聚合物基質(zhì)的hlb小柱，根據(jù)填料裝填容器的不同可以分為孔板式、柱式、板式等；根據(jù)容器的不同，可以通過自動化處理、基于重力處理、基于正壓/反壓裝置處理、儀器在線處理等；裝填填料根據(jù)需求主要有5mg、10mg、30mg、60mg等。標準spe一般包括5個步驟，活化、平衡、上樣、清洗和洗脫，對于柱式的spe操作，每一步的操作至少需要用到幾百微升有機試劑，并且最后一步洗脫，每洗脫一次就需要幾百微升的洗脫劑。

2、洗脫體積大，導致供試液中待測成分的濃度被稀釋，一般需要通過氮吹干燥后，重新復溶后再用質(zhì)譜進樣檢測。這樣會增加步驟，耗費時間人力。

3、如果考慮減少洗脫體積，或者減少洗脫次數(shù)，直接上樣，會存在洗脫體積不足，目標化合物回收率不足甚至未被洗脫的風險，導致檢測結果不準確。

4、市場上也推出了新的3步spe方案，雖然減去活化和平衡步驟，理論上可以做到節(jié)約樣品制備時間和溶劑消耗量，但是洗脫液體積較大的問題仍未得到解決。

5、高通量樣本處理系統(tǒng)，即短時間內(nèi)，同時處理大量樣本，快速對大量樣品進行高通量篩選和分析，是現(xiàn)代檢測技術的發(fā)展方向。結合自動化系統(tǒng)，可以提高實驗效率，減少人工操作，降低成本，并提高結果的重復性和準確性。

6、市場上有多種規(guī)格的獨立spe柱可供選擇，但是在操作上無論是基于重力或者正壓/反壓裝置輔助的提取方式，費時費力，無法有效實現(xiàn)高通量，并且成本較高。將spe做成elution板和自動化結合的方式雖然可以提高通量，但是仍然需要借助吸頭或者鋼針進行各類溶劑的轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生較大消耗，提高樣本處理成本。除此之外，商品化填充的柱床體積雖然有多種規(guī)格可選，但填料柱體積仍然較大，購買成本較高，而且對于后續(xù)結合質(zhì)譜分析的流程而言，仍停留在較大起始樣本體積及處理體積從而導致較大的樣品和中間處理的試劑浪費。

7、因此，雖然spe處理能夠為分析帶來極大優(yōu)勢，但是由于該操作耗時、商品化產(chǎn)品價格昂貴且操作復雜，通常不會作為處理樣品首選。因此，亟需一種低成本高通量、可同時處理多種樣本，可用于復雜樣品spe處理的新方法。

8、dpx槍頭式分散固相微萃取柱是一種新型的固相萃取裝置，通過槍頭式裝置、分散型樹脂萃取技術大幅度地提高了固相萃取速度，同時有效減少了溶劑的用量。dpx槍頭式分散固相微萃取柱內(nèi)部裝填分散的吸附樹脂，在適當溶劑條件下，特異性吸附目標化合物，經(jīng)洗凈緩沖液洗滌可除去非特異吸附雜質(zhì)，再用洗脫緩沖液洗脫可使目的樣品從相應樹脂上分離，完成目標化合物的純化與濃縮。槍頭式分散固相微萃取柱結合自動移液系統(tǒng)可以實現(xiàn)高通量，并且減少了起始進樣體積和洗脫體積。目前商品化dpx槍頭式分散固相微萃取柱的填料量可以低至1~5mg，但上樣體積仍然需要100μl以上，洗滌以及洗脫的體積通常在200μl以上。槍頭式分散固相微萃取柱雖然已經(jīng)大幅減少了起始樣本體積、填料用量和試劑用量，但仍然沒有解決洗脫液體積較大的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高通量、低成本、高回收的固相萃取凈化方法，該方法可對微量樣本進行處理，消耗相對更少的溶劑，凈化回收到更多目標化合物，并且可用于后續(xù)質(zhì)譜直接進樣，除特殊需求外無需額外富集濃縮。

2、本發(fā)明采用的技術方案是：

3、一種高通量高回收的槍頭式固相萃取方法，所述方法為：

4、采用槍頭式固相萃取柱，進行活化、平衡、樣品上樣、清洗、洗脫步驟，其特征在于，所述洗脫步驟為：

5、用第一洗脫劑進行第一次洗脫，收集第一管洗脫液；

6、用第二洗脫劑進行第二次洗脫，收集第二管洗脫液；

7、……

8、用第n洗脫劑進行第n次洗脫，收集第n管洗脫液；n為2~10的整數(shù)；

9、將部分或全部的第二管、第三管……、第n管洗脫液和全部的第一管洗脫液合并，得到洗脫液。

10、所述洗脫液可直接進行質(zhì)譜分析。

11、進一步，所述洗脫劑可以根據(jù)樣品性質(zhì)，以及樣品和槍頭式固相萃取柱的填料之間的吸附性能而適應性的改變。第一洗脫劑、第二洗脫劑、……、第n洗脫劑的種類和成分比例，可以相同也可以不同。

12、常用的洗脫劑包括有機溶劑（甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇中的一種或多種混合）、水-有機溶劑混合物（水-甲醇、水-乙腈）、酸性溶液（0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液）、堿性溶液（0.1%氫氧化銨水溶液）及鹽溶液（磷酸鹽緩沖液）等。

13、在一個優(yōu)選的實施方式中，第一洗脫劑、第二洗脫劑、……、第n洗脫劑為甲醇、乙腈的混合溶劑。

14、更優(yōu)選所述甲醇、乙腈的混合溶劑中，甲醇的體積分數(shù)為20~80%，更優(yōu)選50%。

15、優(yōu)選所述第二次、第三次……第n次洗脫時，吸取洗脫劑，吹出液體，如此反復吹吸1~10次，優(yōu)選反復吹吸3~7次，更優(yōu)選反復吹吸3~5次。

16、對于洗脫次數(shù)，優(yōu)選n=2，即洗脫兩次即可。

17、更優(yōu)選的，所述第一管洗脫液的體積記為v1，第二管洗脫液的體積記為v2，……，第n管洗脫液的體積記為vn，

18、v1、v2、……、vn的體積各自獨立為20~200μl，優(yōu)選20~100μl，更優(yōu)選20~50μl。

19、優(yōu)選v1≤v2，……、vn

20、更優(yōu)選，v1=v2=…=vn。

21、優(yōu)選最終洗脫液的體積v=v1+v2*(v1/v2*k2)+v3*(v1/v3*k3)+……+vn*(v1/vn*kn)

22、k2、……、kn為權重修正因子，優(yōu)選范圍各自獨立為0.1~10，優(yōu)選為0.1~1，更優(yōu)選為0.1~0.5，當k2=1時，代表從第二管洗脫液中轉(zhuǎn)移v1體積的洗脫液與第一管洗脫液混合。

23、所述方法中，活化、平衡、樣品上樣、清洗步驟，采用本領域常規(guī)技術即可。

24、所述槍頭式固相萃取柱為設有固相萃取填料的錐形管，錐形管的下端尖頭管口內(nèi)設有過濾篩板，固相萃取填料填充于過濾篩板上；所述過濾篩板具有能夠使液體試樣通過的孔或孔隙結構。

25、所述過濾篩板的上方為固相萃取填料層，所述固相萃取填料可以采用市面上通用的spe填料或自制填料，常用的spe填料包括c18（十八烷基鍵合硅膠）、c8（辛烷基鍵合硅膠）、hlb（親酯-親水高分子混合材料）、硅膠、離子交換樹脂、聚合物吸附劑等。常用的一般為c18填料、hlb填料等。

26、所述槍頭式固相萃取柱可以為商品化產(chǎn)品，也可以采用自填柱。

27、所述槍頭式固相萃取柱的填料量可以低至5μg~1mg，更低的填料用量顯著降低了固相萃取填料成本，有利于降低高通量檢測成本，通過高通量顯著提高檢測效率。

28、優(yōu)選活化步驟中采用甲醇活化，體積優(yōu)選50~200μl，次數(shù)可以為1~10次。

29、所述平衡步驟中采用水進行平衡，體積優(yōu)選50~200μl，次數(shù)可以為1~10次。

30、所述槍頭式固相萃取柱的填料為hlb填料時，可省略活化步驟。

31、所述樣品上樣的步驟中，樣品的體積優(yōu)選5~200μl，可以通過反復吹吸樣本來上樣，吹吸次數(shù)可以為1~10次。

32、所述清洗步驟中，采用的清洗液為甲醇、水的混合溶劑，其中甲醇的體積分數(shù)為1~10%，優(yōu)選3~5%，清洗次數(shù)可以為1~10次。

33、優(yōu)選的，本發(fā)明槍頭式固相萃取柱和自動化移液裝置結合，自動化移液裝置可以精準移液，通過設置自動化流程步驟，設置各步驟吸取體積、吹洗次數(shù)，以及各管洗脫液的收集體積，實現(xiàn)高通量自動化樣本萃取前處理。

34、在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明方法的洗脫步驟優(yōu)選為：

35、用第一洗脫劑進行第一次洗脫，收集第一管洗脫液，體積為v1；

36、用第二洗脫劑進行第二次洗脫，反復吹吸3~5次，收集第二管洗脫液，體積為v2，v2=v1；

37、將30%~80%（優(yōu)選50%）v1體積的第二管洗脫液和全部的第一管洗脫液合并，得到洗脫液。

38、本發(fā)明還公開了一種高通量高回收的鑒定檢測方法，所述方法為：

39、對待測樣本進行提取，所得提取液采用槍頭式固相萃取柱，進行活化、平衡、樣品上樣、清洗、洗脫步驟，所得洗脫液采用質(zhì)譜分析，其特征在于，所述洗脫步驟為：

40、用第一洗脫劑進行第一次洗脫，收集第一管洗脫液；

41、用第二洗脫劑進行第二次洗脫，收集第二管洗脫液；

42、……

43、用第n洗脫劑進行第n次洗脫，收集第n管洗脫液；n為2~10的整數(shù)；

44、將部分或全部的第二管、第三管……、第n管洗脫液和全部的第一管洗脫液合并，得到洗脫液，直接用于質(zhì)譜分析。

45、本發(fā)明的有益效果在于：提供了一種高通量高回收的槍頭式固相萃取方法，通過多次洗脫來保證目標化合物回收的完整性，通過部分轉(zhuǎn)移減少洗脫液的體積，但并不因此影響檢測目標化合物回收的完整性，反而提高了對目標化合物的檢出率，增加靈敏度，提高了檢測效率和檢測質(zhì)量，降低了試劑用量和操作步驟，降低成本。

46、在現(xiàn)有的洗脫方式中，洗脫液體積較大，如果想要處理樣本后直接進樣，只能選擇較小的洗脫體積，否則目標物整體稀釋倍數(shù)太大，會影響后續(xù)分析靈敏度。如果選擇較大洗脫體積，通常需要搭配氮吹或者凍干來避免靈敏度降低的問題，但是增加步驟造成整體方法耗時過長，樣本處理過程繁瑣，增加樣本污染的可能，并且對于大批量樣本的高通量自動化檢測，增加步驟需要增加相應的自動化裝備模塊，導致成本增加。

47、本發(fā)明在第一步洗脫時用較小的洗脫體積將大部分目標物質(zhì)進行洗脫收集。在后續(xù)多步洗脫時，填料上只殘留一些與填料吸附力強，需要大量洗脫體積洗脫的目標化合物，采用與第一部洗脫等量或較大洗脫體積并反復吹吸的方式，將與填料吸附力強，難洗脫的目標化合物洗脫收集，從而提高回收的完整性，獲得大部分剩余目標化合物。為了避免增大樣本體積導致無法直接進行后續(xù)質(zhì)譜分析的問題，本發(fā)明提出只將后續(xù)洗脫液中的部分轉(zhuǎn)移與第一管洗脫液進行混合。按照優(yōu)化結果，本發(fā)明推薦轉(zhuǎn)移0.3~0.8倍v1體積的v2與v1混合，普適性較強。但是根據(jù)樣本處理的需求，也保留了靈活更改的選擇，可以根據(jù)公式v2*(v1/v2*k)計算轉(zhuǎn)移體積，只要按需對權重因子k進行修改即可，修改范圍可從0.1到1-10。

48、本發(fā)明采用槍頭spe多步洗脫，在保證能質(zhì)譜直接上樣的前提下，用多次洗脫來保證目標化合物回收的完整性。

49、本發(fā)明無需額外槍頭和鋼針支持，并且無需額外正壓或者反壓模塊，可以將樣本起始量控制比較低，微量樣本也可檢測，且使用對應的較少的處理溶劑，在保證回收率的基礎上高效地實現(xiàn)樣本處理成本的降低。此外，spe中影響回收率的其中一點是填料的動態(tài)吸附和解析量的問題，部分目標化合物由于與填料之間存在較大的吸附，洗脫難度大，導致需要更大的洗脫體積才能獲得理想回收，但是過大的體積會增加氮吹等樣品干燥步驟，從而降低整體的樣品處理效率，從另一個角度增加前處理成本。本發(fā)明洗脫體積小，無需氮吹，但同樣可檢測到難洗脫的目標化合物，提高檢出率，增加靈敏度，提高檢測效率的同時降低了成本。

50、本發(fā)明通過權重修正因子，對第二管乃至第n管洗脫液，只收集部分洗脫液和第一管洗脫液合并后進樣，經(jīng)過實驗證明，在只收集部分洗脫液的情況下，本發(fā)明既可以實現(xiàn)直接進樣（無需大體積洗脫后的氮吹干燥步驟等），而且盡可能的保證了需要大洗脫體積的難洗脫目標物的有效回收，能有效檢出樣本中的所有待測物，特別是難洗脫目標物，保證目標化合物回收的完整性，減少出現(xiàn)漏檢的情況，有非常大的實用價值。

51、另外，本發(fā)明結合自填柱可以大幅減少進樣體積，填料種類和用量可根據(jù)目標樣本量進行計算，減少填料用量和進樣體積，大大降低運行成本。

52、本發(fā)明方法可以結合自動化移液系統(tǒng)，進行自動化樣本處理凈化，從成本上，自動化流程從頭到尾只需要spe槍頭完成所有液體流程，無需額外潔凈槍頭，解決了自動化工作中最大的耗材使用問題，使得該方法真正做到樣本處理時間大大降低，成本大大降低，并且基本無需人工操作。并且自動化移液裝置可以高通量同時進行，可采用8~96通道，對大批量樣本的檢測，顯著提高處理效率。