一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，該試劑為應(yīng)用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的檢測(cè)試劑，由試劑1、試劑2和馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)曲線組成，其中試劑1為抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑為抗馮維勒布蘭德因子與膠乳顆粒結(jié)合而成的抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；試劑2為應(yīng)用液；馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應(yīng)緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)曲線為馮維勒布蘭德因子在人體內(nèi)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。相較現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)馮維勒布蘭德因子，且具有很高的靈敏度和可靠的重復(fù)性，并應(yīng)用在自動(dòng)化分析儀器上。
【專利說(shuō)明】—種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑及其制備方法和應(yīng)
用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)人血清中馮維勒布蘭德因子(vffF, von Willebrand Factor)的試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]馮維勒布蘭德因子(vWF，von Willebrand Factor)，又稱血管性血友病因子，是由第12號(hào)染色體上的vWF基因編碼，是一種大分子量的多亞基糖蛋白，由多個(gè)220kD的亞基組成。終產(chǎn)物的聚合度不一，分子量最高者可高達(dá)20MD。組裝完成后儲(chǔ)存于血小板的a顆粒、血管內(nèi)皮的Weibel-Palade小體中；其是存在于血液中的一種多功能多價(jià)的大型粘附糖蛋白。vWF因子在止血和血栓形成過(guò)程中具有極其重要的生理作用:一方面，調(diào)節(jié)介導(dǎo)血小板粘附反應(yīng)，并且通過(guò)與血小板上的受體和膠原蛋白的結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)血小板在血管內(nèi)皮上的粘附，主要過(guò)程是:血管內(nèi)皮受損一暴露膠原纖維一VffF因子連接膠原纖維一血小板表面糖蛋白I b受體結(jié)合vWF因子從而粘附在受損血管上，本功能主要由大分子量的多聚體完成；另一方面，還可與VIII (FVIII)的載體蛋白(VIII因子)非共價(jià)結(jié)合，從而保護(hù)VIII因子免于遭受包括活化的蛋白C在內(nèi)的蛋白酶的攻擊，防止VIII因子被過(guò)早清除，正常的止血過(guò)程就不會(huì)因VIII因子受酶切而異常。因此，血液中正常的馮維勒布蘭德因子是極為關(guān)鍵的，其水平的降低和功能的缺失則會(huì)導(dǎo)致血凝功能相關(guān)的疾病發(fā)生，此類疾病都是由于止血和血栓形成過(guò)程異常造成的；其中最常見(jiàn)的是馮維勒布蘭德病和血友病，其中因vffF因子所致的血友病為最常見(jiàn)的血友病，國(guó)外報(bào)道的患病率高達(dá)I %?3%。所以，檢測(cè)血液中馮維勒布蘭德因子的含量至關(guān)重要，能夠提供對(duì)于上述疾病診斷和治療的關(guān)鍵性參考數(shù)據(jù)。
[0003]此外，隨著近年來(lái)科研的發(fā)展，馮維勒布蘭德因子的一些其他功能逐漸被人們所了解。它在血管生成，平滑肌細(xì)胞的增殖，癌細(xì)胞的擴(kuò)散，以及免疫過(guò)程中都具有一定的調(diào)控作用。因此，它在一些心血管疾病，癌癥，肝病和免疫疾病中可以被用作生物標(biāo)記物來(lái)加以研究和使用?？傊?，檢測(cè)血液中馮維勒布蘭德因子的含量不僅在與止血和血栓形成過(guò)程有關(guān)的疾病，而且在其他很多疾病的診斷和治療中都有很高的價(jià)值。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中，檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的方法有多種，例如:馮維勒布蘭德因子多聚體法是將樣品用瓊脂膠來(lái)分離從而判斷多聚體是否正常；酶聯(lián)免疫法(ELISA)是用包被在塑料板表面的抗體與樣品中的抗原結(jié)合從而檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的含量；膠原蛋白法與酶聯(lián)免疫法類似，只不過(guò)包被在塑料板表面的不是抗體，而是膠原蛋白，此法利用馮維勒布蘭德因子和膠原蛋白可以天然高效結(jié)合的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行它的檢測(cè)。其中，酶聯(lián)免疫法主要用來(lái)檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的含量，而多聚體法和膠原蛋白法還可在一定程度上檢測(cè)其活性。
[0005]以上檢測(cè)方法各具特點(diǎn)，而它們共同的最大的局限是不能應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)分析檢測(cè)儀器如自動(dòng)血凝儀上，無(wú)法進(jìn)行大量快速且具有高度重復(fù)性的檢測(cè)。多聚體法需手工制備瓊脂膠，而整個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間也較長(zhǎng)。酶聯(lián)免疫法和膠原蛋白法由于包被在塑料板表面時(shí)效率的不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不好。
[0006]膠乳免疫比濁法具有操作簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)靈敏度高、特異、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在臨床應(yīng)用上得到廣泛認(rèn)可。
[0007]早期免疫分析通過(guò)觀察沉淀物形成，凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來(lái)分析，如免疫擴(kuò)散、免疫電泳、血凝試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合等。上世紀(jì)50年代末60年代初，利用AG-AB復(fù)合物形成使?jié)岫雀淖?，再用比濁?jì)來(lái)比濁，但因其敏感性差未被接受。至70年代初，開始有自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，但因其用的是激光為光源，固定波長(zhǎng)，靈敏度較低，而且時(shí)間一般要2-3小時(shí)，很難滿足臨床需要。70年代未，速率比濁計(jì)的出現(xiàn)，使抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)在幾十秒內(nèi)出結(jié)果，可以說(shuō)是免疫化學(xué)測(cè)定的革命性的發(fā)展。
[0008]隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，免疫化學(xué)納入臨床化學(xué)檢驗(yàn)范疇。免疫濁度測(cè)定的基本原理是:抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過(guò)量時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可計(jì)算出受檢物的含量。
[0009]免疫濁度測(cè)定法按照儀器設(shè)計(jì)的不同可以分為兩種，即比濁儀測(cè)定(turbidimetermeasure)和散射比池儀測(cè)定(nephelomitermeasure)。比池儀測(cè)定是測(cè)量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰減，其讀數(shù)以吸光度A表示。A反映了入射光與透射光的比率。散射比濁儀測(cè)定是測(cè)量入射光遇到質(zhì)點(diǎn)(復(fù)合物)后呈一定角度散射的光量，該散射光經(jīng)放大后以散射值表示。
[0010]經(jīng)典的比濁試驗(yàn)有4個(gè)缺點(diǎn)無(wú)法克服，即操作繁瑣、敏感度低(10?100 Ug /ml)、時(shí)間長(zhǎng)和難以自動(dòng)化。根據(jù)抗原與抗體能在液體內(nèi)快速結(jié)合的原理，70年代出現(xiàn)了微量免疫沉淀測(cè)定法，即膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(PETIA)和免疫散射濁度測(cè)定法。這2種技術(shù)皆已常規(guī)用于臨床體液蛋白的檢測(cè)，并已創(chuàng)造出了多種自動(dòng)化儀器。
[0011]一、傳統(tǒng)免疫透射比濁法
[0012]當(dāng)光線通過(guò)一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測(cè)定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早在1959年Schultre和Schuick等報(bào)道應(yīng)用于血楽;蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物，導(dǎo)致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測(cè)定，一般采用抗體對(duì)抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透射比濁法。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)測(cè)定復(fù)合物形成量的多少對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。
[0013]由于免疫復(fù)合物的形成有時(shí)限變化，當(dāng)抗原抗體相遇后立即結(jié)合成小復(fù)合物(〈19S)，幾分鐘到幾小時(shí)才形成可見(jiàn)的復(fù)合物(>19S)。作為快速比濁測(cè)定，這種速度太慢，加入聚合劑(或促聚劑)可加速大的免疫復(fù)合物形成。目前促聚劑多用聚乙二醇(MW6000 ?8000)，濃度約為 4%。
[0014]濁度測(cè)定亦有其弱點(diǎn)。其一是抗原或抗體量大大過(guò)剩時(shí)易出現(xiàn)可溶性復(fù)合物，造成測(cè)定誤差，測(cè)定單克隆蛋白時(shí)這種更易出現(xiàn)；其二是應(yīng)維持反應(yīng)管中抗體蛋白量始終過(guò)剩，這個(gè)值要預(yù)先測(cè)定，使儀器的測(cè)定范圍在低于生理范圍到高于正常范圍之間；其三是受血脂的影響，尤其是低稀釋度時(shí)，脂蛋白的小顆?？尚纬蓾岫龋箿y(cè)定值假性升高。
[0015]二、膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法[0016]在上述比濁法中，少量的小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長(zhǎng)時(shí)間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。于是發(fā)展了現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于生化分析儀的膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法(PETIA):以多克隆抗體為基礎(chǔ)的改良免疫比濁分析法，利用基因工程方法將抗體與膠乳顆粒結(jié)合，當(dāng)抗原抗體相結(jié)合時(shí)便形成了抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，增強(qiáng)了反應(yīng)吸光度，反應(yīng)液在一定波長(zhǎng)處比濁，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液比較，計(jì)算標(biāo)本中抗原的含量。利用生化分析儀進(jìn)行比濁測(cè)定，整個(gè)分析過(guò)程只需幾分鐘，該方法與傳統(tǒng)免疫比濁法比較其靈敏度更高。
[0017]在抗原抗體特異性反應(yīng)時(shí)，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。無(wú)論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發(fā)現(xiàn)只有在兩者分子比例合適時(shí)才出現(xiàn)最強(qiáng)的反應(yīng)。以沉淀反應(yīng)為例，若向一排試管中入一定量的抗體，然后依次向各管中加入遞增量的相應(yīng)可溶性抗原，根據(jù)所形成的沉淀物及抗原抗體的比例關(guān)系可繪制出反應(yīng)曲線(如圖1所示)。從圖中可見(jiàn)，曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶(zone of equivalence)。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，沉淀物形成快而多。其中有一支反應(yīng)最快，沉淀物形成最多，上清液中幾乎無(wú)游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比(optimal ratio)。在等價(jià)帶前后分別為抗體過(guò)剩則無(wú)沉淀物形成，這種現(xiàn)象稱為帶現(xiàn)象(zone phenomenon)。出現(xiàn)在抗體過(guò)量時(shí)，稱為前帶(prozone),出現(xiàn)在抗原過(guò)剩時(shí),稱為后帶(postzone)具體見(jiàn)圖1o
[0018]但現(xiàn)有技術(shù)中，應(yīng)用膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法來(lái)檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑盒具有一定缺陷。主要是檢測(cè)的線性范圍較小，給檢測(cè)過(guò)程帶來(lái)很多不便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑盒，以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)馮維勒布蘭德因子，且具有很高的靈敏度和可靠的重復(fù)性，并且可應(yīng)用在自動(dòng)化分析儀器上。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0021]一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，該試劑為應(yīng)用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的檢測(cè)試劑，由試劑I和試劑2組成；其中試劑I為抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑為抗馮維勒布蘭德因子與膠乳顆粒結(jié)合而成的抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；試劑2為應(yīng)用液。
[0022]優(yōu)選地，該試劑還進(jìn)一步包括馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)曲線；馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應(yīng)緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)曲線為馮維勒布蘭德因子在人體內(nèi)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023]優(yōu)選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過(guò)將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經(jīng)二步反應(yīng)后形成共價(jià)鍵而得到；所述二步反應(yīng)包括:第一步將膠乳顆粒先與結(jié)合劑反應(yīng)，第二步再將膠乳顆粒與抗馮維勒布蘭德因子抗體反應(yīng)。而現(xiàn)有技術(shù)中均是采用一步反應(yīng)則是將膠乳顆粒和結(jié)合劑以及抗馮維勒布蘭德因子抗體同時(shí)在一起反應(yīng)。
[0024]更優(yōu)選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過(guò)將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經(jīng)二步反應(yīng)后形成共價(jià)鍵而得到；首先由將膠乳顆粒的羧基與結(jié)合劑在弱酸性下反應(yīng)成膠乳顆粒-結(jié)合劑中間體，再將膠乳顆粒-結(jié)合劑中間體在弱堿性下與抗馮維勒布蘭德因子抗體氨基反應(yīng)制得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳試劑。而現(xiàn)有技術(shù)中均是采用一步反應(yīng)則是將膠乳顆粒和結(jié)合劑以及抗馮維勒布蘭德因子抗體同時(shí)在一起反應(yīng)，該反應(yīng)難進(jìn)行且產(chǎn)率低。而本發(fā)明提供的二步反應(yīng)解決了本領(lǐng)域中膠乳顆粒與抗馮維勒布蘭德因子抗體難以反應(yīng)成膠乳抗體顆粒這一難題，且反應(yīng)產(chǎn)率高，易于操作，而且產(chǎn)物更加穩(wěn)定均一。
[0025]更優(yōu)選地，膠乳顆粒選自苯乙烯膠乳顆粒，最佳為經(jīng)羧基修飾的苯乙烯乳膠顆粒。
[0026]更優(yōu)選地，膠乳顆粒的粒徑為200?lOOOnm。
[0027]更優(yōu)選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑通過(guò)將膠乳顆粒懸浮于活化緩沖液中與結(jié)合劑反應(yīng)后，再轉(zhuǎn)入結(jié)合緩沖液中加入抗馮維勒布蘭德因子抗體進(jìn)行二步反應(yīng)形成共價(jià)鍵而得。
[0028]更優(yōu)選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑通過(guò)將膠乳顆粒懸浮于活化緩沖液中與結(jié)合劑反應(yīng)后，再轉(zhuǎn)入結(jié)合緩沖液中加入抗馮維勒布蘭德因子抗體進(jìn)行二步反應(yīng)，再加入含有封閉劑的滅活液中反應(yīng)后加入保存緩存液去除未經(jīng)反應(yīng)的膠乳顆粒而得。
[0029]更優(yōu)選地，活化緩沖液選自甘氨酸緩沖液或磷酸緩沖液，最佳為濃度為0.05M的KH2PO4，其pH為4.5。其酸性的pH是為了保證羧基處于羧基配位穩(wěn)定狀態(tài)，更有利于二步反應(yīng)的進(jìn)行。
[0030]更優(yōu)選地,結(jié)合劑選自濃度為0.1?5%的碳二亞胺,最佳為I %碳二亞胺；用于與膠乳顆粒的羧基形成中間體，進(jìn)而與抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基進(jìn)行反應(yīng)形成共價(jià)鍵。
[0031]更優(yōu)選地，結(jié)合緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷緩沖液或硼酸緩沖液，最佳為0.2M硼酸緩沖液，且pH為8.5 ;其弱堿性的pH是為了保證氨基處于氨基配位穩(wěn)定狀態(tài)，將更有利于二步反應(yīng)的進(jìn)行。
[0032]更優(yōu)選地，抗馮維勒布蘭德因子抗體選自羊抗、鼠抗或兔抗馮維勒布蘭德因子抗體。
[0033]更優(yōu)選地，封閉劑選自血清白蛋白或卵清蛋白，濃度為0.1%?5%，最佳為1%牛血清白蛋白；封閉劑用于吸附在未結(jié)合抗體的膠乳顆粒表面，而降低檢測(cè)過(guò)程中的非特異性反應(yīng)。
[0034]更優(yōu)選地，滅活液選自乙醇胺或甘氨酸，濃度為5?20mM，最佳為IOmM甘氨酸；用于中和反應(yīng)中過(guò)量的活性中間體。
[0035]更優(yōu)選地，保存緩沖液選自甘氨酸緩沖液，硼酸緩沖液或磷酸緩沖液，最佳由濃度為0.1M pH8.0甘氨酸，濃度分別為0.2%疊氮鈉、0.2%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20組成。
[0036]優(yōu)選地，應(yīng)用液按質(zhì)量百分比由表面活性劑0.05%?0.5 %、防腐劑0.05%?I %、高分子加速劑0.01 %?5 %、和濃度為0.1 %?10 %的氯化鈉組成，上述各組分的質(zhì)量百分比之和為100%。
[0037]更優(yōu)選地，表面活性劑選自吐溫-20或Triton-XlOO，最佳為吐溫-20 ;防腐劑選自Proclin300或疊氮鈉，最佳為疊氮鈉，高分子加速劑選自牛血清白蛋白或卵清蛋白，緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽或甘氨酸，最佳為三羥甲基氨基甲烷。
[0038]優(yōu)選地，含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應(yīng)緩沖液選自PBS緩沖液、Hepes緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液或氯化銨緩沖液中的一種或以上組合物；反應(yīng)緩沖液優(yōu)選為PBS緩沖液、Hepes緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或以上組合物。
[0039]更優(yōu)選地，反應(yīng)緩沖液的濃度為20?200mM。
[0040]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑的應(yīng)用，即將上述任一用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑作為檢測(cè)試劑用于制備馮維勒布蘭德因子檢測(cè)試劑盒，試劑盒其包括盒體和上述任一檢測(cè)試劑的試劑瓶。
[0041]優(yōu)選地，試劑瓶放置與盒體內(nèi)。
[0042]本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑的制備方法，包括以下步驟:
[0043]步驟a)制備抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳:將抗馮維勒布蘭德因子抗體與膠乳顆粒經(jīng)二步反應(yīng)后交聯(lián)成抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳；
[0044]步驟b)制備應(yīng)用液或稀釋液。
[0045]優(yōu)選地，步驟a)的具體操作如下:將膠乳顆粒用純凈水清洗后懸浮于活化緩沖液中；加入結(jié)合劑在溫度小于50°C下攪拌反應(yīng)，從而活化膠乳顆粒；再加入抗馮維勒布蘭德因子抗體在結(jié)合緩沖液中在溫度小于50度下攪拌反應(yīng)；再懸浮于含有封閉劑的滅活液中反應(yīng)，經(jīng)清洗后懸浮于保存緩沖液中，得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳懸液，置于4°C環(huán)境放置。
[0046]更優(yōu)選地，步驟a)中攪拌反應(yīng)溫度優(yōu)選為室溫，最佳為18?25V。
[0047]更優(yōu)選地，步驟a)中加入結(jié)合劑后攪拌反應(yīng)時(shí)間為10?30分鐘，最佳為15分鐘；
[0048]更優(yōu)選地，步驟a)中在結(jié)合緩沖液中攪拌反應(yīng)時(shí)間為0.5?6小時(shí)，優(yōu)選為I?2小時(shí)，最佳為2小時(shí)。
[0049]更優(yōu)選地,步驟a)中懸浮于含有封閉劑的滅活液中反應(yīng)I?3小時(shí),最佳為I小時(shí)。
[0050]優(yōu)選地，步驟b)制備應(yīng)用液是將表面活性劑、防腐劑、高分子加速劑、氯化鈉和緩沖劑一并完全溶解于水中，制得應(yīng)用液。
[0051]更優(yōu)選地，步驟b)的具體操作如下:將緩沖劑用鹽酸調(diào)節(jié)至pH值為8.0,再加入表面活性劑、防腐劑、高分子加速劑和氯化鈉。
[0052]更優(yōu)選地，步驟b)中應(yīng)用液pH值為7.4?8.0，最佳為8.0 ;表面活性劑所占的質(zhì)量百分比為0.05 %?0.5 %，最佳為0.05%，防腐劑所占的質(zhì)量百分比為0.05 %?I %，最佳為0.2 %，高分子加速劑所占的質(zhì)量百分比為0.0I %?5 %，最佳為0.2 %;氯化鈉所占的質(zhì)量百分比為0.1%?10%，最佳為1%，緩沖劑的質(zhì)量百分比為10?IOOmM,最佳為50mM。
[0053]優(yōu)選地，在未提供馮維勒布蘭德因子在人體內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提下，該制備方法還包括步驟c)配制馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品。
[0054]更優(yōu)選地，步驟c)中選用馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品，使用試劑2，即應(yīng)用液，進(jìn)行系列稀釋:S7:40 μ g / ml, S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5 μ g / ml, S3:2.5 μ g /ml, S2:1 μ g / ml, S1:0.5 μ g / ml, SO:應(yīng)用液，分裝即可。[0055]更優(yōu)選地，在步驟c)中，馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品可選用商品化高純度馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品。
[0056]更優(yōu)選地，步驟c)中分裝可采用0.5ml /瓶分裝。
[0057]本發(fā)明亦提供了采用該檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的顆粒增強(qiáng)免疫透射比濁試劑盒在生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)的具體條件:
[0058]在生化分析儀上設(shè)定參數(shù):
[0059]反應(yīng)溫度:37°C ;
[0060]分析方法:2點(diǎn)終點(diǎn)法；
[0061]主波長(zhǎng):570nm,副波長(zhǎng):800nm(可不用)。
[0062]選擇多點(diǎn)定標(biāo)后，由儀器自動(dòng)完成定標(biāo)，然后進(jìn)行常規(guī)血漿樣本的馮維勒布蘭德因子檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)儀器自動(dòng)換算直接以Ug / ml為單位報(bào)告數(shù)值。在使用不同的自動(dòng)檢測(cè)儀(血凝分析儀或生化分析儀)時(shí)，具體參數(shù)應(yīng)根據(jù)儀器不同進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。
[0063]本發(fā)明首創(chuàng)的將目前逐漸得到廣泛的應(yīng)用的顆粒增強(qiáng)免疫透射比濁法應(yīng)用到馮維勒布蘭德因子的檢測(cè)中。上述檢測(cè)試劑的檢測(cè)原理為把交聯(lián)了抗體的膠乳顆粒與被檢測(cè)血漿樣品混合，血漿中含有的多價(jià)馮維勒布蘭德因子會(huì)因與抗體的結(jié)合而導(dǎo)致膠乳顆粒的聚集。引起的聚集則會(huì)引起樣品的渾濁和吸光度的變化，其吸光度與馮維勒布蘭德因子的濃度成正比，與同樣處理的校準(zhǔn)液比較，可由吸光度推算計(jì)算樣本中馮維勒布蘭德因子濃度。本發(fā)明采用顆粒增強(qiáng)免疫透射比濁法來(lái)檢測(cè)馮維勒布蘭德因子；可以避免傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法中抗原和抗體的結(jié)合反應(yīng)是在固相條件下(塑料板反應(yīng)孔)進(jìn)行的，二者之一被固定而無(wú)法自由移動(dòng)；而實(shí)現(xiàn)抗體和膠乳的反應(yīng)是在液相條件下進(jìn)行，反應(yīng)迅速?gòu)氐?，更加接近自然狀態(tài)，通過(guò)顆粒增強(qiáng)的方式，放大了抗原抗體反應(yīng)，彌補(bǔ)了普通透射比濁法靈敏度不高的不足，同時(shí)又繼承了透射比濁法穩(wěn)定性好、方便快速的優(yōu)點(diǎn)，克服ELISA和RIA方法操作復(fù)雜、重復(fù)性不好等的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)人血馮維勒布蘭德因子在生化儀上大批量快速檢測(cè)血馮維勒布蘭德因子水平。
[0064]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的且具有以下幾個(gè)方面的顯著優(yōu)點(diǎn):(I)操作簡(jiǎn)單；(2)靈敏度較高；(3)不易受人為操作和外界因素干擾，檢測(cè)穩(wěn)定性和重復(fù)性好，能較真實(shí)地反映被測(cè)物質(zhì)的含量；(4)能利用生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，適于臨床推廣應(yīng)用；相比較多聚體法、酶聯(lián)免疫法和膠原蛋白法，本發(fā)明可以應(yīng)用在自動(dòng)血凝儀上，并且具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高和重復(fù)性好的特點(diǎn)。因此，本發(fā)明可用來(lái)進(jìn)行大量和快速的臨床體外檢測(cè)，有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0065]圖1為現(xiàn)有技術(shù)中膠乳顆粒免疫增強(qiáng)透射比濁法的反應(yīng)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0066]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)完整的說(shuō)明。如無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)施例中所用試劑或儀器均為市售產(chǎn)品，并按照其說(shuō)明書操作使用。
[0067]實(shí)施例1
[0068]a)試劑I的制備[0069]試劑I為將表面含有羧基基團(tuán)的膠乳顆粒在結(jié)合劑作用下與抗體的氨基基團(tuán)反應(yīng)而得抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；具體制備方法如下:
[0070]配制0.05M KH2P04pH4.5的活化緩沖液，取粒徑為500nm的羧基修飾的膠乳顆粒用純凈水清洗三遍后懸浮于IOml活化緩沖液中，膠乳顆粒終濃度質(zhì)量體積百分比以g / ml計(jì)為I %。活化緩沖液的酸性PH是為了保證羧基處于羧基配位穩(wěn)定狀態(tài)，這有利于反應(yīng)的進(jìn)行。
[0071]再新鮮配制2%碳二亞胺，取IOml加入等體積膠乳顆粒中，在室溫下(18_25°C )攪拌反應(yīng)15分鐘；從而活化膠乳顆粒。
[0072]配制0.2M硼酸緩沖液pH8.5的結(jié)合緩沖液；用純凈水清洗三遍活化的膠乳顆粒，懸浮于IOml結(jié)合緩沖液中；然后加入等體積的鼠抗馮維勒布蘭德因子單克隆抗體，在結(jié)合緩沖液中在室溫(18-25°C)下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，完成二步反應(yīng)。結(jié)合緩沖液的弱堿性pH是為了保證氨基處于氨基配位穩(wěn)定狀態(tài)，這有利于反應(yīng)的進(jìn)行。
[0073]用純凈水清洗三遍膠乳顆粒后懸浮于含有封閉劑的滅活液中反應(yīng)I小時(shí)；其中的封閉劑為1%牛血清白蛋白，是為了吸附在未結(jié)合抗體的膠乳顆粒表面，而降低檢測(cè)過(guò)程中的非特異性反應(yīng)；滅活液為IOmM甘氨酸，是為了中和掉反應(yīng)中過(guò)量的活性中間體。保存緩沖液為0.1M甘氨酸pH8.0,0.2%疊氮鈉，0.2%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20。清洗后懸浮于保存緩沖液中。
[0074]b)試劑2的制備
[0075]試劑2為應(yīng)用液，其制備方法為:三羥甲基氨基甲烷(Tris)濃度為50mM，用鹽酸調(diào)節(jié)后PH值為8.0。再加入如下成分，其終濃度分別為:氯化鈉1%，疊氮鈉0.2%，牛血清白蛋白0.2%和吐溫-200.05%。
[0076]c)配置馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品，使用應(yīng)用液進(jìn)行系列稀釋:S7:40μ g / ml，S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5 μ g / ml, S3:2.5 μ g / ml, S2:1 μ g / ml, S1:0.5 μ g /ml, SO:應(yīng)用液。
[0077]檢測(cè)所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)。
[0078]實(shí)施例2
[0079]本實(shí)施例與實(shí)施例1的差別僅在于所述膠乳顆粒的粒徑為lOOOnm，其他操作及配比與實(shí)施例1 一致。
[0080]檢測(cè)所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)。
[0081]試劑盒的特異性、靈敏度及線性范圍的檢測(cè)
[0082]1.在自動(dòng)檢測(cè)儀上的檢測(cè)操作程序，具體如下:
[0083](I)新鮮抽取的靜脈血按9:1的比例與枸櫞酸抗凝液混勻后離心，分離得到血漿；
[0084](2)在自動(dòng)檢測(cè)儀上設(shè)定參數(shù):反應(yīng)溫度37°C ;分析方法:2點(diǎn)終點(diǎn)法；主波長(zhǎng):570nm，副波長(zhǎng):800nm;樣品量/試劑I /試劑2:20 μ I / 100 μ I / 100 μ I;反應(yīng)方向:上升;
[0085](3)選用馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品，使用應(yīng)用液進(jìn)行系列稀釋:S7:40μ g / ml,S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5μ g / ml, S3:2.5μ g / ml, S2:1 μ g / ml, SI:
0.5μ g / ml, SO:應(yīng)用液。[0086](4)在自動(dòng)檢測(cè)儀中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，試劑I和試劑2(標(biāo)準(zhǔn)品/試劑I /試劑2:20 ill / IOOiU / IOOu I)并啟始反應(yīng)。自動(dòng)檢測(cè)儀將自動(dòng)測(cè)量吸光度并制作“濃度-吸光度”標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0087](5)取待測(cè)血漿樣品，按上述方法測(cè)量吸光度。自動(dòng)檢測(cè)儀將依照“濃度-吸光度”標(biāo)準(zhǔn)曲線將結(jié)果經(jīng)自動(dòng)換算直接以Ug / ml為單位報(bào)告樣本的馮維勒布蘭德因子數(shù)值。
[0088](6)在使用不同的自動(dòng)檢測(cè)儀(血凝分析儀或生化分析儀)時(shí)，具體參數(shù)應(yīng)根據(jù)儀器不同進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。
[0089]2.試劑盒特異性的檢測(cè)
[0090]表1檢測(cè)馮維勒布蘭德因子含量方法特異性
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑為應(yīng)用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的檢測(cè)試劑，由試劑I和試劑2組成，其中試劑I為抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑為抗馮維勒布蘭德因子與膠乳顆粒結(jié)合而成的抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；試劑2為應(yīng)用液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑還包括馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述馮維勒布蘭德因子標(biāo)準(zhǔn)品為含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應(yīng)緩沖液；標(biāo)準(zhǔn)曲線為馮維勒布蘭德因子在人體內(nèi)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過(guò)將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經(jīng)二步反應(yīng)后形成共價(jià)鍵而得到；所述二步反應(yīng)包括:第一步將膠乳顆粒先與結(jié)合劑反應(yīng)，第二步再將膠乳顆粒與抗馮維勒布蘭德因子抗體反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過(guò)將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經(jīng)二步反應(yīng)后形成共價(jià)鍵而得到；首先由將膠乳顆粒的羧基與結(jié)合劑在弱酸性下反應(yīng)成膠乳顆粒-結(jié)合劑中間體，再將膠乳顆粒-結(jié)合劑中間體在弱堿性下與抗馮維勒布蘭德因子抗體氨基反應(yīng)制得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述膠乳顆粒為苯乙烯膠乳顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述膠乳顆粒的粒徑為200?lOOOnm。
7.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑，其特征在于:所述結(jié)合劑選自濃度為0.1?5%的碳二亞胺。
8.一種制備權(quán)利要求1?7任一所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟a)制備抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳:將抗馮維勒布蘭德因子抗體與膠 乳顆粒經(jīng)二步反應(yīng)后交聯(lián)成抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳； 步驟b)制備應(yīng)用液或稀釋液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑的方法，其特征在于，步驟a)的具體操作如下:將膠乳顆粒用純凈水清洗后懸浮于活化緩沖液中；加入結(jié)合劑在溫度小于50°C下攪拌反應(yīng)，從而活化膠乳顆粒；再加入抗馮維勒布蘭德因子抗體在結(jié)合緩沖液中在溫度小于50度下攪拌反應(yīng)；再懸浮于含有封閉劑的滅活液中反應(yīng)，經(jīng)清洗后懸浮于保存緩沖液中，得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳懸液，置于4°C環(huán)境放置。
10.一種制備權(quán)利要求1?7任一所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑的應(yīng)用，其特征在于:將權(quán)利要求1?7任一所述的用于檢測(cè)馮維勒布蘭德因子的試劑作為檢測(cè)試劑用于制備馮維勒布蘭德因子檢測(cè)產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103760358SQ201310562657
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】趙鐵銘, 李小林, 王枕亞, 喜慶 申請(qǐng)人:趙鐵銘, 喜慶